Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni

Riepilogo

Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l'etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l'identificazione delle cellule staminali di conservazione dell'etichetta mediante immunocitochimica; e l'isolamento da parte della FACS.

Abstract

Nonostante i progressi nella ricerca sulle cellule staminali adulte, l'identificazione e l'isolamento delle cellule staminali dai campioni di tessuto rimane una sfida importante. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti con vincoli di nicchia nei tessuti adulti, entrano nel ciclo cellulare in coltura tridimensionale senza ancora (3D) e subiscono sia la divisione cellulare simmetrica che asimmetrica, dando origine sia al gambo che al progenitore Cellule. Questi ultimi proliferano rapidamente e sono la popolazione cellulare principale in varie fasi dell'impegno di lignaggio, formando sferoidi eterogenei. Utilizzando le normali cellule epiteliali della prostata umana primaria (HPrEC), è stato sviluppato un saggio basato su sferoide di ritenzione di etichette che consente l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali che lo sferoide operino a una risoluzione a singola cellula.

HPrEC o linee cellulari sono bidimensionali (2D) coltivate con BrdU per 10 giorni per consentire la sua incorporazione nel DNA di tutte le cellule che si dividono, comprese le cellule staminali auto-rinnovanti. Wash out inizia al momento del trasferimento alla coltura 3D per 5 giorni, durante i quali le cellule staminali si auto-rinnovano attraverso la divisione asimmetrica e avviano la formazione di sferoidi. Mentre le cellule staminali figlie relativamente quiescenti conservano il DNA parentale etichettato da BrdU, i progenitori della figlia proliferano rapidamente, perdendo l'etichetta BrdU. BrdU può essere sostituito con CFSE o Far Red pro-dyes, che consentono l'isolamento delle cellule staminali vive da FACS. Le caratteristiche delle cellule staminali sono confermate dalla formazione in vitro sferoide, dai saggi di rigenerazione dei tessuti in vivo e dalla documentazione delle loro divisioni cellulari simmetriche/asimmetriche. Le cellule staminali isolate che conservano l'etichetta possono essere rigorosamente interrogate da studi molecolari e biologici a valle, tra cui RNA-seq, ChIP-seq, cattura a singola cellula, attività metabolica, profilazione del proteoma, immunocitochimica, formazione di organiidi e rigenerazione dei tessuti in vivo. È importante sottolineare che questo approccio di isolamento delle cellule staminali funzionali privo di marcatori identifica le cellule staminali provenienti da campioni di cancro freschi e linee cellulari tumorali di più organi, suggerendo un'ampia applicabilità. Può essere usato per identificare biomarcatori cellulari simili a tumori, prodotti farmaceutici di schermata che prendono di mira le cellule staminali tumorali e scoprire nuovi bersagli terapeutici nei tumori.

Introduzione

La ghiandola prostatica umana contiene epitelio luminoso con funzione secretoria e cellule basali sottostanti insieme a un insolito componente delle cellule neuroendocrine. Le cellule epiteliali, in questo caso, sono generate da una rara popolazione di cellule staminali prostate che sono relativamente quiescenti in vivo e fungono da sistema di riparazione per mantenere l'omeostasi ghiandolare per tutta la vita¹. Nonostante molti progressi, l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali prostata rimane una sfida importante nel settore. I biomarcatori delle cellule staminali staminali, comprese le metodologie basate su marcatori di superficie cellulare combinate con la citometria di flusso, sono comunemente utilizzati per la ricerca sulle cellule staminali^2,3,4. Tuttavia, i risultati per l'arricchimento e l'isolamento variano ampiamente in funzione delle combinazioni di marcatori e della specificità degli anticorpi^5,6, sollevando domande sull'identità delle cellule isolate. Un altro approccio ampiamente utilizzato per l'arricchimento delle cellule staminali è la coltura tridimensionale (3D) degli sferoidi^2,3^,4. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti in vivo con vincoli di nicchia, subiscono la divisione cellulare nella coltura a matrice 3D (sia simmetrica che asimmetrica), generando cellule staminali e progenitrici che si riproducono rapidamente verso l'impegno di lignaggio^7,8. Gli sferoidi formati sono una miscela eterogenea contenente sia cellule staminali che cellule progenitrici in varie fasi dell'impegno di lignaggio, comprese le cellule progenitrici in fase iniziale e tardiva. Pertanto, i saggi che utilizzano gli interi sferoidi non sono esclusivi per le cellule staminali, rendendo inconcludente l'identificazione di proprietà uniche delle cellule staminali. Pertanto, è fondamentale creare saggi per identificare e separare le cellule staminali della prostata dai loro progenitori figlia. A tal fine, l'obiettivo dell'attuale protocollo è quello di stabilire un sistema di analisi che consenta l'identificazione e l'isolamento efficienti delle cellule staminali dai tessuti prostata umani seguiti da una solida analisi a valle delle loro funzioni biologiche.

La ritenzione a lungo termine dell'etichetta a 5-bromo-2'-deoxyuridina (BrdU) è ampiamente utilizzata per la tracciabilità in vivo e in vitro delle cellule staminali in base al loro tempo di raddoppio prolungato^9,10. L'attuale approccio per l'identificazione delle cellule staminali prostate e l'isolamento descritto qui si basa sulle loro caratteristiche quiescenti relative e sulle proprietà di ritenzione delle etichette all'interno di una popolazione epiteliale mista. Inoltre, sulla base dell'ipotesi del DNA del filamento immortale, solo le cellule staminali possono subire la divisione asimmetrica delle cellule. La cellula staminale rappresenta la cellula figlia che contiene il DNA parentale più vecchio, mentre la cellula progenitore, che è una cellula figlia impegnata, riceve il DNA appena sintetizzato. L'esclusiva proprietà delle cellule staminali descritta in precedenza viene sfruttata per eseguire l'etichettatura BrdU nelle cellule staminali parentali nelle colture primarie e quindi tenere traccia della loro etichetta dopo il lavaggio di BrdU al momento del trasferimento nella coltura di sferidi senza ancoraggio 3D. Mentre la maggior parte delle cellule epiteliali prostate primarie conservaun fenotipo basale e di transito amplificando nella coltura 2D, c'è anche una rara popolazione di cellule staminali multipotenti che ricostituiscono e mantengono l'omeostasi epiteliale come evidenziato dalla formazione di sferoidi o organoidi completamente differenziati con corrispondenti mezzi di coltura al momento del trasferimento^aisistemi 3D³,¹². Nel nostro protocollo attuale, utilizzando sferoidi prostata HPrEC o brdU, CFSE o far Red ritenzioni seguite dallo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), identifichiamo cellule staminali che conservano l'etichetta negli sferoidi a livello di singola cellula¹³.

È importante sottolineare che abbiamo ulteriormente confermato le caratteristiche delle cellule staminali delle cellule che conservano l'etichetta all'interno di sferoidi in fase iniziale rispetto alle cellule progenitrici con impegno di lignaggio. Questi includono la divisione asimmetrica delle cellule staminali, la capacità di formazione di sferoidi in vitro e la capacità di rigenerazione dei tessuti in vivo, elevata attività dell'autofagia, biogenesi ribosomiana aumentata e diminuzione dell'attività metabolica. Successivamente, è stata eseguita l'analisi RNAseq. Sono stati osservati geni espressi in modo differenziale nelle cellule sferoidi che conservano l'etichetta che possono servire come nuovi biomarcatori per le cellule staminali della prostata umana. Questo approccio basato su sferoidi, che mantiene l'etichetta può applicarsi ai campioni di cancro per identificare in modo simile un piccolo numero di cellule staminali tumorali, fornendo così opportunità traslazionali per gestire le popolazioni resistenti terapeutiche¹³. Di seguito è presentato il saggio di ritenzione delle etichette basato sulla prostasfera che utilizza come esempio le cellule epiteliali primarie umane (HPrEC).

Protocollo

Tutte le manipolazioni delle cellule e i preparati dei supporti devono essere eseguiti con tecnica asettica in un mobile di sicurezza biologica di classe II (BSC).

