JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.

Abstract

מוקדם כמו שנות ה-70, החוקרים הושתל בהצלחה תאים אפיתל החלב לתוך משטח שומן לבנים לבן של חולדות. השתלת אפיתל החלב באמצעות טכניקות השתלת מנצל את הסביבה ההורמונלית המסופקים על ידי מארח מכרסם המתבגר. מחקרים אלה מתאימים באופן אידיאלי כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציות ביולוגיות שונות על פיתוח בלוטת החלב ולנתח היבטים רבים של בלוטת החלב ביולוגית. נפוץ, אבל מגביל, תכונה היא כי התאים האפיתל המושתלים מושפעים מאוד על ידי משתית מסביב והתחרו על ידי אפיתל אנדוגניים; כדי לנצל את רקמת הפטמות הילידים, pad שומן לבן בבטן העור חייב להיות מנוקה כדי להסיר אפיתל הפטמות מארח לפני ההשתלה. מכשול גדול בעת שימוש באורגניזם מודל החולדה הוא שניקוי עץ הפטמות המתפתח בחולדות שלאחר-מכן אינו יעיל. כאשר מושתלים לתוך רפידות שומן ללא בלוטת, התאים האפיתל התורם יכול לאכלס משטח מארח נקי שומן ליצור בלוטת החלב תפקודית. משטח השומן הרפית הוא מיקום חלופי עבור השתלים אלה. היתרון העיקרי הוא שהוא חסר מבני ductal עדיין מספק את משתית נורמלי כי יש צורך לקדם את הצמיחה אפיתל והוא נגיש בקלות בחולדה. יתרון מרכזי נוסף של הטכניקה היא כי הוא פולשני מינימלית, כי זה מבטל את הצורך לצרוב ולהסיר את עץ הפטמות האנדוגניים גדל. בנוסף, פד שומן מכיל כלי דם המדיאלי שניתן להשתמש בו כדי להפריד אתרים להשתלת. בגלל בלוטות אנדודוגני להישאר שלם, טכניקה זו יכולה לשמש גם למחקרים השוואת בלוטת החלב אנדוגניים לבלוטה המושתלים. נייר זה מתאר את השיטה של השתלת תא האפיתל הפטמות לתוך משטח שומן לבן השכמה של חולדות.

Introduction

התפתחות בלוטת החלב פוסט לידה ו ductal מורגנזה הם תהליכים המושפעים במידה רבה על ידי איתות הורמונלי בתחילת ההתבגרות. בעכברים וחולדות, בשימוש נפוץ במודלים של ביולוגיה של בלוטת החלב, תהליך זה מתחיל בסביבות 3 שבועות של גיל, שבו התפשטות מהירה ובידול התוצאה היווצרות של המבנה הבוגר. בלוטת החלב הבוגרת יכולה לעבור סבבים רבים של התרחבות ואינוולוציה, נכס שנחקר מאז תחילת המאהה -20. במסגרת ההקשר של היפרהפצה והתפתחות הסרטן, פותחו טכניקות השתלת בלוטת החלב בשנות ה-50 שלהמאה העשרים,והופרו על ידי המתודולוגיה הכמותית שתרמה גולד ואח '. ב-19772,3,4. עידון של טכניקת ההשתלה אצל מכרסמים תרם להתקדמות מרכזית בהבנת ביולוגיה רגילה של בלוטת החלב, כי הם עדיין בשימוש נרחב כדי ללמוד את ההשפעה של טיפולים שונים מניפולציה גנטית על פיתוח בלוטת החלב רגילה ומצבי מחלה.

השערות רבות נוצרו ונבדק לאחר מכן באמצעות השתלת בלוטת החלב, שתוארה לראשונה על ידי DeOme et al. ב 19591. ניסויים בכמה עשורים הראו את הנטייה של רקמת דוטל שנתרמה מבלוטות החלב של התורמים כדי לאכלס מראש את כל משטח השומן5,6,7 והצביע על כך שרכיב קריטי בהתפתחות בלוטת החלב שוכן במבני אפיתל אלה. מחקרים מאוחרים יותר בעכברים הראו כי תא גזע בודד יכול לאכלס משטח שומן נקי ותרם לגילוי של מעשה יחיד, משותף של התאים האפיתל הבליים והלומיאל של חלבשמונה,9,10. בשורה עם מסקנות אלה, הוצע כי ההשתלה מגדילה את בריכת התאים עם ריבוי היוחסין-מאכלס מחדש את הפוטנציאל כתוצאה של פלסטיות, ומאפשר לתאים המושתלים לצמוח בלוטת חלב תפקודית7,10,11,12,13. חשוב מכך, השימוש בטכניקות השתלת מכרסמים מתגבר על מגבלות של תאים המושרה התרבות התאי14 ולעתים קרובות מספק תוצאות רק עניין של שבועות.

בעוד ההליך תוארה במקור בהקשר של נגעים preneoplastic בעכברים, זה היה מורחב במהרה חולדות משמש בשילוב עם הטיפול מסרטן כדי להקים ריבוי כמדד של הרגישות לסרטן15, אבל הפופולריות של טכניקות השתלת עקב התפתחות של כלים גנטיים עבור כל מין. למרות לימודי העכבר המשלבים השתלת תרמו ממצאים טרנסלבותית רבים, המקרוב של בלוטת הפטמות של החולדה דומה לאדם הדוק יותר16,17 ומציע יתרונות ברורים ללמוד קולטן אסטרוגן-חיובית (ER +) סרטן השד. גידולי הפטמות מinducible בשני המינים, אך הם נבדלים במונחים של רגישות הורמונלית ופרופילי ביטוי גנטי. ההבדל העיקרי הוא כי גידולי הפטמות העכברים לבטא ותלוי בתפקוד של קולטני הורמונים השחלות ובלוטת יותרת השכל, כלומר, אסטרוגן ופרוגסטרון (PR), בדומה ללומיאל-סוג של סרטן השד האנושי. אכן, השתלת תא האפיתל הפטמות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, נעשה שימוש כדי ללמוד משתנים גנטיים המעורבים בסרטן השד ולקבוע את האוטונומיה התאית של ההשפעות על תאים אפיתל הפטמות18.

בנוסף לביולוגיה של הגידול, האפיתל הדוטל של בלוטת הפטמות הרגילה מציגה רמה גבוהה יותר של הסתעפות ומוקף בשכבה עבה יותר של משתית מאשר העכבר. חשיבותו של הסטרומה מתועדת היטב במחקרים של השתלות האפיתל. אפיתל הפטמות חייב לקיים אינטראקציה עם משתית שומן, ובאופן אידיאלי משלה mesenchyme, כדי לעבור את המאפיין שלה מורפולגנזה19,20. השתלת רקמה בבלוטת החלב של המטופל מספקת סביבה אופטימלית; עם זאת, הנוכחות של אפיתל אנדוגני יכול להפריע לתוצאות. ניקוי בלוטת החלב של אפיתל אנדודוגני מבוצע בדרך כלל באמצעות השתלת העכבר בחני ודורש כריתה כירורגית של רקמת חלב אנדוגניים ו/או הסרת הפטמה1,21,22. למרות האפשר, מראש לנקות את האפיתל הפטמות בחולדות פוסט-weanling אינו מבוצע באופן נרחב, בעיקר בשל חוסר היעילות של ניקוי עץ הפטמות הגוברת בחולדות פוסט-weanling. מאז הוכח כי אזורים של רקמת האדיפוז במקום אחר בגוף יכול לתמוך בצמיחה של אפיתל החלב המושתלת21,23,24, תהליך של מראש ניתן להימנע בקלות חולדות על ידי השתלת רקמות לתוך pad שומן לבן הגלימה.

שיטת ההשתלה המתוארת במאמר זה כרוכה בהזרקה של אורגנואידים בלוטת החלב אנזיטיתיים (שברי האפיתל של הפטמות וסוגי תאים אחרים המסוגלים להיות מורפולגנזה) או תאים חד מפוצלים לתוך משטח השומן הבין-משני ב מונוגניים, או זנים של עכברי מעבדה2. בגלל pad שומן החוצה הוא נטול בדרך כלל של רקמת הפטמות, הוא מספק סביבה מתאימה עבור אתרי השתלת מרובים ללא צורך ברור מראש אפיתל אנדוגניים. כתוצאה מכך, האנדוגניים בעלי החיים המארחים, בלוטות החלב מבולי הבטן אינם כפופים לטיפול כירורגי, מפתחים כרגיל, ואינם יכולים להפריע לפרשנות של תוצאות. בנוסף, ניתן להשתמש בבלוטות החלב ללא שינוי לצורך השוואת המחשב המארח לעומת השפעות התורמים בהתפתחות האפיתל של החלב ובטומוריגנזה18,25. למרות שאכלוס מחדש של בלוטת החלב מתא גזע אחד זמין עבור עכברים, זה עדיין לא פותחה עבור עכברוש, בעיקר בשל חוסר הזמינות של נוגדנים לבחור עבור העכבר הפטמות גזע בתאי25,26,27. למרות זאת, השתלת תאים אפיתל מונוציתיים לכמת מחדש את הפוטנציאל ניתן לבצע בהצלחה, ותאים אלה יפתחו בדרך כלל כאשר מושתל במסגרת המתאימה2,3,4. בעוד אורגנואידים הם טובים עבור מטרות רבות, תאים חד מפוזרים נדרשים עבור יישומים כמותיים, למשל, כדי לקבוע את מספר התאים האפיתל החלב הנדרש עבור החניכה סרטן בעקבות טיפול קרינה מייננת28 או להשוואת מאפייני הזרימה הצילתית של הפטמות של תאים האפיתל שנבחרו בשנת29.

עד היום, ההליך המתואר כאן הוא השיטה החזקה ביותר של ביצוע השתלת בלוטת החלב בחולדה עם מטרה כוללת של לימוד פיתוח בלוטת החלב ומנגנונים בבסיס התפתחות סרטן השד. לעתים קרובות, התורם ו/או בעלי החיים נחשפים למשתנים שונים לפני, במהלך, או אחרי השתלת האפיתל. דוגמאות כוללות לימודי גנים בודדים מעורבים כימיים קרצינובגנזה30, קרינה28,31,32, מניפולציה גנטית של מארח/הגנום תורם18, ו מניפולציה הורמונליים12. היתרון העיקרי של הדיסוציאציה האנזימטית המתואר בפרוטוקול זה הוא ההזדמנות לבודד תאי אפיתל או תאים חד מבודדים עבור ניסויים משלימים הכרוכים בזרימה, תרבות תלת-ממדית, עריכת גנים ועוד. יישומים עתידיים של טכניקה זו יכלול מניפולציה נוספת של התורם ו/או מארח רקמות עם הנדסה גנטית. לדוגמה, תאים תורמים יכולים להיות מהונדסים גנטית לשעבר vivo בכל מקום גנומית שנבחרה באמצעות CRISPR-Cas9 המערכת לעריכת גנים. באופן דומה, חולדות הנמען יכול גם להיות שונה גנטית כדי ללמוד את האינטראקציה בין התורם לבין המטופל הנדסה גורמים גנטיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל בעלי החיים היו שוכנו והחזיקו במתקן מאושר AAALAC, וניסויים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הMUSC טיפול בעלי חיים מוסדיים & להשתמש הוועדה (IACUC). בעלי חיים לשימוש השתלת הדדית צריך להיות זן מעוות או איזוגניים, עם מעמד הקונגניים מועדף או מוצלב עבור לפחות 6 דורות.

1. בלוטת הרקמות של התורם המעי האפיתל

  1. קבע את מספר עכברי התורם הדרושים להשתלה.
    הערה: בדרך כלל, 1 עכברוש תורם (4 שבועות של גיל) יכול לספק מספיק תאים עבור השתלת 4 בעלי חיים הנמען. יישומים מסוימים של פרוטוקול זה ידרוש מספר נוסף של תאים, וניתן ליצור הבדלים ספציפיים למתח בתשואה כוללת.
  2. התווית את כל האספקה ולהבטיח מיקום נגיש עבור המנתח (טבלה 1).
  3. הקלט את משקל הגוף. של כל מלשן של תורם נשי בצע את ההנחיות המוסדיים כדי להרדים באופן מלא או להרוג את עכברוש התורם. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר התגובה צביטה הבוהן.
  4. הזיזו את החיה לשדה. הכירורגי הסטרילי מניחים את החיה על גבו ולרסס את כל המשטח הגחוני עם 70% אתנול.
  5. להפוך משונן, X בצורת חתך, המאפשר גישה לבית החזה, בטן ובלוטות החלב האינרינרית. מנתחים את כל רקמת בלוטת החלב מחולדה התורמת באמצעות מספריים (איור 1). להסיר את כל בלוטות הלימפה גלוי.
  6. לחלץ את רקמת החלב באמצעות מלקחיים ומקום בצלחת 60 mm מסומן על קרח. הוסף 500 μL של מדיה ללא שימוש בסרום/F12 לצלחת 60 מ"מ. כוונן את מיקום רקמת בלוטת החלב כך שיישאר רטוב לחלוטין.
  7. שימוש דק ברקמת הפטמות במספריים. כדי לעשות זאת, חותכים את הרקמה לחתיכות 1-2 מ"מ3 בגודל (איור 1ג). שמור את הבלוטה על הקרח עד כל רקמת התורם כבר שנקטפו (לא יעלה 60 דקות).
    הערה: כוח אדם נוסף יכול להגון בלוטות החלב ובנוסף להכין את הפתרון הקולגן בעוד המנתח ממשיך עם העור מעקירות.

2. לחלץ רקמת מוח מתורמים מורדמים

  1. הפוך בזהירות את גופתו של בעל החיים התורם על מנת להציב אותה בתנוחה מועדת. . מאובטח עם סיכות רסס את הראש והגב העליון עם 70% אתנול.
  2. לאתר את בסיס הגולגולת ולעשות חתך מתחת לתוך העורף. הכניסו מספריים חדים מתחת לעור וחתכו את העור הרחק מהגולגולת, כולל צדי הראש.
  3. השימוש חותכי עצם או מספריים חזקים כדי לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע, מן העורף לעצמות המצח. השאר את הלהב שטחי ככל האפשר וזווית כלפי מעלה כדי למנוע הרס של רקמת המוח הבסיסית.
  4. לקלף את העצם באמצעות rongeurs או מלקחיים חזקים. הכנס את הכלי לרוחב המוח השני כדי לשבור את העצם מכל צד, חשיפת תעלת השמיעה הגרמית. . לנתק את החיבורים לקרום הקרומי
  5. הרם בעדינות את המוח בעזרת מלקחיים מעוקלים ודקים. מניחים את המוח על פיסת נייר כסף, להקליט את המשקל, ולאחר מכן מיד להעביר לצינור 15 מ ל עם כמות שווה (w:v) של מדיה, מאוחסן על קרח.
    1. באופן אופציונלי, השתמש מלקחיים עצה בסדר כדי להסיר את בלוטת יותרת המוח (ממוקם מתחת לראש) לשימוש נוסף בהליך ההשתלה, במידת הצורך.
  6. השתמש ברופא מכני. כדי לשבש את הרקמה הומוגון המוח עבור 10-15 s במהירות נמוכה. תנו לתערובת לשבת על הקרח לפחות 1 דקות, ולאחר מכן הומוהגון שוב. המגון מספיקה כאשר התערובת הסופית היא חופשית מחתיכות גדולות.
  7. לסנן את ההגון על ידי העברתה דרך מסנן 100 יקרומטר. השאר את הפילטרט על הקרח עד השימוש (פחות מ 4 שעות).

3. העיכול והעיבוד של תמציות בלוטת החלב

  1. ההפשרה או הראקטיבים חמים כמצוין (שולחן 1). בצע את השלבים המתאימים עבור שחזור אורגנואידים או תאים מונומפוזרים.
  2. הכינו 10 מ ל של מדיית העיכול ללא סרום (ללא הקולגן) עבור כל בעל חיים תורם (קובץ משלים 1).
    הערה: ניתן לכוונן את הנפח של מדיית העיכול (למעלה או למטה) כדי להתאים לרקמה המקובצת, אם הדבר ישים.
    1. . לאורגנואידים, לדלג ל3.3
    2. עבור תאים מפוזרים, להכין תערובת מונונפיצה טרי ופתרון הפעלה (קובץ משלים 2, משלים קובץ 3) בנוסף סרום ללא קולגן מדיה העיכול. . המשך לשלב 3.3
  3. כאשר כל רקמת הפטמות מתורמים כבר הופק וכתוש, הוסף את האנזים הקולגן לאמצעי העיכול החם (או טמפרטורת החדר) (קובץ משלים 1). מערבבים על ידי היפוך.
  4. להעביר את הקולגן מדיה העיכול דרך מסנן 20 יקרומטר. מחלק 10 מ ל של מדיה מסוננת בצינורות 50 mL המסומנים לעיכול.
  5. השתמש בטיפ חדש 1,000 μL לדוגמה עבור כל מדגם והעבר את רקמת התורם הטחון מתוך כל מנה 60 מ"מ לצינור העיכול של הקולגן. גזור 1 ס מ מהקצה לקצה של קצה 1,000 μL והציבו אותו באופן ידני בהתקן לפני השימוש. בעדינות לערבב את הרקמה הקצוצה על ידי ליטוף למעלה ולמטה 1-2 פעמים.
    הערה: אם הרקמה קשה לפיפטה במהלך ההעברה, השתמש בכמות קטנה של מדיית העיכול של הקולאז מ50 mL ולאחר מכן העבר אותה בחזרה.
  6. מניחים את הדגימות בתנוחה האופקית בחממה רועדת ומאפשרות לדגימות לעכל 1.5-2 h ב 37 ° c, 200-220 rpm.
    1. . לאורגנואידים, לדלג ל3.7
    2. עבור תאים חד מפוזרים להוסיף DNase I (0.2 μg/mL) לתערובת עבור 10 הדקות האחרונות של העיכול. דגירה כמו קודם, עם רעד נמרץ. . המשך לשלב 3.7
  7. כאשר הרקמה מתעכל לגמרי, מעכלת את ההשעיה באמצעות צנטריפוגה קר (4 ° צ') עבור 10 דקות ב 1,200 x g (איור 1D).
    הערה: השאר את הצינורות בקרח בין כל שלב כדי להגביר את הכדאיות של תאים.
  8. ודא שנוצרת גלולה, ולאחר מכן הפוך בזהירות את שכבת הסופרנטאנט והשומן. השהה מחדש בעדינות את הגלולה ב-10 mL של מדיה חדשה/F12.
  9. בקצרה ספין ב 68 x g בערך 10 ס מ. אורך הספין (אך לא את המהירות) ניתן להגדיל אם אין הפרדה ברורה של תאים. בחן באופן חזותי את הגלולה לפני שתמשיך (איור 1ד).
  10. הסר בזהירות את הסופרנטאנט, והשאיר אחריו נפח קטן. המשך לשלב הבא, בהתבסס על האופן שבו יש צורך בארגון מוננואידים או בתאים מונומפוזרים.
    הערה חשוב להשאיר נפח קטן של מדיה בצינור כי הגלולה יהיה רופף מאוד. כמות התקשורת השיורית. תהיה מדוללת באמצעות שטיפת המדרגות
    1. עבור אורגנואידים, הוסף נפח נוסף של 10 מ"ל של מדיית DMEM דיה/F12 וחזור על השטיפה/ספין. לאחר השטיפה השנייה, השהה מחדש את התאים באמצעי אחסון קטן יותר (1-2 mL) של מדיית DMEM דיה/F12 לסינון. . המשך לשלב 3.11
    2. עבור תאים מפוזרים, מתמוסס 2 מ ל של מחומם טרום HBSS עם 0.025% (w/v) טריפסין ו 6.8 מ"מ EDTA. לעכל עבור 3-5 דקות ב 37 ° c. . הפעל מיידית
      1. הוסף 4 מ ל של DMEM/F12 עם 10% FBS להפסיק להפעיל את טריפסין.
      2. לסובב את התאים ב 270 x g עבור 5 דקות, ולאחר מכן להשעות מחדש ב-dmem/F12 עם 10% fbs שוב. המשך לשלב 3.11 כדי לסנן את התאים.
  11. לסנן את התאים באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר ממוקם בצינור חדש 50 mL. טרום להרטיב את מסננת ידי ליטוף 1 מ ל של אותו בסיס בסיסי המשמש כדי להשעות את התאים, ולאחר מכן לעבור את ההשעיה התא דרך המסנן באמצעות פיפטה כדי לאסוף שברי דוטל/אורגנואידים.
    הערה: התשואה המשוערת של האפיתל המסונן מרקמת בלוטת החלב של עכברוש יחיד, בן 4 שבועות של התורם הוא 1 x 106 תאים.
    1. בשביל אורגנואידים, מחק את הfiltrate. אורגנואידים של פטמות יישארו בתוך הסל של מסננת התא קטן יותר, תאים לא רצויים יושמדו. היפוך מסננת התא מעל צינור 50 mL חדש, ולשטוף עם כל אמצעי האחסון הדרוש כדי לאסוף את התאים. . המשך לשלב 3.12
    2. עבור תאים מפוזרים, למחוק את מסננת התא ולשמור את פילטרט כי התאים האפיתל הפטמות יעברו דרך המסנן, יחד עם סטרומה קטן יותר תאים חיסוניים. לשטוף את הצינור ששימש את העיכול/צנטריפוגה עם נפח אחר של Dמאמ/F12 עם 10% FBS ו לעבור דרך מסננת התא זהה. גלולה התאים מונומפוזרים על ידי צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 5 דקות. המשך לשלב 3.12.
      הערה: התאים שהושעו מחדש מוכנים ליישומים הבאים.
  12. דופק לסובב את הפתרון ולהבטיח את היווצרות של גלולה תא לפני שתמשיך לשלב הבא. . דופק שוב, אם יש צורך
  13. הסר בזהירות את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה בנפח קטן (1000-2000 μL של Dמאמ/F12) כדי לרכז את התאים לספירה.
  14. ספירת תאים ודלל במידת הצורך. השהה מחדש את המספר הרצוי של תאים עבור השתלת 20 μL של מדיית DMEM/F12 עבור כל חיה. . תמיד שומרים על תאים בקרח
    הערה: ספירת תאי התורמים בטווח של 1 x 105 -1 x 106 תאים יידרשו עבור כל אתר השתל מבוסס על נקודת הקצה של המחקר. לדוגמה, ניסויים קרצינובגנזה דורשים לעתים קרובות מספר גדול יותר של תאים מושתלים, ביחס ליישומים אחרים. יש לקבוע את מספר התאים הדרושים לכל מאמץ. ההליך המתואר בפרוטוקול זה מנוצל 250,000 תאים תורמים 20 μL מדיה לאתר שתל, לפני ערבוב עם הומוגון המוח, כפי שמתואר בשלב 3.16.
  15. להכין כל aliquot (ים) של תאים הדרושים עבור ניסויים אחרים (למשל, facs בידוד3,26,27,30,33).
    1. . עבור אורגנואידים, המשך לשלב 3.16
    2. עבור תאים מפוזרים, לכמת את התאים הקיימא באמצעות טריבין או מתילן כחול כתמים, ולאחר מכן להמשיך.
  16. הכינו אצוות יחיד של חומר תורם לכל הנמענים המושתלים. לשלב כרכים שווים של ההשעיה התא (20 μL) עם 50% הומומטר המוח (20 μL) עבור כל אתר של השתלת.
    הערה: סך של 40 μL לכל אתר ייזרק בכל אתר, אך מומלץ לכלול מינימום של 25% נפח נוסף עבור פסולת.
  17. מיד להמשיך להשתלה או להקפיא תאים להשתלה מאוחר יותר (נקודת עצירה פוטנציאלית).
    הערה: תאים קפואים לא נבדקו עם פרוטוקול זה ידרוש אופטימיזציה מראש של יצירת קבוצה של בעלי חיים עבור ניסויים השתלת. מומלץ מאוד להשתיל תאים טריים.

4. השתלת הליך (חולדות הנמען 4-5 שבועות של גיל)

  1. שוקלים כל עכברוש הנמען ולחשב את המינון הנכון של משכך אושר שישמש בהליך.
    הערה: ניתן למדוד משקולות גוף עד 24 שעות מראש של ההליך. עקבו אחר ההנחיות המוסדיות לריסון או להרדמה קצרה של כל חיה למשך הגילוח.
  2. לגלח את האזור כירורגי על כל חיה באמצעות קוצץ חשמלי. זיהוי בסיס הגולגולת והתחלת הטור החוליות. כשליש הדרך לאורך עמוד השדרה, לגלח שטח 3 ס"מ x 2 ס מ על החלק העליון של בית החזה של הגב.
    הערה: ניתן לבצע גילוח גם תחת הרדמה ביום ההשתלה, אך יש לבצעו מחוץ לתחום הסטרילי. החזר את החולדה לכלוב הבית שלו עד שיהיה צורך בכך.
  3. אתר את כל הציוד הדרוש עבור השתלת (שולחן 1).
  4. להעריך את מערכת חיות ההרדמה מעבדה לפני השימוש. העליון את כל הנוזלים ולהחליף את כל הטנקים או חלקים הנחוצים. ודא שכבל הגז לחדר ההרדמה פתוח וכל קווי הפריפריה סגורים כך שהרדמה וחמצן באופן חופשי עלולים לזרום בחופשיות לחיה ברגע שהיא ממוקמת בחדר.
  5. רפידות חימום חמות כדי לתמוך בטמפרטורת הגוף של חיות הנמען.
  6. צור את השדה הסטרילי שישמש לניתוח. סדר את האספקה כפי שמתואר בטבלה 1.
  7. באמצעות פרוטוקול טיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי המטופל.
  8. ריקון מזרקים המילטון עם מדיה סטרילית DMEM/F12 כדי למנוע אובדן של תאים. ודא כי המחט מאובטחת לגוף של המזרק, להכניס את המחט לתוך הנוזל, ולמשוך בחזרה את הבוכנה. מלא את עוצמת הקול המירבית. לחץ על הבוכנה וגרש את התוכן לתוך צינור איסוף פסולת. חזור על 3-5 פעמים.
  9. לטעון את כל הנפח של חומר תורם (מוכן בשלב 3.16) לתוך מזרק נפרד עבור כל תנאי (למשל, שליטה, מטופלים, wildtype, נוק, וכו '). הכנס את קצה המחט לתוך הנוזל, למשוך חזרה את הבוכנה ולשמור את המחט מתחת לפני השטח של התערובת כאמצעי האחסון בצינור פוחתת.
    הערה: כלול לפחות 10% נפח נוסף בכל מזרק. אל תשליך את התערובת הנותרת לסגור את הצינור ולשמור אותו על הקרח במקרה שיהיה צורך.
  10. היפוך המזרק לאחר שהוא טעון במלואו ולחץ על הבוכנה מעט כדי להסיר בועות אוויר בקצה המחט. המשך לשלב הבא כאשר הכל מוכן.
    הערה: ודא שקצה המחט לעולם אינו נוגע במשטח אחר, אפילו בתוך השדה הסטרילי. זה עוזר להניח את הגוף של המזרק מעל מיכל קטן של קרח כדי לקדם את הכדאיות של התאים.
  11. הצב את בעל החיים של המטופל בתא ההרדמה והפעל את המכונה.
  12. כאשר החיה רגועה לחלוטין (אינה מגיבה להקשה או לתנועה עדינה של החדר), הנחו את ההרדמה לחרוט האף והעבירו את בעל החיים לשדה הסטרילי.
    הערה: משך ההרדמה המורחבת אינו נסבל היטב על ידי חולדות. השלם את ההליך עבור כל חיה ב 10 דקות או פחות.
  13. מניחים את החיה בתנוחה מועדת (על הבטן) כך שחלקו האחורי של הראש ועמוד השדרה העליון נגישים.
    הערה: להבטיח תמיכה נאותה לבעלי החיים כל הזמן, באופן קבוע להעריך את עומק ההרדמה באמצעות צביטה בבוהן המשרד.
  14. באופן אופציונלי, להחיל משחה וטרינר אופטלמולוגי כדי למנוע ייבוש של העיניים.
  15. נקה את האזור מגולח טרי כדי להסיר שיער עודף. השתמש בתנועה מעגלית והחל 70% אתנול (או מגיב אחר, לפי הנחיות מוסדי) לעור, ואחריו חומר חיטוי (כגון יוד), וחזור. הניחו את המגבת על החיה כך שרק האזור המגולח ייחשף.
  16. ודא שהחיה נשארת לא מגיבה לגירויים עמוקים עם צביטה בבוהן, ולאחר מכן המשך לשלב הבא.
  17. לעשות חתך קטן (2 ס מ) חיתוך השכמה באמצעות להב ניתוחי חד.
    הערה: החתך חייב להיות שטחי, כמו משטח השומן ממוקם ממש מתחת לעור.
  18. אתר את כלי הדם המדיאלי לאוריינטציה (איור 2ב').
  19. הרם את העור בצד אחד של החתך באמצעות מלקחיים והחזק אותו הרחק ממשטח השומן בזמן שההשתלה מבוצעת (איור 2ב). הכניסו את המחט. לתוך אתר השתל
    1. באופן אופציונלי, להעביר את קצה המחט בתוך הרקמה וליצור כיס קטן כדי לאסוף את התאים. השתמש בתנועה קטנה וחוזרת. אל תסיר את המחט.
      הערה: שלב זה מומלץ עבור משתמשי הפרוטוקול בפעם הראשונה. השימוש בזהירות קיצונית בעת יצירת כיס, כמו הרקמה משטח שומן שומנים הוא עדין מאוד.
  20. בזהירות להזריק 40 μL של התערובת התא לתוך רקמת השומן הפנימי של pad. . הסר את המחט לאט
  21. להחזיק את הרקמה במקום ולאפשר את התאים המושתלים להתפשר על 3-5 s. השתמש בזוג נוסף של מלקחיים, במידת הצורך.
  22. הסר את המחט. חזור על הליך ההזרקה (שלבים 4.18-4.21) באתר השני של ההשתלה.
    הערה: האפיתל מקבוצה אחת תורם ניתן להזריק לתוך אותו צד של משטח השומן בכל בעל חיים, או צדדים לסירוגין כדי למנוע אפקטים של אצווה מתוך שליטה ביד של המנתח.
  23. סגרו את הפצע הכירורגי בעזרת אטבי פצעים או תפרים, ולאחר מכן הפסק את ההרדמה.
  24. מספקים משכך כאבים שלאחר הניתוח כפי שמצוין בפרוטוקול שאושר על-ידי המכון.
  25. הזיזו מיד את בעל החיים לכלוב התאוששות עם תמיכת החום. מעקב אחר סימני מצוקה כגון דימום מהחתך או מקשיי הנשימה.
    הערה: בעל החיים צריך להתאושש באופן מלא בתוך 5-10 דקות. התייחס להנחיות המוסדיות להחזרת בעלי חיים למושבה ולניטור שלאחר הניתוח לאחר הליכי הישרדות.
  26. באופן אופציונלי, לבצע לימודים קרצינופוגנזה באתר שתל (s) על ידי ניהול קרצינוגנים המטופל חולדות 3-4 שבועות לאחר ההשתלה.
    הערה: בדרך כלל, הפטמות מסרטנים מבוצעת באמצעות טיפול כימי מסרטן ב 50-57 ימים של גיל. טיפול זה מכתיב את גיל ניתוח ההשתלה (שיש לעשות בין 29-36 ימים לגיל) כדי לאפשר מספיק זמן לתאים המושתלים ליזום צמיחה של בלוטת החלב.

5. הערכת התפתחות האפיתל

  1. עקוב אחר מחזור ייחום של חולדות באמצעות שאיפה הנרתיק היומי ולבחון את הציטולוגיה בשקופית מיקרוסקופ. התחל 8-12 ימים לפני נקודת הקצה של המחקר. . להקריב את כל העכברושים באותו שלב זהו צעד אופציונלי.
    הערה: מחזור ייחום החולדה הוא 4-5 ימים. המאפשר לבעל החיים לעבור דרך 1-2 מחזורי מעגלים מלאים יקל על הפרשנות, מאחר ששטיפה שקופיות ממחזורים קודמים ניתן להשתמש להשוואה.
  2. הקרבת השתלת המטופל חולדות 6-8 שבועות לאחר ההשתלה, לפי הנחיות מוסדי.
    הערה: Outgrowth בדרך כלל לגילוי 3-6 שבועות לאחר ההשתלה, אבל זמן נוסף עשוי להידרש.
  3. מניחים את החיה במצב נוטה ולנקות את הגוף עם 70% אתנול. הרם את העור עם מלקחיים ולבצע חתך לאורך העמודה החוליות כדי לחשוף את פד השומן הבין-הגלימה. לנתח את העור הרחק הרקמה כך רוב משטח השומן גלוי.
  4. לזהות את כלי הדם המדיאלי שמפריד. את אתרי ההשתלה בפנקס השומן הפנימי בלו את כל המשטח כחתיכת רקמה אחת או לחתוך לאורך כלי הדם והסירו צדדים בנפרד.
  5. מניחים את הרקמה על השקופית טעונה חיובי מיקרוסקופ עבור הר שלם. השתמש 2 זוגות של מלקחיים קהה להפיץ בעדינות את הרקמה כדי לשחזר את החיבור המקורי שלה על השקופית.
    הערה: רקמת הפטמות של החולדה עדינה מאוד. הקצוות של הרקמה עשוי להתקפל מתחת לפני עצמו. תמיד לטפל בטיפול ולהחזיק במקום עד הרקמה נדבקת לשקופית (כמה שניות).
  6. כל-הר לפחות אחת מבלוטות החלב האנדוגניים (עם בלוטות הלימפה לאוריינטציה) להשוואה.
  7. מניחים את השקופיות ב 70% אתנול עבור 7-10 ימים כדי להשחית את הרקמה. לחדש את האתנול לעתים קרובות ככל הדרוש כדי להבטיח את הרקמה לא להתייבש.
  8. הכן את השקפים כאשר הרקמה אטומה מספיק. אפשר לכתם להתקרר לפני השימוש (קובץ משלים 4).
    הערה: ניתן להכין את הכתם עד יום אחד מראש לקיבוע ולצעדים מחדש. ניתן לאחסן את הפתרון ב-4 ° צ' והוא בעל פוטנציאל מוגבל לשימוש חוזר.
  9. תקן את הרקמה על ידי הצבת השקופיות ב 25% חומצה אצטית סינתטית: 75% אתנול עבור 60 דקות.
    1. מימה את הרקמה דרך סדרה של 3 שוטף בסדרה של ירידה בריכוז של אתנול: 70% אתנול עבור 15 דקות, 50% אתנול עבור 5 דקות ו-dH2O עבור 5 דקות.
  10. כתם עם כרמיין במשך 4-8 ימים. בדוק את החלק האחורי של השקופיות כל יום כדי לקבוע אם הכתם חדרה לחלוטין את הרקמה. המשך לשלב הבא כאשר ההכתמה תושלם.
    הערה: כתמים להשלים כאשר החלקים העבה ביותר של בלוטת יש גוון סגול לא נראה יותר לבן.
  11. Destain ומייבשים את הרקמה על ידי העברת השקופיות באמצעות סדרה של ריכוז הולך וגובר של אתנול: 70% אתנול עבור 30 דקות, 95% אתנול עבור 30 דקות ו 100% אתנול עבור 30 דקות.
  12. מניחים שקופיות מיובשות ב קסילן עבור 3 + ימים כדי לנקות את הרקמה. העברה לשמן מינרלי לאחסון לטווח ארוך.
  13. לאחר ניקוי השקופיות, השתמש במיקרוסקופ אור בעוצמה נמוכה או בצילום דיגיטלי ברזולוציה גבוהה כדי להשיג תמונות של השקופיות לצורך ניתוח. ודא שפרמטרי רכישת תמונה עקביים עבור כל השקופיות.
    הערה: מגדילה אפיתל חייב להבחין בבירור.
  14. התייחס לנוכחות של גדילה כתוצאה בינארית.
  15. לחשב את מספר ממוצע של תאי האפיתל המושתלים שיוצרו ≥ 1 הפטמות הגידול ב 50% של אתרי השתל באמצעות תמונות שנרכשו. בדיקת קוונפיקציה של תכונות פיזיות אחרות, לפי הצורך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בלוטות החלב של התורם והנמען
השלבים כדי לבודד ולהכין את התאים האפיתל החולדה החלב עבור השתלת מוצגים באיור 1א. בגיל 4 שבועות, בלוטת החלב אנדוגניים של עכברוש התורם החלה התבגרות האפיתל ניתן לדמיין על שקופיות רכוב שלם מוכתם ע?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השתלת תאים אפיתל הפטמות האופטימיזציה לעבודה עם חולדות. מבודדים האפיתל הפטמות מבונואידים של חולדות תורם (3-5 שבועות של גיל) הם מושתלים לתוך משטח שומן לבן השכמה של חולדות הנמען (גם 3-5 שבועות של גיל). ניתן לפרש את התוצאות במעט כמו 4-6 שבועות מאוחר יותר, תוך שימוש במיקרוסקופ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי המרכז לסרטן הולנגס של סרטן המרכז תמיכה גרנט P30 CA138313 מחקר הטייס מימון המכון הלאומי לבריאות (https://www.nih.gov/), וכספים מן המחלקה לפתולוגיה &Amp; מעבדה רפואה באוניברסיטת הרפואה של דרום קרוליינה. היינו רוצים להודות למרינה סמית. על שהקליט את הצהרות הראיון

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µM syringe filtersFisher Scientific09-715Gsterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)Fisher Scientific05-408-129containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainersCorning431752filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needlesHamilton81001 & 90525For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette--transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tubeFalcon (Corning)352196brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainersCorning431750filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubesFisher Scientific05-539-6for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishesThermo Scientific130181for mincing tissue
Alum Potassium SulfateSigma-Aldrich243361/237086staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use--follow institutional protocol
Beta-dine or iodine--
Borosilicate glass culture tube for homogenizationFisher Scientific14-961-26for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
CarmineSigma-AldrichC6152/1022staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus--
Clean animal cages for recovery--follow institutional protocol
Collagenase Type 3Worthington Biochemical Corp.LS004183enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water--for chemical solutions
DMEM/F12GIBCO11320033for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA--monodispersion mixture
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone-inactivation solution
Gauze--
Glacial acetic acidFisher ScientificA38-212use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSSGIBCO-monodispersion mixture
Heating pads--follow institutional protocol
Ice buckets (x2)--
Incubator with orbital rotation--must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia--follow institutional protocol
Light microscope or digital camera--visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizerFisher Scientific-TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pureSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer--follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes--
Positively-charged microscope slidesThermo ScientificP4981-001mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic--Institutional protocol
Scalebody weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver--electric clippers, or other
Staining jars--minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapesIMCO4410-IMCused during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)--autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)--for sterile filtration of collagenase digestion media
TrypsinWorthingtonmonodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)--
Wound clip applier, clips, and removal toolFine Science Tools12020-00Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
XylenesFisher ScientificX3S-4clearing mammary gland whole mount slides after staining

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343(1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173(1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7(2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634(1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002(2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved