Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Özet

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Özet

1970'lerin başlarında araştırmacılar, meme epitel hücrelerini farelerin kesiler arası beyaz yağ yastığına başarıyla naklettiler. Transplantasyon teknikleri kullanılarak meme epitelinin aşılanması, ergen kemirgen konaktarafından sağlanan hormonal ortamdan yararlanır. Bu çalışmalar ideal meme bezi gelişimi üzerinde çeşitli biyolojik manipülasyonlar etkisini keşfetmek ve meme bezi biyolojisi birçok yönlerini incelemek için uygundur. Yaygın ama sınırlayıcı bir özellik, nakledilen epitel hücrelerinin çevredeki stromadan güçlü bir şekilde etkilenmesi ve endojen epitelile daha fazla rekabet etmiş olmasıdır; yerli meme dokusu kullanmak için, karın-inguinal beyaz yağ yastığı transplantasyon öncesi ev sahibi meme epitel kaldırmak için temizlenmelidir. Fare modeli organizma kullanırken önemli bir engel post-kesilmiş sıçanlarda gelişmekte olan meme ağacı temizleme verimli değildir. Bezsiz yağ pedleri içine nakledildiğinde, donör epitel hücreleri temizlenmiş konak yağ pedi yeniden doldurmak ve fonksiyonel bir meme bezi oluşturabilirsiniz. Interscapular yağ yastığı bu greftler için alternatif bir yerdir. Önemli bir avantajı, duktal yapılar henüz epitel büyümesini teşvik etmek için gerekli olan ve sıçan kolayca erişilebilir normal stroma sağlar olmasıdır. Bu tekniğin bir diğer önemli avantajı minimal invaziv olmasıdır, çünkü büyüyen endojen meme ağacını kaldırma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, interscapular yağ yastığı aşılama için ayrı siteler için kullanılabilecek bir medial kan damarı içerir. Endojen bezleri bozulmamış kalır çünkü, Bu teknik de nakledilen bezi endojen meme bezi karşılaştırarak çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda farelerin interscapular beyaz yağ yastığı içine meme epitel hücre nakli yöntemi açıklanmaktadır.

Giriş

Postnatal meme bezi gelişimi ve duktal morfogenez büyük ölçüde ergenlik başlangıcında hormonal sinyal etkilenir süreçlerdir. Farelerde ve sıçanlarda, meme bezi biyolojisinin yaygın olarak kullanılan model organizmalar, bu süreç yaş yaklaşık 3 hafta başlar, hızlı çoğalma ve farklılaşma olgun parankim oluşumuile sonuçlanır. Olgun meme bezi genişleme ve involution, erken^20. Hiperproliferasyon ve kanser gelişimi bağlamında, meme bezi transplantasyon teknikleri 1950'lerde geliştirilmiş ve 1977 yılında Gould ve ark. tarafından katkıda kantitatif metodoloji ile geliştirilmiş²,^3,4. Kemirgenlerde transplantasyon tekniğinin iyileştirilmesi, çeşitli tedavilerin ve genetik manipülasyonun normal meme bezi gelişimi ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için hala yaygın olarak kullanılan normal meme bezi biyolojisinin anlaşılmasında önemli ilerlemelere katkıda bulunmuştur.

Birçok hipotez ler üretilmiş ve daha sonra meme bezi nakli kullanılarak test edilmiştir, ilk olarak DeOme ve ark. tarafından 1959^1. Birkaç on yıl boyunca deneyler tüm yağ pedi yeniden doldurmak için donör meme bezleri nden excised duktal doku eğilimi gösterdi^5,6,7 ve meme bezi gelişiminin kritik bir bileşeni bu epitel yapılarda bulunduğunu belirtti. Farelerde daha sonra yapılan çalışmalar, tek bir meme kök hücresi temizlenmiş bir yağ yastığı yeniden doldurmak ve bazal ve luminal meme epitel hücrelerinin tek, ortak atasının keşfine katkıda bulundu gösterdi^8,9,10. Bu sonuçlar doğrultusunda, bu transplantasyon plastisite sonucu multilineage-repopulating potansiyeli ile hücrelerin havuzu artırır, aşılanmış hücrelerin fonksiyonel bir memebezi⁷büyümeye izin,^10,11,12,13olduğu ileri sürülmüştür. Daha da önemlisi, kemirgenlerde transplantasyon tekniklerinin kullanımı hücre kültürüne bağlı anormalliklerin^14'ün sınırlarını aşar ve genellikle sadece birkaç hafta içinde sonuç verir.

Prosedür aslında farelerde preneoplastik lezyonlar bağlamında açıklanan iken, yakında sıçanlara genişletilmiş ve kanser duyarlılığı bir ölçüsü olarak çokluk kurmak için kanserojen tedavi ile birlikte kullanılan¹⁵, ama transplantasyon teknikleri popülaritesi her tür için genetik araçların geliştirilmesi izledi. Transplantasyon içeren fare çalışmaları birçok çeviri bulgular katkıda bulunmuş olsa da, sıçan meme bezinin parankim daha yakından insan benzer^16,17 ve östrojen reseptörü-pozitif çalışma için farklı avantajlar sunuyor (ER +) meme kanseri. Meme tümörleri her iki türde de indükleyicidir, ancak hormon duyarlılığı ve gen ekspresyonu profilleri açısından farklılık gösterirler. Birincil bir fark sıçan meme tümörleri ifade ve yumurtalık ve hipofiz hormon reseptörlerinin işlevine bağlıdır, yani, östrojen ve progesteron (PR), insan meme kanseriluma benzer-A alt tipi. Nitekim, meme epitel hücre nakli, bu protokolde açıklandığı gibi, meme kanseri nde yer genetik varyantları incelemek ve meme epitel hücreleri üzerindeki etkilerihücresel özerkliğini belirlemek için kullanılmıştır¹⁸.

Tümör biyolojisine ek olarak, normal sıçan meme bezinin duktal epitel dallanma daha yüksek bir düzeyde sergiler ve fare daha stroma daha kalın bir tabaka ile çevrilidir. Meme epitelyal transplantasyon çalışmalarında stromanın önemi iyi belgelenmiştir. Meme epitel yağ stroma ile etkileşim gerekir, ve ideal olarak kendi mezenkim, karakteristik morfogenez geçmesi^{için 19,20}. Alıcı meme beziiçine doku aşılama optimal bir ortam sağlar; ancak, endojen epitel varlığı sonuçları etkileyebilir. Endojen epitelin meme bezinin temizlenmesi genellikle fare transplantasyonu tahlillerinde yapılır ve endojen meme dokusunun cerrahi eksizyonu ve/veya meme ucunun çıkarılmasını gerektirir^1,21,22. Mümkün olsa da, post-kesişen sıçanlarda meme epitel preclearing yaygın olarak gerçekleştirilen değildir, özellikle post-kesen sıçanlarda büyüyen meme ağacı temizleme etkisizliği nedeniyle. Vücudun başka bir yerinde yağ dokusu bölgeleri nakledilen meme epitel büyümesini destekleyebilir gösterilmiştir beri^21,23,24, interscapular beyaz yağ yastığı içine doku aşılayarak sıçanlarda preclearing süreci kolayca önlenebilir.

Bu yazıda açıklanan transplantasyon yöntemi enzimatik olarak ayrıştırılmış meme bezi organoidlerinin (meme duktal epitel ve morfogenez yeteneğine sahip diğer hücre tipleri parçaları) veya laboratuvar sıçanlarının inbred, izojenik veya konjenik suşları interskapular yağ yastığı içine monodispersed hücrelerin enjeksiyonu içerir². Interscapular yağ yastığı normalde meme dokusu yoksun olduğundan, endojen epitel önceden temizlemek için gerek kalmadan birden fazla transplantasyon siteleri için uygun bir ortam sağlar. Sonuç olarak, konak hayvanın endojen, abdominal-inguinal meme bezleri cerrahi manipülasyona tabi değildir, normal gelişir ve sonuçların yorumlanmasına engel olamaz. Ayrıca, bozulmamış meme bezleri memmary epitel gelişimi ve tümörigenez^18,25konak karşı donör etkilerini değerlendirmek için karşılaştırma için kullanılabilir. Tek bir kök hücreden meme bezinin repopülasyonfareler için kullanılabilir olmasına rağmen, henüz sıçan için geliştirilmiş değil, özellikle sıçan meme kök hücreleri için seçmek için antikorların durumu eksikliği nedeniyle^25,26,27. Buna rağmen, repopulating potansiyelini ölçmek için monodispersedilmiş meme epitel hücrelerinin nakli başarıyla yapılabilir, ve bu hücreler uygun^çerçeve2,3,⁴aşılı zaman normal gelişecektir . Organoidler birçok amaç için iyi olsa da, monodispersed hücreler kantitatif uygulamalar için gereklidir, örneğin, iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi²⁸ aşağıdaki kanser inisiyasyonu için gerekli meme epitel hücrelerinin sayısını belirlemek için veya akış sitometrik olarak seçilmiş meme epitel hücre popülasyonlarının özelliklerini karşılaştırmak için²⁹.

Bugüne kadar, burada açıklanan prosedür meme bezi gelişimi ve meme kanseri gelişimi altında yatan mekanizmaları çalışma genel bir amacı ile sıçanda meme bezi nakli gerçekleştirmek için en sağlam yöntemdir. Genellikle, donör ve / veya alıcı hayvanlar önce farklı değişkenlere maruz kalan, sırasında veya epitel nakli nden sonra. Örnekler kimyasal karsinogenez içeren tek gen çalışmaları içerir³⁰, radyasyon^28,31,32, konak / donör genom genetik manipülasyon¹⁸, ve hormonal manipülasyon¹². Bu protokolde tanımlanan enzimatik ayrışmanın en önemli avantajı, akış sitometrisi, 3-B kültürü, gen düzenleme ve daha fazlasını içeren tamamlayıcı deneyler için epitel organoidleri veya monodispersi hücreleri izole etme fırsatıdır. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları genetik mühendisliği ile donör ve / veya konak doku ek manipülasyon içerecektir. Örneğin, donör hücreler CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi kullanılarak seçilen herhangi bir genomik lokusta genetik olarak ex vivo değiştirilebilir. Benzer şekilde, alıcı sıçanlar da genetik donör ve alıcı mühendislik genetik faktörler arasındaki etkileşimi incelemek için değiştirilebilir.

Protokol

Tüm hayvanlar AAALAC onaylı bir tesiste barındı ve bakımını aldı ve bu protokolde açıklanan deneyler MUSC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Karşılıklı transplantasyonda kullanılacak hayvanlar, en az 6 nesil boyunca konjenikojenik durum tercih edilen veya backcrossed olan, inbred veya izojenik bir tür olmalıdır.

1. Hasat donör sıçan meme bezi epitel

1. Transplantasyon için gerekli donör sıçan sayısını belirleyin.
   NOT: Genellikle, 1 donör sıçan (4 haftalık yaş) 4 alıcı hayvana transplantasyon için yeterli hücre sağlayabilir. Bu protokolün bazı uygulamaları ek sayıda hücre gerektirir ve toplam verimde gerginliğe özgü farklılıklar olabilir.
2. Tüm malzemeleri etiketle ve cerrah için erişilebilir yerleşimi sağlamak(Tablo 1).
3. Her kadın donör sıçan vücut ağırlığını kaydedin. Donör sıçanı tamamen anestezik veya ötenazi yapmak için kurumsal yönergeleri uygulayın. Parmak ucuna yanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
4. Hayvanı steril cerrahi alana taşıyın. Hayvanı sırtına yerleştirin ve tüm ventral yüzeyini %70 etanol ile püskürtün.
5. Torasik, abdominal ve inguinal meme bezlerine erişim sağlayan sagittal, X şeklinde bir kesi yapın. Makas kullanarak donör sıçan tüm meme bezi dokusu nu sikiksiyon(Şekil 1). Tüm görünür lenf düğümlerini çıkarın.
6. Meme dokusunu forceps kullanarak ayıklayın ve buz üzerinde 60 mm'lik etiketli bir tabağa yerleştirin. 60 mm'lik tabağa 500 μL serumsuz DMEM/F12 ortam ekleyin. Tamamen ıslak kalacak şekilde meme bezi dokusunun yerleşimini ayarlayın.
7. İnce makas kullanarak meme dokusu kıyma. Bunu yapmak için, 1-2 mm³ boyutunda(Şekil 1C)doku kesmek. Tüm donör doku hasat edilene kadar bezi buz üzerinde tutun (60 dakikayı geçmeyin).
   NOT: Ek personel meme bezleri kıyma ve ayrıca cerrah doku ekstraksiyon ile devam ederken kollajenaz çözeltisi hazırlamak.

2. Ötenazi donörlerden beyin dokusu ayıklamak

1. Dikkatli bir şekilde donör hayvanın vücut eğilimli bir pozisyonda yerleştirmek için ters çevirin. İğnelerle sabitle. Sprey baş ve üst sırt% 70 etanol ile.
2. Kafatasının tabanını bulun ve oksipital konilerin altında bir kesi yapın. Derinin altına keskin makas yerleştirin ve başın kenarları da dahil olmak üzere kafatasından deriyi kesin.
3. Kemik kesiciler veya güçlü makas kullanın orta hat boyunca kafatası kesmek için, oksipital frontal kemiklere kadar. Altta yatan beyin dokusunun tahrip önlemek için mümkün olduğunca yüzeysel ve açı yukarı bıçak tutun.
4. Rongeurs veya güçlü forceps kullanarak uzak kemik soyma. Her iki tarafta kemik kırmak için beyincik lateral aracı ekleyin, kemik işitsel kanal açığa. Menenjitlerle olan bağlantılarını kes.
5. Kavisli, ince uçlu forsepslerle beyni hafifçe kaldırın. Beyni folyo parçasına yerleştirin ve ağırlığı kaydedin ve hemen 15 mL'lik bir tüpe eşit miktarda (w:v) ortam ile buz üzerinde depolanan bir tüpe aktarın.
   1. İsteğe bağlı olarak, gerekirse nakil prosedüründe ek kullanım için hipofiz bezini (beynin altında bulunan) çıkarmak için ince uçlu forseps kullanın.
6. Doku bozmak için mekanik bir homogenizer kullanın. Düşük hızda 10-15 s için beyin homojenize. Karışımı en az 1 dakika buz üzerinde oturup ve daha sonra tekrar homojenize edelim. Son karışım büyük parçalardan arındırıldığında homojenizasyon yeterlidir.
7. Homojeni 100 μm'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin. Kullanıma kadar (en az 4 saat) buz üzerinde filtrat tutun.

3. Meme bezi özlerinin sindirimi ve işlenmesi

1. Belirtildiği gibi çözülme veya sıcak reaktifler (Tablo 1). Organoidler veya monodispersed hücreleri kurtarmak için uygun adımları izleyin.
2. Her donör hayvan için 10 mL serumsuz sindirim ortamı (kollajenaz olmadan) hazırlayın(Ek Dosya 1).
   NOT: Kullanılan sindirim ortamının hacmi, varsa gruplanmış dokuya uyum sağlayacak şekilde ayarlanabilir (yukarı veya aşağı ölçeklenebilir).
   1. Organoidler için 3.3 atlamak.
   2. Monodispersed hücreler için, serumsuz kollajenaz sindirim ortamına ek olarak taze Monodispersiyon Karışımı ve İnaktivasyon Solüsyonu(Ek Dosya 2, Ek Dosya 3)hazırlayın. Adım 3.3'e geçin.
3. Donörlerden tüm meme dokusu ayıklanmış ve kıyılmış olduğunda, sıcak kollajenaz enzimi ekleyin (veya oda sıcaklığında) sindirim ortamı(Ek Dosya 1). Ters çevirerek karıştırın.
4. Kollajenaz sindirim ortamını 20 μm'lik bir filtreden geçirin. Sindirim için etiketli 50 mL tüplerde 10 mL filtreli ortam dağıtın.
5. Her numune için yeni bir 1.000 μL pipet ucu kullanın ve her 60 mm çanak kıyma donör doku kolajenaz sindirim tüpü ne aktını transfer. 1.000 μL'lik bir ucun ucundan 1 cm kesin ve kullanmadan önce el ile cihaza yerleştirin. Kıymalı dokuyu 1-2 kez yukarı ve aşağı borulandırarak hafifçe karıştırın.
   NOT: Transfer sırasında dokuda pipet zorsa, 50 mL tüpten küçük miktarda kollajenaz sindirim ortamı kullanın ve sonra geri aktarın.
6. Numuneleri sallayarak bir kuvözde yatay konuma yerleştirin ve numunelerin 37 °C, 200-220 rpm'de 1,5-2 saat sindirmesine izin verin.
   1. Organoidler için 3.7 atlamak.
   2. Monodispershücreler için sindirimin son 10 dakikası için karışıma DNase I (0.2 μg/mL) ekleyin. Daha önce olduğu gibi inkübül, güçlü sallayarak. Adım 3.7'ye geçin.
7. Doku tamamen sindirildiğinde, 1200 x g (Şekil 1D)10 dk için soğuk santrifüj (4 °C) kullanarak süspansiyon pelet.
   NOT: Hücrelerin canlılığını artırmak için her adım arasında buz tüpleri tutun.
8. Bir pelet oluşmuş olduğundan emin olun ve sonra dikkatle supernatant ve yağ tabakası dökün. Taze DMEM/F12 medyasında 10 mL'lik peleti yavaşça askıya alın.
9. Yaklaşık 10 s için 68 x g'de kısaca döndürün. Hücrelerin net bir ayrımı yoksa dönüş uzunluğu (ancak hızı değil) artabilir. Devam etmeden önce peleti görsel olarak inceleyin (Şekil 1D).
10. Küçük bir hacim geride bırakarak, dikkatle supernatant çıkarın. Organoidlerin veya monodispersi hücrelerin gerekli olup olmadığına bağlı olarak bir sonraki adıma geçin.
    NOT Pelet çok gevşek olacağından tüpte küçük bir hacimde ortam bırakmak önemlidir. Ortam artık hacmi yıkama adımları ile seyreltilir.
    1. Organoidler için 10 mL'lik bir DMEM/F12 ortamı daha ekleyin ve yıkama/döndürmeyi tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, filtreleme için DMEM/F12 media'nın daha küçük bir hacimde (1-2 mL) hücreleri yeniden askıya alın. Adım 3.11'e geçin.
    2. Monodispersedilmiş hücreler de %0.025 (w/v) Tripsin ve 6.8 mM EDTA ile önceden ısıtılmış HBSS'nin 2 mL'sinde çözünür. 37 °C'de 3-5 dk sindirin. Hemen etkinleştirin.
       1. Trypsin'i inaktive etmeyi durdurmak için %10 FBS ile 4 mL DMEM/F12 ekleyin.
       2. Hücreleri 270 x g'de 5 dk verin ve dmem/F12'de tekrar %10 FBS ile yeniden askıya alın. Hücreleri filtrelemek için adım 3.11'e geçin.
11. Hücreleri yeni bir 50 mL tüpe yerleştirilen 40 μm'lik hücresüzsüz kullanarak filtreleyin. Hücreleri askıya almak için kullanılan aynı baz ortamının 1 mL'ini boruile ıslatarak süzgeci önceden ıslatın ve kanal parçaları/organoidleri toplamak için bir pipet kullanarak hücre süspansiyonundan filtreden geçirin.
    NOT: Tek, 4 haftalık donör bir sıçanın meme bezi dokusundan filtrelenmiş epitelin yaklaşık verimi 1 x 10⁶ hücredir.
    1. Organoidler için, filtrat atın. Meme organoidleri hücre süzgeci sepet içinde kalacak ve daha küçük, istenmeyen hücreler ortadan kaldırılacak. Hücre süzgecini yeni bir 50 mL tüp üzerinden ters çevirin ve hücreleri toplamak için gerekli olan herhangi bir hacimle durulayın. Adım 3.12'ye geçin.
    2. Monodispersed hücreler için, hücre süzgeci atın ve meme epitel hücreleri filtre geçecek, çünkü filtrat tutmak, küçük stromal ve bağışıklık hücreleri ile birlikte. Sindirim/santrifüj için kullanılan tüpü %10 FBS ile dmem/F12 hacmi ile durulayın ve aynı hücresüzden geçirin. 5 dk. 1.200 x g santrifüj ile monodispersed hücreleri pelet.
       NOT: Askıya alınan hücreler sonraki uygulamalar için hazırdır.
12. Darbe çözeltiyi döndürün ve bir sonraki adıma geçmeden önce bir hücre peletinin oluşumunu sağlayın. Gerekirse nabız tekrar döner.
13. Dikkatle supernatant çıkarın. Küçük bir hacimde (1.000-2.000 μL DMEM/F12) hücreleri saymak için konsantre etmek için peleti yeniden askıya alın.
14. Hücreleri sayın ve gerekirse seyreltin. Her hayvan için 20 μL DMEM/F12 media transplantasyonu için istenilen sayıda hücreyi yeniden askıya alın. Hücreleri her zaman buzda tut.
    NOT: Her greft bölgesi için çalışmanın son noktasına göre 1 x 10⁵ - 1 x 10⁶ hücre aralığında donör hücre sayıları gerekecektir. Örneğin, karsinogenez deneyleri genellikle diğer uygulamalara göre daha fazla sayıda nakledilen hücre gerektirir. Her türiçin gerekli hücre sayısı deneysel olarak belirlenmelidir. Bu protokolde tanımlanan prosedür, 3.16'da açıklandığı gibi beyin homojenate ile karıştırmadan önce greft yeri başına 20 μL medyada 250.000 donör hücresi kullanmaktadır.
15. Diğer deneyler için gerekli olan hücrelerin aliquot(lar)ını hazırlayın (örn. FACS izolasyon^{3,26,27,30,33}).
    1. Organoidler için 3.16.adıma geçin.
    2. Monodispers hücreler için, Trypan veya metilen mavisi boyama kullanarak canlı hücreleri ölçün ve sonra devam edin.
16. Tüm nakil alıcıları için tek bir yığın donör malzeme hazırlayın. Hücre süspansiyonunun eşit hacimlilerini (20 μL) her transplantasyon bölgesi için %50 beyin homojeni (20°L) ile birleştirin.
    NOT: Her siteye saha başına toplam 40°L enjekte edilecektir, ancak atıklar için en az %25 ekstra hacim dahil edilmesi önerilir.
17. Hemen transplantasyon veya daha sonra (potansiyel durdurma noktası) transplantasyon için hücreleri dondurmaya devam edin.
    NOT: Dondurulmuş hücreler bu protokol ile test edilmemiştir ve transplantasyon deneyleri için bir hayvan kohortu oluşturmadan önce optimizasyon gerektirir. Bu kuvvetle taze hücrelerin nakli için tavsiye edilir.

4. Transplantasyon prosedürü (alıcı sıçanlar 4-5 haftalık)

1. Her alıcı sıçan tartmak ve prosedürde kullanılacak onaylı analjezik doğru dozu hesaplamak.
   NOT: Vücut ağırlıkları işlemden 24 saat önce ölçülebilir. Tıraş süresince her hayvanı dizginlemek veya kısaca anestezik etmek için kurumsal yönergeleri izleyin.
2. Elektrikli makasları kullanarak her hayvanın cerrahi alanını tıraş edin. Kafatasının tabanını belirleyin ve vertebral sütunun başlangıcını başlatın. Omurganın yaklaşık üçte biri, sırtın üst torasik kısmında 3 cm x 2 cm'lik bir alanı tıraş eder.
   NOT: Tıraş, transplantasyon günü anestezi altında da yapılabilir, ancak steril alan dışında yapılmalıdır. Gerekli olana kadar fareyi ev kafesine geri getirin.
3. Transplantasyon için gerekli tüm malzemeleri bulun (Tablo 1).
4. Kullanmadan önce Laboratuvar Hayvan Anestezi Sistemini değerlendirin. Herhangi bir sıvı top up ve gerekli herhangi bir tank veya parçaları değiştirin. Anestezi odasına giden gaz hattının açık olduğundan ve tüm çevre hatlarının kapalı olduğundan emin olun, böylece isofluran anestezi ve oksijen odaya yerleştirildikten sonra hayvana serbestçe akabilir.
5. Alıcı hayvanların vücut ısısını desteklemek için Sıcak ısıtma pedleri.
6. Ameliyat için kullanılacak steril alanı oluşturun. Tablo 1'deaçıklandığı gibi malzemeleri düzenleyin.
7. Kurumsal olarak onaylanmış hayvan bakım protokolünde belirtildiği gibi alıcı sıçanlara ameliyat öncesi analjezik uygulayın.
8. Hamilton şırıngalarını steril DMEM/F12 ortamlarıyla yıkayın ve hücre kaybını önleyin. İğnenin şırınganın gövdesine sabitolduğundan emin olun, iğneyi sıvının içine yerleştirin ve pistonu geri çekin. Maksimum ses düzeyine doldurun. Pistonu bastırın ve içindekileri bir atık toplama tüpüne atın. 3-5 kez tekrarlayın.
9. Donör malzemenin tüm hacmini (adım 3.16'da hazırlanmış) her durum için ayrı bir şırıngaya yükleyin (örn. kontrol, işlenmiş, vahşi tip, nakavt, vb.). İğneucunu sıvıya takın, pistonu geri çekin ve tüpteki hacim azaldıkça iğneyi karışımın yüzeyinin altında tutun.
   NOT: Her şırıngaya en az %10 ekstra hacim ekleyin. Kalan karışımı atmayın tüpü kapatın ve daha fazla ihtiyaç olması durumunda buzüzerinde tutun.
10. Şırıngayı tamamen yüklendikten sonra ters çevirin ve iğnenin ucundaki hava kabarcıklarını çıkarmak için pistonuna hafifçe basın. Her şey hazır olduğunda bir sonraki adıma geçin.
    NOT: İğneucunun steril alan içinde bile başka bir yüzeye dokunmadığından emin olun. Bu hücrelerin canlılığını teşvik etmek için buz küçük bir kap üzerinde şırınga vücut dinlenmek için yararlıdır.
11. Alıcı hayvanı anestezi odasına yerleştirin ve makineyi açın.
12. Hayvan tamamen rahatladığında (odanın dokunmasına veya nazik hareketine tepki vermez), anesteziyi burun konisine yönlendirin ve hayvanı steril alana aktarın.
    NOT: Anestezisüresinin uzatılması sıçanlar tarafından iyi tolere edilmez. 10 dakika veya daha az her hayvan için prosedürü tamamlayın.
13. Baş ın arkasına ve üst omurgaya ulaşılabilmesi için hayvanı (midesi üzerinde) yatkın bir konuma yerleştirin.
    NOT: Hayvan için her zaman yeterli ısı desteği sağlamak ve düzenli olarak sağlam bir ayak ucurması kullanarak anestezi derinliğini değerlendirmek.
14. İsteğe bağlı olarak, gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik veteriner merhemuygulayın.
15. Fazla tüyleri gidermek için taze tıraş lı bölgeyi temizleyin. Dairesel bir hareket kullanın ve cilde %70 etanol (veya kurumsal kurallara göre başka bir reaktif) uygulayın, ardından bir antiseptik (iyot gibi) uygulayın ve tekrarlayın. Hayvanın üzerine bir havlu örtü yerleştirin, böylece sadece tıraş alanı için bölge ortaya çıktı.
16. Hayvan ın derin uyaranlara karşı tepkisiz kaldığından emin olun ve bir sonraki adıma geçin.
17. Keskin bir cerrahi bıçak kullanarak küçük bir (2 cm) interscapular kesi yapın.
    NOT: Yağ yastığı derinin hemen altında yer almaktadır gibi kesim yüzeysel olmalıdır.
18. Oryantasyon için medial kan damarını bulun (Şekil 2B).
19. İnzonun bir tarafındaki deriyi forseps kullanarak kaldırın ve nakil yapılırken yağ yastığından uzak tutun(Şekil 2B). İğneyi greft bölgesine yerleştirin.
    1. İsteğe bağlı olarak, doku içinde iğne ucu hareket ve hücreleri toplamak için küçük bir cep oluşturmak. Küçük, tekrarlayan bir hareket kullanın. İğneyi çıkarmayın.
       NOT: Bu adım protokolü ilk kez kullananlar için önerilir. Interscapular yağ yastığı dokusu çok hassas olduğu gibi, bir cep oluştururken aşırı dikkatli kullanın.
20. Hücre karışımının 40 μL'sini interskapular yağ yastığı dokusuna dikkatlice enjekte edin. İğneyi yavaşça çıkar.
21. Yerinde doku tutun ve nakledilen hücrelerin 3-5 s yerleşmek için izin. Gerekirse forseps ek bir çift kullanın.
22. İğneyi çıkar. İkinci nakil yerinde enjeksiyon işlemini (4.18-4.21 adımları) tekrarlayın.
    NOT: Bir donör grubundan epitel, cerrahın el hakimiyetinden kaynaklanan toplu etkileri önlemek için her hayvandaki yağ yastığının aynı tarafına veya alternatif kenarlara enjekte edilebilir.
23. Yara klipleri veya dikişler kullanarak cerrahi yarakapatın ve sonra anestezi durdurun.
24. Kurumsal olarak onaylanmış protokolde belirtildiği gibi postoperatif analjezik sağlayın.
25. Hemen ısı desteği ile bir kurtarma kafesine hayvan taşıyın. Kesiden kanama veya nefes almada sorun gibi sıkıntı belirtileri için monitör.
    NOT: Hayvan 5-10 dakika içinde tamamen iyileşir.
26. İsteğe bağlı olarak, transplantasyondan 3-4 hafta sonra alıcı sıçanlara kanserojen madde uygulayarak greft yerinde karsinogenez çalışmaları yapın.
    NOT: Tipik olarak sıçan meme kanserinezezisi 50-57 günlük kenlerde kimyasal kanserojen tedavi ile yapılır. Bu tedavi, greftli hücrelerin meme bezinin büyümesini başlatmak için yeterli zaman sağlamak için nakil ameliyatının yaşını (29-36 gün arasında yapılması gereken) belirler.

5. Epitel büyümenin değerlendirilmesi

1. Günlük vajinal lavaj yoluyla farelerin estrus döngüsünü izlemek ve bir mikroskop slayt üzerinde sitoloji incelemek. Çalışmanın bitiş noktasından 8-12 gün önce başlayın. Tüm fareleri aynı sahnede kurban edin. Bu isteğe bağlı bir adımdır.
   NOT: Sıçan estrus döngüsü 4-5 gündür. Önceki döngülerden lavaj slaytlar karşılaştırma için kullanılabilir gibi hayvan 1-2 tam döngüleri geçmesine izin, yorumlama kolaylaştıracaktır.
2. Kurban nakli alıcısı, naklinden 6-8 hafta sonra, kurumsal kurallara göre.
   NOT: Büyüme genellikle transplantasyondan 3-6 hafta sonra saptanabilir, ancak ek süre gerekebilir.
3. Hayvanı yatkın bir pozisyonda yerleştirin ve vücudu %70 etanol ile temizleyin. Forseps ile deri kaldırın ve interscapular yağ yastığı ortaya çıkarmak için vertebral sütun boyunca bir kesi yapmak. Yağ yastığının büyük bir kısmı görünür olacak şekilde cildi dokudan ayırın.
4. Interskapular yağ yastığında greft bölgelerini ayıran medial kan damarını belirleyin. Doku tek bir parça olarak tüm ped excise veya kan damarı boyunca kesilmiş ve ayrı ayrı yanları çıkarın.
5. Tüm montaj için pozitif yüklü mikroskop slayt üzerine doku yerleştirin. Künt forseps 2 çift kullanın ve yavaşça slayt üzerinde orijinal konformasyon geri doku yayıldı.
   NOT: Sıçan meme dokusu son derece hassastır. Dokunun kenarları kendi altında kıvrılabilir. Doku slayta yapışana kadar (birkaç saniye) her zaman dikkatli bir şekilde tutun ve yerinde tutun.
6. Tam montaj endojen abdominal-inguinal meme bezlerinin en az biri (oryantasyon için lenf düğümleri ile) karşılaştırma için.
7. Doku defat için 7-10 gün boyunca% 70 etanol slaytlar yerleştirin. Doku kuruması değil sağlamak için gerekli sıklıkta etanol doldurmak.
8. Şap-karmin lekesi hazırlayın ve doku yeterince opak olduğunda slaytları işlayın. Kullanmadan önce lekenin soğumasına izin verin (Ek Dosya 4).
   NOT: Leke fiksasyon ve rehidrasyon adımlarından bir gün önce hazırlanabilir. Çözelti 4 °C'de saklanabilir ve yeniden kullanım için sınırlı potansiyele sahiptir.
9. % 25 buzul asetik asit slaytlar yerleştirerek doku düzeltmek : 60 dakika için% 75 etanol.
   1. Etanol konsantrasyonu azalan bir dizi 3 yıkar bir dizi doku rehydrate: 15 dakika için% 70 etanol, 5 dakika için% 50 etanol ve 5 dakika için dH₂O.
10. 4-8 gün boyunca şap karmin ile leke. Lekenin dokuya tamamen girip girmediğini belirlemek için her gün slaytların arkasını kontrol edin. Boyama tamamlandığında bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Bezin en kalın kısımları mor bir tona sahip olduğunda ve artık beyaz görünmediğinde boyama tamamlanır.
11. Destain ve etanol artan konsantrasyonu bir dizi slaytlar aktararak doku dehydrate: 30 dakika için% 70 etanol, 30 dakika için% 95 etanol ve 30 dakika için% 100 etanol.
12. Dokuyu temizlemek için 3+ gün boyunca susuz slaytları ksilene yerleştirin. Uzun süreli depolama için mineral yağa aktarın.
13. Slaytlar temizlendikten sonra, analiz için slaytların görüntülerini elde etmek için düşük güçlü ışık mikroskobu veya yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf kullanın. Görüntü edinme parametrelerinin tüm slaytlar için tutarlı olduğundan emin olun.
    NOT: Epitel büyümesi açıkça ayırt edilebilir olmalıdır.
14. Büyümenin varlığını ikili bir sonuç olarak ele alın.
15. Elde edilen görüntüleri kullanarak greft bölgelerinin %50'sinde ≥1 meme büyümesi üreten ortalama nakledilen epitel hücrelerinin sayısını hesaplayın. Gerektiğinde diğer fiziksel özellikleri niteleme.

Sonuçlar

Donör ve alıcı meme bezleri
Sıçan meme epitel hücrelerini organ nakli için izole etme ve hazırlama adımları Şekil 1A'dagösterilmiştir. 4 haftalık ken, donör sıçan Endojen meme bezi olgunlaşma başladı ve epitel alum karmin ile boyanmış tüm monte slaytlar üzerinde görüntülenebilir (Şekil 1B). Bu yaştaki bir donör sıçan...

Tartışmalar

Bu protokol, sıçanlarla çalışmak için optimize edilmiş bir meme epitel hücre nakli tekniğini tanımlar. Donör sıçanlardan izole edilmiş meme epitel organoidleri (3-5 haftalık yaş) alıcı sıçanların interskapular beyaz yağ yastığına (ayrıca 3-5 haftalık) aşılanır. Sonuçlar 4-6 hafta sonra, aşılı dokuyu incelemek için ışık mikroskobu kullanılarak yorumlanabilir; ancak, tam bir deney uygulamadan önce transplantasyon ve kurban arasında en uygun süre belirlenmelidir. Çok az veya çok f...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM syringe filters	Fisher Scientific	09-715G	sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)	Fisher Scientific	05-408-129	containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers	Corning	431752	filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles	Hamilton	81001 & 90525	For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette	-	-	transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube	Falcon (Corning)	352196	brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers	Corning	431750	filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes	Fisher Scientific	05-539-6	for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes	Thermo Scientific	130181	for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate	Sigma-Aldrich	243361/237086	staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use	-	-	follow institutional protocol
Beta-dine or iodine	-	-
Borosilicate glass culture tube for homogenization	Fisher Scientific	14-961-26	for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine	Sigma-Aldrich	C6152/1022	staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus	-	-
Clean animal cages for recovery	-	-	follow institutional protocol
Collagenase Type 3	Worthington Biochemical Corp.	LS004183	enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water	-	-	for chemical solutions
DMEM/F12	GIBCO	11320033	for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA	-	-	monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2705/2701	mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	-	inactivation solution
Gauze	-	-
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS	GIBCO	-	monodispersion mixture
Heating pads	-	-	follow institutional protocol
Ice buckets (x2)	-	-
Incubator with orbital rotation	-	-	must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia	-	-	follow institutional protocol
Light microscope or digital camera	-	-	visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer	Fisher Scientific	-	TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure	Sigma-Aldrich/ ACROS Organics	8042-47-5	long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer	-	-	follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes	-	-
Positively-charged microscope slides	Thermo Scientific	P4981-001	mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic	-	-	Institutional protocol
Scale			body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver	-	-	electric clippers, or other
Staining jars	-	-	minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes	IMCO	4410-IMC	used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)	-	-	autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)	-	-	for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin	Worthington		monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)	-	-
Wound clip applier, clips, and removal tool	Fine Science Tools	12020-00	Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes	Fisher Scientific	X3S-4	clearing mammary gland whole mount slides after staining