1. Cultura e manutenzione delle cellule HPrEC in 2D

1. Cappotto 100 mm piatti di coltura con 2 mL di 2,5 g / cm² soluzione fibronectina durante la notte a temperatura ambiente (RT). Aspirare la soluzione e lasciare asciugare i piatti della coltura nel BSC per 45 min.
2. Aggiungere 9 mL del mezzo di crescita delle cellule epiteliali prostata (ad esempio, PrEGM) in un piatto di coltura di 100 mm rivestito di fibronectina e mantenere il piatto caldo in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi.
3. Scongelare una fiala di cellule HPrEC congelate (2 x 10⁵/mL) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e risospendere nuovamente le cellule in 10 mL di mezzo caldo.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
5. Risospendere accuratamente le cellule in 1 mL del mezzo di coltura calda. Le cellule di semi convogliando 1 mL della sospensione cellulare direttamente nel piatto di coltura da 100 mm rivestito di fibronectina che contiene 9 mL del mezzo preriscaldato (il volume totale di medie e le cellule è di 10 mL). Rimettere i piatti della coltura in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi.
6. Rifornire il mezzo ogni 2 giorni. Per farlo, aspirare con attenzione tutti i supporti e aggiungere 10 mL di fresco mezzo caldo.
7. In circa 5 giorni, assicurarsi che le culture siano confluenti del 70-80%. Eseguire la digestione ezimatica incubando le cellule con 3 mL di 0,05% Trypsin/EDTA a 37 s per 5 min.
8. Interrompere la digestione aggiungendo 3 mL di PBS caldo contenente 10% FBS.
9. Raccogliere le cellule in un tubo di centrifuga di 50 mL e centrifugare a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
10. Risospendere il pellet cellulare in 30 mL di mezzo caldo e dispensare equamente in tre nuovi piatti di coltura 100 mm rivestiti di fibronetina per il passaggio successivo.
    NOTA: Le cellule HPrEC primarie possono essere passaggiate da 3 a 5x senza alterare le loro caratteristiche epiteliali basali. Il fenotipo epiteliale è testato da espressioni di marcatori di cellule epiteliali basali citokeratina 5 e p63 con saggi immunocitochimico/immunofluorescente (ICC/IF).

2. Etichettatura HPrEC con BrdU, CFSE o Far Red pro-dyes

NOTA: le celle possono procedere al passaggio 2.1 o al passaggio 2.2 seguito dal trasferimento alla coltura della prostasfera 3D, come descritto nel passaggio 3.1.

1. Etichettatura singola delle cellule con BrdU
   1. Coltura 2 x 10⁵ cellule HPrEC in piatti di coltura da 100 mm ricoperti di fibronectina con 10 mL di mezzo caldo contenente 1 M di BrdU. Coltura le cellule per 10 giorni (oltre due passaggi) per garantire l'etichettatura di tutte le cellule comprese le cellule staminali della prostata e le cellule progenitrici.
   2. Dopo 10 giorni, aspirare con cura il mezzo PrEGM contenente il BrdU e lavare le cellule con 5 mL di PBS caldo. Ripetere 1x.
   3. Eseguire la digestione ezimatica utilizzando 0.05% trypsin/EDTA come descritto nei passaggi 1.7–1.8. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
   4. Risospendere le celle pellettate etichettate con etichetta con BrdU (5 x 10⁴) in 500 - L di matrice/mezzo di membrana sotterranea a freddo ghiaccio (1:1) e trasferirle in una coltura prostasfera 3D (descritta al punto 3.1) per 5 giorni per consentire il lavaggio di BrdU durante la formazione dello sferoide (6 cicli cellulari).
2. Doppia etichettatura delle celle con BrdU e CFSE o Far Red pro-dyes
   1. Se si desidera la co-etichettatura per le cellule vive, prendere le cellule pre-etichettate incubate con BrdU per 10 giorni dal passo 2.1 e co-etichetta con 5 M CFSE o Far Red cellule fluorescenti pro-coloranti per 30 min. Eseguire la co-etichetta al giorno 10.
   2. Aspirare con attenzione il mezzo contenente BrdU e CFSE o Far Red pro-dyes. Lavare le celle con 5 mL di PBS caldo. Ripetere il lavaggio 1x.
   3. Eseguire la digestione ezimatica utilizzando 0.05% trypsin/EDTA come descritto nei passaggi 1.7–1.8. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Rimuovere e scartare il supernatante.
   4. Risospendere le cellule co-etichettate (5 x 10⁴) in 500 - L di matrice/mezzo della membrana del seminterrato a freddo ghiaccio (1:1) e trasferirle a una coltura prostasfera 3D (descritta nella sezione 3.1) per 5 giorni per consentire BrdU e CFSE o Far Red washout durante la formazione degli sferoidi (6 cicli cellulari).
3. Eseguire il rilevamento delle cellule che mantengono l'etichetta nelle sfere (Giorno 5 prostaspheres) come descritto nei passaggi 4.1, 4.2, 4.3 o 5.
   NOTA: Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) e Far Red sono pro-dyes fluorescenti di lunga durata e sono ben conservati all'interno delle cellule etichettate. L'elanda intracellulare nelle cellule vive fenda i gruppi di acetati che attivano le molecole fluorescenti verdi o rosse che ora sono imperte in membrana.

3. Formazione della prostasfera nel sistema di coltura della membrana del seminterrato 3D

1. Coltura prostasphere nel sistema di matrice della membrana del seminterrato 3D
   1. Scongelare la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi durante la notte e tenere il ghiaccio prima dell'uso.
   2. Aggiungere delicatamente 1 mL di membrana del seminterrato ghiacciato in un volume uguale del mezzo di coltura ghiacciato. Mescolare lentamente pipetting su e giù, evitando bolle.
      NOTA: Pre-coat il fondo di 12 pozzi di piastra ben coltura con 100 l di questa soluzione. Questo ridurrà al minimo il numero di cellule che rientrano nella matrice e crescono come un monostrato.
   3. Risospendere 5 x 10⁴ cellule HPrEC nella matrice/mezzo di coltura del cutesto a freddo (1:1) in un volume totale di 500 .
   4. Pipetta 500 -L di questa soluzione cellulare intorno al bordo inferiore di ogni pozzo.
   5. Swirl la piastra per distribuire uniformemente la miscela intorno al bordo del pozzo. Collocare la piastra in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 30 min per consentire alla matrice di solidificare.
   6. Una volta che la matrice si è solidificata, coprire con 1 mL di mezzo di coltura calda per pozzo. Non disturbare l'anello della matrice della membrana del seminterrato. Puntare con attenzione la punta della pipetta e dispensare il mezzo di coltura al centro del pozzo.
      NOTA: Il mezzo di coltura deve essere riscaldato a 37 gradi centigradi quando viene aggiunto alla matrice della membrana del seminterrato solidificata. La matrice della membrana seminterrato perderà la sua integrità e si dissolverà quando esposto a supporti freddi / freddi.
   7. Rifornire medio ogni 2 giorni. Aspirare con cura 500 dollari di mezzo esaurito e aggiungere 500 l di fresco mezzo di coltura calda.
   8. Monitorare la formazione e la crescita della prostasfera per 5-7 giorni utilizzando un microscopio invertito.
2. Passaggio di prostasfere
   1. Raccogliere prostasfere dalla matrice aspirando con attenzione il maggior numero di supporti possibile. Evitare di disturbare o raccogliere pezzi galleggianti della matrice solidificata.
   2. Aggiungere 1 mL di soluzione dispase (matrice di membrana seminterrato: dispase a un rapporto 1:2). Mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte.
   3. Incubare le piastre di coltura in un incubatore di CO₂ a 37 gradi centigradi per 30 min.
   4. Scattare immagini di prostasfere che si trovano nella parte inferiore del piatto di coltura per il conteggio dei numeri di sfera e le misure delle dimensioni.
   5. Raccogliere la miscela di sfere in un tubo da 15 mL. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 5 min a RT per pellet le sfere. Aspirare e scartare il supernatante.
   6. Disperdere le sfere in singole cellule digerindo con 500 , l'una di caldo 0,05% di metapsina/EDTA e trasferendo la sospensione in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
   7. Incubare il tubo di microcentrifuga in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 5 min.
   8. Interrompere l'azione trypsin con 500 l di PBS caldo contenente 10% FBS. Passare la sospensione della sfera digerita attraverso una siringa da 1 mL con un ago 5x da 26 G per dissociare le sfere in singole cellule.
   9. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 5 min per pellet le cellule a RT. Aspirate il supernatante e scartare.
   10. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di coltura calda e filtrare attraverso un colino di nylon di dimensioni pori da 40 m.
   11. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min per pellet le cellule a RT. Aspirate e scartare il sovratalmente.
   12. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di ghiaccio freddo (1:1) matrice di membrana seminterrato -proietto e sottocultura in una matrice di membrana seminterrato 3D per il secondo passaggio della prostasfera.

4. Identificazione delle cellule staminali prostate che conservano BrdU mediante colorazione immunofluorescente

1. Supera le prostasfere attaccate seguite dalla colorazione immunofluorescente (IF) per l'imaging 2D delle cellule staminali prostate.
   1. Prostasfere di raccolta per digestione dispasia come descritto nei passaggi da 3.2.1– 3.2.3. Centrifugare le sfere in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL a 500 x g per 5 min. Scartare il supernatante.
   2. Risospendere le sfere in 1 mL di mezzo di coltura calda.
   3. Incubare 50 prostasfere per pozzo in 8 vetrini da camera in 200 gradi l di mezzo di coltura in un'incubatrice di 37 gradi centigradi durante la notte per consentire l'attaccamento e la crescita delle sfere.
   4. Il secondo giorno, aspirare e scartare il mezzo di coltura. Lavare le sfere obsolete con 200 l di PBS per 5 min.
   5. Fissare le sfere in 200 /l/po di metanolo ghiacciato a -20 gradi centigradi per 20 min.
   6. Lavare le sfere con 200 gradi/pozzetto di PBS per 5 min. Ripetere 2x.
   7. Sfere di lavaggio acido con 200 l/l/po' di 2N HCl per 30 min a RT.
   8. Lavare le sfere con 200 gradi/pozzetto di PBS per 5 min. Ripetere 3x.
   9. Aggiungere 100 l di soluzione di blocco contenente 5% siero di capra normale in PBST (PBS con 0,25% Triton X-100) e incubare per 30 min a RT.
   10. Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere 100 ll di PBST contenente il 2% di siero di capra normale e l'anticorpo BrdU del topo primario (1:200) a ciascun pozzo e incubare in una scatola umidificata a 4 gradi durante la notte.
       NOTA: L'anticorpo Mouse IgG viene utilizzato come controllo negativo.
   11. Aspirare e rimuovere la soluzione anticorpale primaria. Lavare le sfere con 200 gradi l di PBS per 5 min. Ripetere 2x.
   12. Aggiungete 100 ll l di PBST contenente il 2% di siero di capra normale e l'anticorpo secondario di Capra anti-tono Alexa Fluor 488 (1: 500) a ciascun pozzo e incubate RT al buio per 2 h.
   13. Aspirare e rimuovere la soluzione anticorpale secondaria. Lavare le sfere con 200 gradi l di PBS per 5 min. Ripetere 3x.
   14. Montate gli scivoli con 25-40 dollari di supporto di montaggio acquoso contenente DAPI.
   15. Ottenere immagini delle sfere/cellule colorate con un microscopio fluorescente e una fotocamera digitale a colori.
2. Colore SE intero di prostasfere per l'imaging 3D delle cellule staminali prostate
   NOTA: per l'intera colorazione IF, le prostasfere vengono maneggiate utilizzando tubi di microcentrifuga da 1,5 mL.
   1. Raccogliere le prostasfere per digestione dispasi, come descritto nei passaggi da 3.2.1 a 3.2.3. Centrifugare le sfere in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare.
   2. Risospendere e fissare le sfere con 1 mL del 4% di paraformaldeide a RT per 20 m. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare.
   3. Lavare le sfere risuspendendo il pellet in 1 mL di PBS. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 1x.
   4. L'acido lava le sfere rispendendo il pellet in 1 mL di 2N HCl per 30 min.
   5. Lavare le sfere con 1 mL di PBS per 5 min e centrifugare a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 3x.
   6. Risospendere le sfere da 15 a 30 dollari in una soluzione di blocco di 100 gradi contenente il siero di capra normale del 5% in PBST (PBS con 0,25% Triton X-100) e incubare per 30 min a RT.
   7. Per rimuovere la soluzione di blocco, centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate e scartare il sovrinterrato.
   8. Risospendere le sfere in 100 gradi l di PBST contenenti il 2% di siero di capra normale e l'anticorpo BrdU anti-umano del topo primario (1:200) e incubare a 4 gradi durante la notte.
   9. Lavare le sfere risuspendendo il pellet in 1 mL di PBS. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 1x.
   10. Risospendere le sfere in 100 o L di PBST contenente il 2% di siero di capra normale e anticorpi secondari antito-topi Alexa Fluor 488 (1:1,000) e incubare a RT per 2 h.
   11. Lavare le sfere risuspendendo il pellet in 1 mL di PBS. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 1x.
   12. Risospendere le sfere in 30-50 gradi di supporto di montaggio acquoso contenente DAPI. Per evitare di appiattire le sfere, dispensele in un piatto ben creato da un piatto di coltura non rivestito di 35 mm con un fondo di vetro di copertura. Quindi aggiungere una coverslip al piatto di coltura, coprendo il pozzo.
   13. Acquisire immagini a sfera intera : stack utilizzando un microscopio confocale fluorescente a luce trasmessa. Convertire queste immagini a z in immagini 3D utilizzando un software di imaging con funzionalità di disegno a mano libera.
       NOTA: L'anticorpo Mouse IgG viene utilizzato come controllo negativo.
3. Analisi delle celle accoppiate (protocollo di 4 giorni)
   1. Cultura le sfere etichettate BrdU al giorno 5.
   2. Giorno 1: Raccogliere le sfere da una matrice di membrana seminterrato con 1 mL di digestione dispasi. Disperselo in singole cellule di 500 , luna di metapsina/EDTA calda dello 0,05% in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL, come descritto nei passaggi da 3,2,1 a 3,2,11.
   3. Risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di coltura calda.
   4. Piastrare le singole cellule disperse (300-500 dollari per pozzo) in 8 vetrini da camera e coltura in 200 : l/pozzo medio di coltura durante la notte per consentire l'attaccamento.
   5. Giorno 2: Cambiare il mezzo di coltura con 200-L di 2-M cytochalasin D nel mezzo di coltura e incubare durante la notte a 37 s C per consentire una divisione cellulare che si ferma alla tarda metafase in anaphase.
   6. Giorno 3-4: Aspirare e scartare il mezzo. Fissare le cellule in 200 l/po di metanolo ghiacciato a -20 gradi centigradi per 20 min. Seguire il protocollo di immunostaining per BrdU come descritto nei passaggi 4.1.5–4.1.14.
   7. Scatta immagini di cellule accoppiate con un microscopio a fluorescenza. Assicurarsi che la distanza tra i due nuclei sia inferiore a 30 m. In base alla ritenzione brdU, identificare le cellule staminali accoppiate come sottoposte a divisione cellulare simmetrica o asimmetrica.
      NOTA: le cellule staminali della prostata che mantengono l'etichetta BrdU sono sottoposte a divisione simmetrica per dare origine a due cellule staminali figlie che conservano la stessa quantità di BrdU, mentre le cellule staminali staminali in fase di divisione asimmetrica danno origine a una cellula staminale figlia che conserva tutte le altra cellula progenitrice figlia che ha perso l'etichetta BrdU.

5. Isolamento delle cellule staminali della prostata che conservano l'etichetta CFSE mediante lo smistamento FACS

1. Giorno 5: Raccogliere il giorno 5 giorno etichettato CFSE prostaspheres che crescono in 6 piastre di coltura ben in cultura 3D sostituendo il mezzo con 2 mL di dispase (matrice di membrana seminterrato: dispase a un rapporto 1:2). Pipette su e giù più volte per mescolare accuratamente.
2. Incubare le piastre in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 30 min per digerire la matrice.
3. Raccogliere la miscela di sfera in un tubo di centrifuga di 15 mL. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate il supernatante e scartare.
4. Risospendere il pellet sfere a 500 , l of warm 0.05% trypsin/EDTA, e trasferire in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml.
5. Incubare le sfere in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 5 min.
6. Passare le sfere attraverso una siringa da 1 mL con un ago da 26 G 5x per dissociare completamente le sfere in singole cellule.
7. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
8. Risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di coltura calda che contiene 1 g/mL di propidio iodide (PI) per macchiare le cellule morte. Incubare per 1 min a RT.
9. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
10. Risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di coltura calda. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
11. Risospendere le cellule in 500 gradi di coltura calda e raccogliere le cellule in 5 mL di tubi rotondi rotondi filtrandoli attraverso i cappuccini a colicella di 35 m.
12. Eseguire l'analisi delle cellule prostasfera con etichetta CFSE disperse da tripina con un analizzatore FACS a canale singolo.
13. Gate le sottopopolazioni di parti CFSE^Hi, CFSE^Med, e CFSE^Lo cellule. Utilizzare i controlli negativi e positivi per il gating.
    NOTA: La presenza di cellule staminali della prostata in formato CFSE ordinate in FACS (vedi Hu et al.¹³) può essere confermata dalla microscopia a fluorescenza verde e dalla loro maggiore dimensione delle cellule rispetto alle cellule non conservanti. Questa dimensione più grande delle cellule è una proprietà delle cellule staminali prostata rispetto alle popolazioni di cellule progenitrici. Questo può essere diverso con altri tipi di tessuto.

Risultati

Le normali cellule epiteliali umane primarie vengono inserite in piatti di coltura rivestiti di fibronectina e la crescita cellulare è mantenuta nellacoltura2D ( Figura 1a). Al momento del trasferimento nella coltura 3D con una matrice di membrana seminterrato, le cellule epiteliali differenziate si esauriscono lentamente. Solo le cellule staminali della prostata possono sopravvivere in una coltura senza ancora e formare sferoidi in 5 giorni (Figura 1

Discussione

La citometria di flusso con più marcatori di superficie di cellule staminali è un approccio comunemente usato per la ricerca sulle cellule staminali, nonostante manchi sia di specificità che di selettività^1,5,6. Mentre la formazione di sferoidi in un sistema di coltura 3D è un altro metodo utile per arricchire la popolazione di cellule staminali rare da cellule epiteliali primarie, tra cui HPrEC, gli sferoidi risultanti son...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
1 mL tuberculin syringes	Bectin Dickinson	BD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishes	Corning/Falcon	353003
12-well culture plate	Corning/Falcon	353043
15 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352097
22 x 22 mm coverslips, sq	Corning	284522	For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslips	Corning	2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needle	Monoject	1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottom	MatTek Corp	P35G-0-10-C	Glass bottom No. 0, uncoated, irradiated
40 µm pore nylon cell strainer	Corning	352340
5% CO2 culture incubator, 37 °C	Forma
50 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap	Corning	352235	35 µm nylon mesh
6-well culture plates	Corning	353046
8-well chamber slides	Millipore Sigma	PEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories	H-1200	A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine)	Sigma-Aldrich	B5002	1 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf
Centrifuge for 15 mL tubes	Beckman Coulter		Allegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)	Thermo Fisher Scientific	C34554	5 mM stock solution in DMSO
cytochalasin D	Thermo Fisher Scientific	PHZ1063
Dispase 1U/mL	StemCell Technologies	07923
FACS CellSorter MoFlo XDP	Beckman Coulter	s
Far-Red pro-dye	Thermo Fisher	C34564	5 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital camera	Carl Zeiss		Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)	Lifeline Cell Technology	FC-0038	Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red free	Corning	356239
Methanol	Corning	A452-4
Mouse anti-BrdU antibody	Cell Signaling	5292S
Mouse IgG antibody (negative control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)	Lifeline Cell Technology	LL-0041
Propidium Iodide (PI)	R & D Systems	5135/10	10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope