JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه المقالة طريقة زرع لتطعيم الخلايا الظهارية الثديية الفئران المانحة في وسادة الدهون البيضاء interscapular من الحيوانات المتلقية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لفحص آثار المضيف و/ أو المانحة على تطور ظهارة الثديية ويلغي الحاجة إلى المقاصة المسبقة ، وبالتالي توسيع نطاق فائدة هذه التقنية.

Abstract

في وقت مبكر من 1970s، وقد نجح الباحثون في زرع الخلايا الظهارية الثديية في وسادة الدهون البيضاء الانتربوبي للفئران. تطعيم ظهارة الثديية باستخدام تقنيات زرع يستفيد من البيئة الهرمونية التي يوفرها المضيف القوارض المراهق. هذه الدراسات هي مناسبة بشكل مثالي لاستكشاف تأثير التلاعب البيولوجي المختلفة على تطور الغدة الثديية وتشريح العديد من جوانب بيولوجيا الغدة الثديية. ميزة شائعة ، ولكنها محدودة ، هي أن الخلايا الظهارية المزروعة تتأثر بشدة بستروما المحيطة وتفوقت عليها ظهارة ذاتية . للاستفادة من الأنسجة الثديية الأصلية ، يجب مسح وسادة الدهون البيضاء البطنية لإزالة ظهارة الثديية المضيفة قبل عملية الزرع. عقبة رئيسية عند استخدام نموذج الكائن الحي الفئران هو أن إزالة شجرة الثدييالنامية في الفئران بعد الفطم ليست فعالة. عند زرعها في منصات الدهون خالية من الغدة، يمكن للخلايا الظهارية المانحة إعادة ملء وسادة الدهون المضيف ة التي تم تطهيرها وتشكيل غدة ثديية وظيفية. لوحة الدهون الانفية هي موقع بديل لهذه الطعوم. ميزة رئيسية هي أنه يفتقر إلى هياكل القناة بعد يوفر ستروما العادية التي هي ضرورية لتعزيز النمو الظهاري ويمكن الوصول إليها بسهولة في الفئران. ميزة رئيسية أخرى لهذه التقنية هي أنها طفيفة التوغل ، لأنها تقضي على الحاجة إلى التكي وإزالة شجرة الثديية الذاتية المتنامية. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي وسادة الدهون الانفيسية على وعاء دموي وسطي يمكن استخدامه لفصل مواقع التطعيم. لأن الغدد الذاتية لا تزال سليمة، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للدراسات التي تقارن الغدة الثديية الذاتية إلى الغدة المزروعة. تصف هذه الورقة طريقة زرع الخلايا الظهارية الثديية في وسادة الدهون البيضاء الانجيلية للفئران.

Introduction

تطور الغدة الثديية بعد الولادة ومورفوجينيسيس القناة هي عمليات تتأثر إلى حد كبير بالإشارات الهرمونية في بداية سن البلوغ. في الفئران والجرذان ، والكائنات الحية النموذجية الشائعة الاستخدام لبيولوجيا الغدة الثديية ، تبدأ هذه العملية حوالي 3 أسابيع من العمر ، حيث يؤدي الانتشار السريع والتمايز إلى تكوين parenchyma الناضجة. يمكن أن تخضع الغدة الثديية الناضجة لجولات عديدة من التوسع والتمدد ، وهي خاصية تخضع للتحقيق منذ أوائلالقرن العشرين. في سياق الانتشار المفرط وتطور السرطان ، تم تطوير تقنيات زرع الغدة الثديية في 1950s1، وعززتها المنهجية الكمية التي ساهم بها غولد وآخرون في عام 19772،3،4. وقد ساهم صقل تقنية زرع في القوارض في التقدم الكبير في فهم علم الأحياء الغدة الثديية العادية التي لا تزال تستخدم على نطاق واسع لدراسة تأثير العلاجات المختلفة والتلاعب الجيني على تطور الغدة الثديية الطبيعية وحالات المرض.

وقد تم إنشاء العديد من الفرضيات واختبارها في وقت لاحق باستخدام زرع الغدة الثديية ، التي وصفها لأول مرة DeOme وآخرون في عام 19591. وأظهرت التجارب عبر عدة عقود ميل الأنسجة القناةية التي تم استئصالها من الغدد الثديية المانحة لإعادة ملء كامل لوحة الدهون5،6،7 وأشار إلى أن عنصرا حاسما من نمو الغدة الثديية يكمن في هذه الهياكل الظهارية. أظهرت الدراسات اللاحقة في الفئران أن خلية جذعية مامية واحدة يمكن أن تعيد ملء وسادة الدهون التي تم تطهيرها وساهمت في اكتشاف ذرية واحدة مشتركة من الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والإنارة8،9،10. وتمشيا مع هذه الاستنتاجات، فقد اقترح أن زرع يزيد من مجموعة من الخلايا مع تعدد المجالات إعادة إسكان المحتملة نتيجة لللدونة، مما يسمح للخلايا المطعمة لتنمو الغدة الثديية وظيفية7،10،11،12،13. الأهم من ذلك ، فإن استخدام تقنيات زرع في القوارض يتغلب على قيود التشوهات الناجمة عن زراعة الخلايا14 وغالبا ما يوفر نتائج في غضون أسابيع فقط.

في حين أن الإجراء كان يوصف في الأصل في سياق آفات ما قبل النيوبلاستيك في الفئران ، سرعان ما تم توسيعه ليشمل الفئران واستخدمه بالتزامن مع علاج المواد المسرطنة لإنشاء التعدد كمقياس لقابلية السرطان15، ولكن شعبية تقنيات الزرع تابعت تطوير الأدوات الوراثية لكل نوع. على الرغم من أن دراسات الماوس التي تتضمن زرع ساهمت في العديد من النتائج الانتقالية، فإن parenchyma من الغدة الثديية الفئران يشبه الإنسان بشكل وثيق أكثر16،17 ويقدم مزايا متميزة لدراسة مستقبلات هرمون الاستروجين إيجابية (ER +) سرطان الثدي. الأورام الثديية غير قابلة للاختزال في كلا النوعين ، ولكنها تختلف من حيث حساسية الهرمونات وملامح التعبير الجيني. والفرق الأساسي هو أن الأورام الثديية الفئران التعبير عن وتعتمد على وظيفة مستقبلات هرمون المبيض والغدة النخامية، وهي، الإستروجين والبروجستيرون (PR)، على غرار النوع الفرعي من سرطان الثدي البشري. في الواقع ، تم استخدام زرع الخلايا الظهارية الثديية ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، لدراسة المتغيرات الجينية المشاركة في سرطان الثدي وتحديد الاستقلال ية الخلوية للآثار على الخلايا الظهارية الثديية18.

بالإضافة إلى بيولوجيا الورم ، يعرض ظهارة القناة في الغدة الثديية العادية للفئران مستوى أعلى من التفريع وتحيط به طبقة أكثر سمكًا من ستروما من الماوس. أهمية ستروما موثقة بشكل جيد في دراسات زرع الظهارية الثديية. يجب أن تتفاعل ظهارة مامماري مع ستروما الدهنية ، ومن الناحية المثالية mesenchyme الخاصة بها ، للخضوع لمورفوجينيسيس مميزة19،20. تطعيم الأنسجة في الغدة الثديية المتلقي يوفر بيئة مثالية; ومع ذلك ، فإن وجود ظهارة ذاتية يمكن أن تتداخل مع النتائج. يتم إجراء تطهير الغدة الثديية من ظهارة الذاتية عادة في عينات زرع الفئران ويتطلب الختان الجراحي للأنسجة الثديية الذاتية و / أو إزالة الحلمة1،21،22. على الرغم من أن ذلك ممكن، فإن التبذّر المُسبّل في الفئران بعد الفطم ليس على نطاق واسع، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم فعالية إزالة شجرة الثديية المتنامية في الفئران بعد الفطمة. منذ وقد ثبت أن مناطق الأنسجة الدهنية في مكان آخر من الجسم يمكن أن تدعم نمو ظهارة الثديية المزروعة21،23،24، يمكن تجنب عملية المقاصة بسهولة في الفئران عن طريق تطعيم الأنسجة في وسادة الدهون البيضاء interscapular.

تتضمن طريقة الزرع الموصوفة في هذه الورقة حقن عضويات الغدة الثديية المنفصلة بشكل أنزيمي (أجزاء من ظهارة القناة الثديية وأنواع الخلايا الأخرى القادرة على النشوء المورفولوجي) أو الخلايا أحادية التشتت في وسادة الدهون البينية في سلالات الفطرية أو الأيجينية أو الجينية للفئران المختبرية2. لأن وسادة الدهون الانفيسية عادة ما تخلو من الأنسجة الثديية، فإنه يوفر بيئة مناسبة لمواقع زرع متعددة دون الحاجة إلى مسح الظهارة الذاتية مسبقا. ونتيجة لذلك ، فإن الغدد الثديية الذاتية البطنية للالحيوان المضيف لا تخضع للتلاعب الجراحي ، وتتطور بشكل طبيعي ، ولا يمكن أن تتداخل مع تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الغدد الثديية السليمة للمقارنة لتقييم آثار المضيف مقابل المانحين على تطور ظهارة الثدي والورم18،25. على الرغم من أن إعادة انتشار الغدة الثديية من خلية جذعية واحدة متاحة للفئران ، إلا أنها لم يتم تطويرها بعد للفئران ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم توفر الأجسام المضادة لاختيار الخلايا الجذعية الثديية للفئران25،26،27. على الرغم من هذا ، يمكن إجراء زرع الخلايا الظهارية الثديية أحادية التشتت لتحديد إمكانات إعادة التهوم بنجاح ، وسوف تتطور هذه الخلايا بشكل طبيعي عند تطعيمها في الإطار المناسب2،3،4. في حين أن الأجهزة الاعضاء جيدة لأغراض عديدة ، فإن الخلايا أحادية التشتت مطلوبة للتطبيقات الكمية ، على سبيل المثال ، لتحديد عدد الخلايا الظهارية الثديية اللازمة لبدء السرطان بعد العلاج الإشعاعي المؤين28 أو لمقارنة خصائص التدفق المختار بالخلايا الثديية المختارة بالخلايا الظهارية29.

حتى الآن ، فإن الإجراء الموصوف هنا هو أقوى طريقة لإجراء زراعة الغدة الثديية في الفئران مع هدف عام هو دراسة تطور الغدة الثديية والآليات الكامنة وراء تطور سرطان الثدي. في كثير من الأحيان ، يتعرض المتبرع و / أو الحيوانات المتلقية لمتغيرات مختلفة قبل أو أثناء أو بعد زرع الظهارية. ومن الأمثلة على ذلك دراسات الجينات الواحدة التي تنطوي على التسرطن الكيميائي30، الإشعاع28،31،32، التلاعب الجيني للجينوم المضيف / المانح18، والتلاعب الهرموني12. ومن المزايا الرئيسية للانفصام الأنزيمي الموصوف في هذا البروتوكول هو فرصة لعزل الاعضاء الظهارية أو الخلايا أحادية التشتت للتجارب التكميلية التي تنطوي على تدفق الخلايا، والثقافة ثلاثية الأبعاد، وتحرير الجينات، وأكثر من ذلك. وستشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية التلاعب الإضافي بالأنسجة المانحة و/أو المضيفة بالهندسة الوراثية. على سبيل المثال، يمكن تغيير الخلايا المانحة وراثيًا في أي مكان جينومي مختار باستخدام نظام تحرير الجينات CRISPR-Cas9. وبالمثل، يمكن أيضا ً تغيير الفئران المتلقية وراثياً لدراسة التفاعل بين العوامل الوراثية المهندسة للمانحين والمتلقين.

Protocol

تم إيواء جميع الحيوانات وصيانتها في منشأة معتمدة من AAALAC ، وتمت الموافقة على التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC). يجب أن تكون الحيوانات للاستخدام في الزرع المتبادل سلالة أصيلة أو isogenic ، مع الوضع المتجانس المفضل أو متبدى للخلف لمدة 6 أجيال على الأقل.

1. حصاد المتبرعين الفئران مامماري الغدة ظهارة

  1. تحديد عدد الفئران المانحة اللازمة لزرع.
    ملاحظة: بشكل عام، يمكن لفأر متبرع واحد (4 أسابيع من العمر) أن يوفر خلايا كافية لزرعها في 4 الحيوانات المتلقية. بعض التطبيقات من هذا البروتوكول سوف تتطلب أعداد إضافية من الخلايا، ويمكن أن يكون هناك اختلافات سلالة محددة في إجمالي العائد.
  2. تسمية جميع اللوازم وضمان وضع يمكن الوصول إليها للجراح(الجدول 1).
  3. سجل وزن جسم كل أنثى من الفئران المانحة. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للتطفل بشكل كامل أو القتل الرحيم الفئران المانحة. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
  4. نقل الحيوان إلى الحقل الجراحي العقيم. وضع الحيوان على ظهره ورش كامل سطح البطن مع الإيثانول 70٪.
  5. جعل القوس، شق على شكل X، مما يسمح بالوصول إلى الغدد الثديية الصدرية والبطنية والابلية. تشريح جميع أنسجة الغدة الثديية من الفئران المانحة باستخدام مقص(الشكل 1). إزالة جميع الغدد الليمفاوية مرئية.
  6. استخراج الأنسجة الثديية باستخدام ملقط ووضعها في طبق 60 ملم المسمى على الجليد. أضف 500 ميكرولتر من وسائط DMEM/F12 الخالية من المصل إلى الطبق 60 مم. ضبط موضع أنسجة الغدة الثديية بحيث يبقى الرطب تماما.
  7. فرم الأنسجة الثديية بدقيقة باستخدام المقص. للقيام بذلك، وقطع الأنسجة إلى قطع 1-2 ملم3 في الحجم(الشكل 1C). الحفاظ على الغدة على الجليد حتى تم حصاد جميع الأنسجة المانحة (لا تتجاوز 60 دقيقة).
    ملاحظة: يمكن للموظفين الإضافيين أن ينموا الغدد الثديية وأن يعدوا محلول الكولاجين بالإضافة إلى ذلك بينما يمضي الجراح في عمليات استخراج الأنسجة.

2. استخراج أنسجة الدماغ من المتبرعين القتل الرحيم

  1. بدوره بعناية الجسم من الحيوان المانحة أكثر لوضعها في موقف عرضة. آمن بدبابيس. رش الرأس والظهر العلوي مع الإيثانول 70٪.
  2. تحديد موقع قاعدة الجمجمة وجعل شق تحت البثور القذالي. أدخل مقصًا حادًا أسفل الجلد واقطع الجلد بعيدًا عن الجمجمة، بما في ذلك جانبي الرأس.
  3. استخدام قطع العظام أو مقص قوي لقطع الجمجمة على طول خط الوسط، من القذالي إلى العظام الأمامية. الحفاظ على شفرة سطحية قدر الإمكان وزاوية إلى أعلى لمنع تدمير أنسجة الدماغ الكامنة.
  4. قشر العظام بعيدا باستخدام rongeurs أو ملقط قوية. أدخل الأداة الجانبية إلى المخيخ لكسر العظام على كلا الجانبين ، مما يعرض القناة السمعية العظمية. قطع الاتصالات إلى meninges.
  5. ارفع الدماغ برفق باستخدام ملقط منحني وناعم. وضع الدماغ على قطعة من احباط وتسجيل الوزن، ومن ثم نقل على الفور إلى أنبوب 15 مل مع كمية متساوية (ث:v) من وسائل الإعلام، وتخزينها على الجليد.
    1. اختيارياً، استخدم ملقط الطرف الدقيق لإزالة الغدة النخامية (الموجودة تحت الدماغ) للاستخدام الإضافي في إجراء الزرع، إذا لزم الأمر.
  6. استخدام المتجانس الميكانيكية لتعطيل الأنسجة. تجانس الدماغ لمدة 10-15 s على سرعة منخفضة. دع الخليط يُجلس على الثلج لمدة دقيقة واحدة على الأقل، ثم يتجانس مرة أخرى. التجانس يكفي عندما يكون الخليط النهائي خاليًا من القطع الكبيرة.
  7. تصفية التجانس عن طريق تمريرها من خلال مرشح 100 ميكرومتر. الحفاظ على filtrate على الجليد حتى الاستخدام (أقل من 4 ساعة).

3. هضم وتجهيز مستخلصات الغدة الثديية

  1. إذابة أو الكواشف الدافئة كما هو مبين(الجدول 1). اتبع الخطوات المناسبة لاستعادة الاعضاء أو الخلايا أحادية التشتت.
  2. إعداد 10 مل من وسائل الإعلام الهضم خالية من المصل (دون الكولاجين) لكل الحيوانات المانحة(ملف تكميلي 1).
    ملاحظة: يمكن تعديل حجم وسائط الهضم المستخدمة (تحجيمها لأعلى أو لأسفل) لاستيعاب الأنسجة المجمعة، إذا كان ذلك ممكنًا.
    1. للorganoids تخطي إلى 3.3.
    2. للخلايا أحادية التشتت، وإعداد خليط أحادي التشتت الطازجة والحل التعطيل(ملف تكميلي 2، ملف تكميلي 3)بالإضافة إلى وسائل الإعلام هضم الكولاجين خالية من المصل. انتقل إلى الخطوة 3.3.
  3. عندما يتم استخراج جميع الأنسجة الثديية من المتبرعين والمفروم، إضافة إنزيم الكولاجين إلى وسائل الإعلام الهضم الحارة (أو درجة حرارة الغرفة)(ملف تكميلي 1). مزيج عن طريق عكس.
  4. تمرير وسائط الهضم collagenase من خلال مرشح 20 ميكرون. الاستغناء 10 مل من وسائل الإعلام المصفاة في أنابيب 50 مل المسمى للهضم.
  5. استخدم نصيحة ماصة جديدة تبلغ 1000 ميكرولتر لكل عينة ونقل الأنسجة المانحة المفرومة من كل طبق 60 مم إلى أنبوب هضم الكولاجين. قطع 1 سم من نهاية تلميح 1000 ميكرولتر ووضعه يدويا على الجهاز قبل الاستخدام. مزيج بلطف الأنسجة المفرومة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 1-2 مرات.
    ملاحظة: إذا كان من الصعب على الأنسجة ماصة أثناء نقل, استخدام كمية صغيرة من وسائل الهضم collagenase من أنبوب 50 مل, ومن ثم نقله مرة أخرى.
  6. ضع العينات في الموضع الأفقي في حاضنة اهتزاز والسماح للعينات لهضم 1.5-2 ساعة في 37 درجة مئوية، 200-220 دورة في الدقيقة.
    1. للorganoids تخطي إلى 3.7.
    2. للخلايا أحادية التشتت إضافة DNase الأول (0.2 ميكروغرام / مل) إلى الخليط لآخر 10 دقيقة من الهضم. احتضان كما كان من قبل، مع اهتزاز قوية. انتقل إلى الخطوة 3.7.
  7. عندما يتم هضم الأنسجة بالكامل ، بيليه التعليق باستخدام الطرد المركزي البارد (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة في 1200 × ز (الشكل 1D).
    ملاحظة: احتفظ بالأنابيب على الجليد بين كل خطوة لزيادة قابلية الخلايا للحياة.
  8. تأكد من أن بيليه قد شكلت، ومن ثم صب بعناية قبالة طبقة supernatant والدهون. إعادة تعليق بلطف بيليه في 10 مل من وسائل الإعلام DMEM/F12 الطازجة.
  9. تدور لفترة وجيزة في 68 × ز لحوالي 10 s. يمكن زيادة طول الدوران (ولكن ليس السرعة) إذا لم يكن هناك فصل واضح للخلايا. فحص بصريا بيليه قبل المضي قدما(الشكل 1D).
  10. إزالة بعناية supernatant، وترك وراءه حجم صغير. انتقل إلى الخطوة التالية ، استنادًا إلى ما إذا كانت هناك حاجة إلى الخلايا الاعضاء أو الخلايا أحادية التشتت.
    ملاحظة من المهم أن تترك حجم صغير من وسائل الإعلام في أنبوب لأن بيليه سوف تكون فضفاضة جداً. سيتم تخفيف حجم الوسائط المتبقية من خلال خطوات الغسيل.
    1. بالنسبة للأعضاء، أضف حجم 10 مل أخرى من وسائط DMEM/F12 وكرر الغسيل/الدوران. بعد الغسيل الثاني، قم بإعادة تعليق الخلايا في حجم أصغر (1-2 مل) من وسائط DMEM/F12 للترشيح. انتقل إلى الخطوة 3.11.
    2. للخلايا أحادية التشتت، تذوب في 2 مل من HBSS درجة حرارة مسبقة مع 0.025٪ (ث / v) التربسين و 6.8 mM EDTA. هضم لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية. تعطيل فورا.
      1. إضافة 4 مل من DMEM/F12 مع FBS 10٪ لوقف تعطيل التربسين.
      2. قم بتدوير الخلايا عند 270 × ز لمدة 5 سنوات، ثم أعيد تعليقها في DMEM/F12 مع FBS بنسبة 10٪ مرة أخرى. انتقل إلى الخطوة 3.11 لتصفية الخلايا.
  11. تصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرون وضعت في أنبوب جديد 50 مل. قبل الرطب مصفاة عن طريق pipetting 1 مل من نفس الوسط قاعدة تستخدم لتعليق الخلايا، ومن ثم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح باستخدام ماصة لجمع شظايا القناة / organoids.
    ملاحظة: العائد التقريبي للظهارة المصفاة من أنسجة الغدة الثديية لفأر متبرع واحد عمره 4 أسابيع هو 1 × 106 خلايا.
    1. بالنسبة للأعضاء، تجاهل الفيرات. سوف تبقى الاعضاء الثديية داخل سلة مصفاة الخلية وسيتم القضاء على أصغر, الخلايا غير المرغوب فيها. عكس مصفاة الخلية على أنبوب جديد 50 مل، وشطف مع أي حجم اللازمة لجمع الخلايا. انتقل إلى الخطوة 3.12.
    2. بالنسبة للخلايا أحادية التشتت، تخلص من مصفاة الخلية والحفاظ على الفيلتر لأن الخلايا الظهارية الثديية ستمر عبر الفلتر، إلى جانب الخلايا المترفية والمناعية الأصغر. شطف الأنبوب الذي كان يستخدم للهضم / الطرد المركزي مع حجم آخر من DMEM/F12 مع FBS 10٪ وتمر من خلال مصفاة الخلية نفسها. بيليه الخلايا أحادية التشتت عن طريق الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 5 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 3.12.
      ملاحظة: الخلايا التي تم إعادة تعليقها جاهزة للتطبيقات اللاحقة.
  12. نبض تدور الحل وضمان تشكيل بيليه الخلية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. نبض تدور مرة أخرى، إذا لزم الأمر.
  13. إزالة بعناية supernatant. إعادة تعليق بيليه في حجم صغير (1000-2000 ميكرولتر من DMEM/F12) لتركيز الخلايا للعد.
  14. عد الخلايا ويخفف إذا لزم الأمر. إعادة تعليق العدد المطلوب من الخلايا للزرع في 20 ميكرولتر من وسائط DMEM/F12 لكل الحيوان. دائماً ما تبقي الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: عددالخلايا المانحة في نطاق 1 × 105 - 1 × 10 6 خلايا ستكون مطلوبة لكل موقع الكسب غير المشروع على أساس نقطة النهاية للدراسة. على سبيل المثال، غالبًا ما تتطلب تجارب التسرطن عددًا أكبر من الخلايا المزروعة، مقارنة بالتطبيقات الأخرى. يجب تحديد عدد الخلايا اللازمة تجريبيا لكل سلالة. استخدم الإجراء الموصوف في هذا البروتوكول 250,000 خلية مانحة في 20 ميكرولتر من الوسائط لكل موقع الكسب غير المشروع، قبل الاختلاط بتجانس الدماغ، كما هو موضح في الخطوة 3.16.
  15. إعداد أي aliquot (ليالي) من الخلايا اللازمة للتجارب الأخرى (على سبيل المثال، عزل FACS3،26،27،30،33).
    1. بالنسبة للأعضاء، انتقل إلى الخطوة 3.16.
    2. بالنسبة للخلايا أحادية التشتت، قم بتحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام تيبان أو تلطيخ أزرق الميثيلين، ثم تابع.
  16. إعداد دفعات واحدة من المواد المانحة لجميع المتلقين زرع. الجمع بين أحجام متساوية من تعليق الخلية (20 ميكرولتر) مع 50٪ من تجانس الدماغ (20 ميكرولتر) لكل موقع من مواقع الزرع.
    ملاحظة: سيتم حقن ما مجموعه 40 ميكرولتر لكل موقع في كل موقع، ولكن من المستحسن تضمين ما لا يقل عن 25٪ حجم إضافي للنفايات.
  17. الشروع فورا في زرع أو تجميد الخلايا لزرع في وقت لاحق (نقطة توقف محتملة).
    ملاحظة: لم يتم اختبار الخلايا المجمدة مع هذا البروتوكول وسوف تتطلب التحسين مقدما لتوليد مجموعة من الحيوانات لتجارب زرع. يوصى بشدة بزرع خلايا طازجة.

4. إجراء زرع (الفئران المتلقي 4-5 أسابيع من العمر)

  1. وزن كل الفئران المتلقي وحساب الجرعة الصحيحة من المسكنات المعتمدة التي سيتم استخدامها في الإجراء.
    ملاحظة: يمكن قياس أوزان الجسم حتى 24 ساعة قبل الإجراء. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لتقييد أو لفترة وجيزة للتطفل على كل الحيوان لمدة الحلاقة.
  2. اغسل المنطقة الجراحية على كل من الحيوانات باستخدام المقصات الكهربائية. تحديد قاعدة الجمجمة وبداية العمود الفقري. تقريبا ثلث الطريق أسفل العمود الفقري، ومثل 3 سم × 2 سم منطقة على الجزء العلوي من الصدر من الظهر.
    ملاحظة: يمكن أيضًا إجراء الحلاقة تحت التخدير في يوم الزرع ولكن يجب إجراؤها خارج الحقل المعقم. إعادة الجرذ إلى قفص المنزل حتى تكون هناك حاجة إليها.
  3. تحديد موقع جميع الإمدادات اللازمة للزرع(الجدول 1).
  4. تقييم نظام التخدير الحيواني المختبري قبل الاستخدام. قم بخلع أي سوائل واستبدل أي خزانات أو أجزاء مطلوبة. تأكد من أن خط الغاز إلى غرفة التخدير مفتوح وجميع الخطوط الطرفية مغلقة حتى التخدير isoflurane والأكسجين قد تتدفق بحرية إلى الحيوان بمجرد وضعه في الغرفة.
  5. منصات التدفئة الدافئة لدعم درجة حرارة الجسم من الحيوانات المتلقية.
  6. توليد الحقل المعقم الذي سيتم استخدامه للجراحة. ترتيب الإمدادات كما هو موضح في الجدول 1.
  7. إعطاء المسكنات قبل الجراحة للفئران المتلقية كما هو مبين في بروتوكول رعاية الحيوان المعتمد ة مؤسسيا.
  8. مسح المحاقن هاملتون مع وسائط DMEM/F12 المعقمة لمنع فقدان الخلايا. تأكد من أن الإبرة مؤمنة إلى جسم الحقنة ، وأدخل الإبرة في السائل ، واسحب المكبس مرة أخرى. التعبئة إلى الحد الأقصى لوحدة التخزين. اضغط على المكبس لأسفل وطرد محتويات في أنبوب جمع النفايات. كرر 3-5 مرات.
  9. تحميل الحجم الكامل للمواد المانحة (أعدت في الخطوة 3.16) في حقنة منفصلة لكل حالة (على سبيل المثال، السيطرة، المعالجة، البرية، خروج المغلوب، الخ). أدخل طرف الإبرة في السائل ، واسحب المكبس مرة أخرى والحفاظ على الإبرة تحت سطح الخليط مع انخفاض الحجم في الأنبوب.
    ملاحظة: قم بتضمين حجم إضافي بنسبة 10% على الأقل في كل حقنة. لا تتخلص من الخليط المتبقي أغلق الأنبوب وأبقه على الجليد في حالة الحاجة إلى المزيد.
  10. عكس الحقنة بعد تحميلها بالكامل واضغط على المكبس قليلا لإزالة فقاعات الهواء في غيض من الإبرة. انتقل إلى الخطوة التالية عندما يتم إعداد كل شيء.
    ملاحظة: تأكد من أن طرف الإبرة لا يمس أي سطح آخر، حتى داخل الحقل المعقم. من المفيد أن بقية الجسم من حقنة على وعاء صغير من الجليد لتعزيز صلاحية الخلايا.
  11. ضع الحيوان المتلقي في غرفة التخدير وشغّل الجهاز.
  12. عندما يكون الحيوان مسترخيًا تمامًا (لا يتفاعل مع التنصت على الحركة أو الحركة اللطيفة للغرفة) ، وجه التخدير إلى مخروط الأنف ونقل الحيوان إلى الحقل العقيم.
    ملاحظة: لا يتم تحمل مدة طويلة من التخدير جيد ًا من قبل الفئران. إكمال الإجراء لكل الحيوانات في 10 دقيقة أو أقل.
  13. وضع الحيوان في موقف عرضة (على معدته) بحيث يمكن الوصول إلى الجزء الخلفي من الرأس والعمود الفقري العلوي.
    ملاحظة: ضمان دعم الحرارة الكافية للللحيوانات في جميع الأوقات وتقييم بانتظام عمق التخدير باستخدام قرصة إصبع القدم شركة.
  14. اختياريا، تطبيق مرهم طبيب بيطري العيون لمنع جفاف العينين.
  15. تنظيف المنطقة الحليقة الطازجة لإزالة الشعر الزائد. استخدام حركة دائرية وتطبيق الإيثانول 70٪ (أو كاشف آخر، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية) على الجلد، تليها مطهر (مثل اليود)، وكرر. وضع منشفة الستائر على الحيوان حتى يتم كشف فقط المنطقة للمنطقة المنقضية.
  16. تأكد من أن الحيوان لا يستجيب للمحفزات العميقة مع قرصة إصبع القدم الثابتة ، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
  17. قم بعمل شق صغير (2 سم) بيني باستخدام شفرة جراحية حادة.
    ملاحظة: يجب أن يكون القطع سطحيًا ، حيث تقع وسادة الدهون تحت الجلد.
  18. تحديد موقع الأوعية الدموية المتوسطة للتوجيه(الشكل 2B).
  19. ارفع الجلد على جانب واحد من الشق باستخدام الملقط واحمله بعيدًا عن وسادة الدهون أثناء إجراء عملية الزرع(الشكل 2B). أدخل الإبرة في موقع الكسب غير المشروع.
    1. اختياريا، حرك طرف الإبرة داخل الأنسجة وخلق جيب صغير لجمع الخلايا. استخدام حركة صغيرة ومتكررة. لا تقم بإزالة الإبرة.
      ملاحظة: يوصى بهذه الخطوة لمستخدمي البروتوكول لأول مرة. توخي الحذر الشديد عند إنشاء جيب، كما الأنسجة لوحة الدهون الانفيسية حساسة جدا.
  20. حقن بعناية 40 ميكرولتر من خليط الخلية في أنسجة وسادة الدهون بينية. إزالة الإبرة ببطء.
  21. عقد الأنسجة في مكان والسماح للخلايا المزروعة لتسوية لمدة 3-5 s. استخدام زوج إضافي من ملقط, إذا لزم الأمر.
  22. أزل الإبرة. كرر إجراء الحقن (الخطوات 4.18-4.21) في الموقع الثاني للزرع.
    ملاحظة: يمكن حقن ظهارة من مجموعة واحدة من المانحين في نفس الجانب من وسادة الدهون في كل الحيوانات، أو الجوانب بالتناوب لمنع آثار دفعة من الهيمنة اليدوية للجراح.
  23. أغلق الجرح الجراحي باستخدام مقاطع الجروح أو الغرز، ثم توقف عن التخدير.
  24. توفير مسكن ما بعد الجراحة كما هو مبين في البروتوكول المعتمد مؤسسياً.
  25. نقل على الفور الحيوان إلى قفص الانتعاش مع دعم الحرارة. مراقبة لعلامات الضيق مثل النزيف من شق أو صعوبة في التنفس.
    ملاحظة: يجب أن يتعافى الحيوان بالكامل في غضون 5-10 دقيقة. الرجوع إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية لإعادة الحيوانات إلى المستعمرة والرصد بعد الجراحة بعد إجراءات البقاء على قيد الحياة.
  26. اختياريا، إجراء دراسات التسرطن في موقع الكسب غير المشروع (ق) عن طريق إعطاء المواد المسرطنة للفئران المتلقي3-4 أسابيع بعد زرع.
    ملاحظة: عادة، يتم تنفيذ التسرطن الثديي الفئران باستخدام علاج المواد المسرطنة الكيميائية في 50-57 يوما من العمر. هذا العلاج يملي عمر جراحة زرع (التي يجب أن تتم بين 29-36 يوما من العمر) لإتاحة الوقت الكافي للخلايا المطعمة لبدء نمو الغدة الثديية.

5- تقييم النمو الظهاري

  1. مراقبة دورة estrus من الفئران من خلال غسل المهبل اليومي وفحص علم الخلايا على شريحة المجهر. تبدأ 8-12 يوما قبل نقطة النهاية للدراسة. التضحية بجميع الفئران في نفس المرحلة. هذه خطوة اختيارية.
    ملاحظة: دورة estrus الفئران هو 4-5 أيام. السماح للالحيوان للذهاب من خلال 1-2 دورات كاملة سوف تسهل التفسير، كما يمكن استخدام الشرائح لافج من الدورات السابقة للمقارنة.
  2. جرذان زرع التضحية بعد 6-8 أسابيع من الزرع، حسب المبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: عادة ما يكون النمو يمكن اكتشافه بعد 3-6 أسابيع من الزرع، ولكن قد يتطلب الأمر وقتًا إضافيًا.
  3. وضع الحيوان في موقف عرضة وتنظيف الجسم مع الإيثانول 70٪. رفع الجلد مع ملقط وجعل شق على طول العمود الفقري لفضح وسادة الدهون interscapular. تشريح الجلد بعيدا عن الأنسجة حتى غالبية وسادة الدهون مرئية.
  4. تحديد الأوعية الدموية اللوسطية التي تفصل بين مواقع الكسب غير المشروع في وسادة الدهون الانفية. استئصال لوحة كاملة كقطعة واحدة من الأنسجة أو قطع على طول الأوعية الدموية وإزالة الجانبين بشكل فردي.
  5. ضع الأنسجة على شريحة مجهر مشحونة بشكل إيجابي لجبل كامل. استخدام 2 أزواج من ملقط حادة ونشر بلطف الأنسجة لاستعادة تشكيلها الأصلي على الشريحة.
    ملاحظة: أنسجة الفئران الثديية حساسة للغاية. حواف الأنسجة قد حليقة تحت نفسها. تعامل دائمًا بعناية وتماسك حتى يلتصق النسيج بالشريحة (بضع ثوانٍ).
  6. كامل جبل واحد على الأقل من الغدد الثديية البطن الذاتية الإنجة (مع الغدد الليمفاوية للتوجيه) للمقارنة.
  7. وضع الشرائح في الإيثانول 70٪ لمدة 7-10 أيام لإبطال الأنسجة. تجديد الإيثانول كلما لزم الأمر لضمان الأنسجة لا تجف.
  8. إعداد وصمة عار الشب كارمين ومعالجة الشرائح عندما تكون الأنسجة مبهمة بما فيه الكفاية. السماح للوصمة لتبرد قبل الاستخدام(ملف تكميلي 4).
    ملاحظة: يمكن إعداد البقعة حتى يوم واحد قبل خطوات التثبيت والإماهة. يمكن تخزين الحل عند 4 درجات مئوية ولديه إمكانات محدودة لإعادة الاستخدام.
  9. إصلاح الأنسجة عن طريق وضع الشرائح في 25٪ حمض الخليك الجليدي: 75٪ الإيثانول لمدة 60 دقيقة.
    1. إعادة ترطيب الأنسجة من خلال سلسلة من 3 النظافة في سلسلة من انخفاض تركيز الإيثانول: 70٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة، 50٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة و DH2O لمدة 5 دقيقة.
  10. وصمة عار مع الشب كارمين لمدة 4-8 أيام. تحقق من الجزء الخلفي من الشرائح كل يوم لتحديد ما إذا كانت البقعة قد اخترقت الأنسجة بالكامل. انتقل إلى الخطوة التالية عند اكتمال تلطيخ.
    ملاحظة: يكتمل تلطيخ عندما يكون لأجزاء الغدة الأكثر سمكاً لون أرجواني ولا تظهر بيضاء بعد الآن.
  11. إزالة وتجفيف الأنسجة عن طريق نقل الشرائح من خلال سلسلة من التركيز المتزايد للإيثانول: 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، 95٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة و 100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
  12. ضع الشرائح المجففة في الزيلين لمدة 3+ أيام لمسح الأنسجة. نقل إلى الزيوت المعدنية للتخزين على المدى الطويل.
  13. بعد مسح الشرائح، استخدم المجهر الضوئي المنخفض الطاقة أو التصوير الرقمي عالي الدقة للحصول على صور للشرائح للتحليل. تأكد من أن معلمات الحصول على الصور متناسقة لكافة الشرائح.
    ملاحظة: يجب أن يكون النمو الظهاري مميزًا بوضوح.
  14. التعامل مع وجود النمو نتيجة ثنائية.
  15. حساب متوسط عدد الخلايا الظهارية المزروعة التي أنتجت ≥ 1 نمو الثدي في 50٪ من مواقع الكسب غير المشروع باستخدام الصور المكتسبة. القياس الكمي الميزات المادية الأخرى، حسب الحاجة.

النتائج

الغدد الثديية المانحة والمتلقية
وترد خطوات عزل وإعداد الخلايا الظهارية الثديية الفئران لزرعها في الشكل 1A. في 4 أسابيع من العمر ، بدأت الغدة الثديية الذاتية للفأر المانح النضج ويمكن تصور ظهارة على الشرائح المثبتة بالكا...

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنية زرع الخلايا الظهارية الثديية المحسنة للعمل مع الفئران. يتم تطعيم الأعضاء الظهارية الثديية المعزولة من الفئران المانحة (3-5 أسابيع من العمر) في وسادة الدهون البيضاء البينية للفئران المتلقية (3-5 أسابيع من العمر أيضًا). يمكن تفسير النتائج أقل من 4-6 أسابيع في وقت لاحق, ب?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل مركز هولينغس للسرطان مركز دعم السرطان منحة P30 CA138313 البحوث التجريبية التمويل من المعاهد الوطنية للصحة(https://www.nih.gov/)،والأموال من قسم علم الأمراض والطب المختبري في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية. ونود أن نشكر ماريجين سميث على تسجيل هاوية المقابلة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µM syringe filtersFisher Scientific09-715Gsterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)Fisher Scientific05-408-129containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainersCorning431752filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needlesHamilton81001 & 90525For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette--transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tubeFalcon (Corning)352196brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainersCorning431750filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubesFisher Scientific05-539-6for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishesThermo Scientific130181for mincing tissue
Alum Potassium SulfateSigma-Aldrich243361/237086staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use--follow institutional protocol
Beta-dine or iodine--
Borosilicate glass culture tube for homogenizationFisher Scientific14-961-26for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
CarmineSigma-AldrichC6152/1022staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus--
Clean animal cages for recovery--follow institutional protocol
Collagenase Type 3Worthington Biochemical Corp.LS004183enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water--for chemical solutions
DMEM/F12GIBCO11320033for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA--monodispersion mixture
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone-inactivation solution
Gauze--
Glacial acetic acidFisher ScientificA38-212use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSSGIBCO-monodispersion mixture
Heating pads--follow institutional protocol
Ice buckets (x2)--
Incubator with orbital rotation--must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia--follow institutional protocol
Light microscope or digital camera--visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizerFisher Scientific-TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pureSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer--follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes--
Positively-charged microscope slidesThermo ScientificP4981-001mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic--Institutional protocol
Scalebody weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver--electric clippers, or other
Staining jars--minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapesIMCO4410-IMCused during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)--autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)--for sterile filtration of collagenase digestion media
TrypsinWorthingtonmonodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)--
Wound clip applier, clips, and removal toolFine Science Tools12020-00Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
XylenesFisher ScientificX3S-4clearing mammary gland whole mount slides after staining

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J., DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., Rubin, E., Damjanov, I., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. , 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J., Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved