大鼠乳腺内皮细胞移植到间膜白脂肪垫

摘要

本文介绍了一种移植方法，将供体大鼠乳腺上皮细胞移植到受体动物的细胞间白脂肪垫中。该方法可用于检查宿主和/或供体对乳腺上皮发育的影响，并消除预清除的需要，从而扩展了此技术的实用性。

摘要

早在20世纪70年代，研究人员就成功地将乳腺上皮细胞移植到大鼠的间膜白色脂肪垫中。使用移植技术移植乳腺上皮，利用青春期啮齿动物宿主提供的荷尔蒙环境。这些研究非常适合探索各种生物操作对乳腺发育的影响，并剖析乳腺生物学的许多方面。一个常见但有限的特征是，移植的上皮细胞受到周围频闪的强烈影响，并且被内源上皮竞争;为了利用本地乳腺组织，必须在移植前清除腹腔白色脂肪垫以去除宿主乳腺上皮。使用大鼠模型生物体的一个主要障碍是，清除在绝育后大鼠中发育的乳腺树是无效的。当移植到无腺脂肪垫中时，供体上皮细胞可以重新填充清除的宿主脂肪垫，形成功能性乳腺。隔膜脂肪垫是这些移植物的替代位置。一个主要的优势是，它缺乏导管结构，但提供了正常的频闪，这是促进上皮外生长所必需的，很容易在大鼠中访问。这种技术的另一个主要优点是，它是微创的，因为它消除了烧灼和去除生长的内源性乳腺树的需要。此外，隔膜脂肪垫包含一个中血管，可用于分离移植部位。由于内源性腺体保持不变，该技术也可用于将内源性乳腺与移植腺体进行比较的研究。本文介绍了乳腺上皮细胞移植到大鼠的间膜白脂肪垫中的方法。

引言

产后乳腺发育和导管形态形成是青春期开始时主要受荷尔蒙信号影响的过程。在小鼠和大鼠中，通常使用的乳腺生物学模型生物，这个过程开始于大约3周的年龄，快速增殖和分化导致成熟乳腺的形成。成熟的乳腺可以经历无数次的扩张和进化，自20^世纪初以来，这种财产一直在被调查。在高增增和癌症发展的背景下，乳腺移植技术在20世纪50^年代发展，并在1977^年古尔德等人贡献的定量方法^增强。啮齿动物移植技术的完善，有助于在理解正常乳腺生物学方面取得重大进展，这些生物学仍被广泛用于研究各种治疗和基因操作对正常乳腺发育和疾病状态的影响。

许多假设已经产生，随后测试使用乳腺移植，第一次由DeOme等人描述在1959^年1。数十年的实验表明，从供体乳腺切除的导管组织倾向于重新填充整个脂肪垫^5，6，7，并表明乳腺发育的一个关键成分存在于这些上皮结构。后来对小鼠的研究表明，单个乳腺干细胞可以重新填充一个清除的脂肪垫，并有助于发现一个单一的，共同的祖细胞的基础和发光乳腺上皮细胞^{8，9，10。}根据这些结论，有人建议移植增加具有多系再生潜力的细胞池，由于可塑性，使移植细胞生长功能性乳腺7，10，11，12，13。重要的是，在啮齿动物中使用移植技术克服了细胞培养引起的异常的局限性^14，而且往往在短短几周内就产生结果。

虽然这个程序最初是在小鼠前体病变的背景下描述的，但很快又扩展到了大鼠，并结合致癌物治疗，建立了多种性，作为癌症易感性的衡量标准^，但移植技术的普及伴随着每个物种遗传工具的发展。虽然结合移植的小鼠研究提供了许多转化性发现，但大鼠乳腺的乳腺瘤与人类更相似^{，与16、17}号相似，为研究雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌提供了明显的优势。乳腺肿瘤在这两个物种中都具有诱导性，但它们在激素敏感性和基因表达谱方面有所不同。主要区别是大鼠乳腺肿瘤表达和依赖于卵巢和垂体激素受体的功能，即雌激素和孕激素 （PR），类似于人类乳腺癌的 Luminal-A 亚型。事实上，乳腺上皮细胞移植，如本议定书所述，已用于研究涉及乳腺癌的基因变异，并确定细胞自主性对乳腺上皮细胞的影响^18。

除了肿瘤生物学，正常大鼠乳腺的导管上皮表现出更高的分枝水平，并侧翼比小鼠更厚的频闪层。在乳腺上皮移植研究中，频闪的重要性得到了很好的记录。乳腺上皮必须与脂肪性血质相互作用，理想情况下，它自己的美感，以经历其特有的形态形成^19，20。将组织移植到受体乳腺中提供最佳环境;然而，内源上皮的存在会干扰结果。预清除内源上皮的乳腺通常在小鼠移植测定中进行，需要手术切除内源性乳腺组织和/或切除奶嘴^{1、21、22。}虽然有可能，预清除绝育后大鼠的乳腺上皮并不广泛，主要是因为在戒除后大鼠中清除生长的乳腺树无效。由于已经表明，在身体的其他部位的脂肪组织区域可以支持移植的乳腺上皮^21、23、24的生长，因此通过在体间白色脂肪垫中移植组织，在大鼠中很容易避免预清除的过程。

本文所述的移植方法涉及将酶分离的乳腺腺体（乳腺导管上皮和其他能够变形的细胞类型的碎片）或单分散细胞注射到实验鼠^2的近亲繁殖、异体或共基因菌株的间状脂肪垫中。由于体间脂肪垫通常没有乳腺组织，它为多个移植部位提供了合适的环境，而无需预先清除内源性上皮。因此，宿主动物的内源性、腹内性乳腺不受手术操作，发育正常，不能干扰结果解释。此外，完整的乳腺可用于比较，以评估宿主与捐赠者对乳腺上皮发育和肿瘤发生的影响^18、25。虽然从单个干细胞中重新填充乳腺可供小鼠使用，但尚未为大鼠开发，主要原因是缺乏为大鼠乳腺干细胞选择抗体25、26、27。尽管如此，单分散的乳腺上皮细胞的移植可以成功地进行，并且这些细胞将正常发育时移植到适当的框架^2，3，4。虽然有机物适合多种用途，但定量应用需要单分散细胞，例如，确定电离放射治疗后癌症启动所需的乳腺上皮细胞数量^，或比较流细胞选择乳腺上皮细胞群的特性²⁹。

迄今为止，这里描述的手术是大鼠进行乳腺移植的最强有力的方法，其总体目标是研究乳腺发育和乳腺癌发展背后的机制。通常，供体和/或受体动物在上皮移植之前、期间或之后会接触到不同的变量。例子包括涉及化学致癌物³⁰的单基因研究，辐射28，31，32，宿主/供体基因组¹⁸的基因操作，和荷尔蒙操纵^12。本协议中描述的酶分离的一个主要优点是有机会分离上皮有机体或单分散细胞，进行包括流式细胞学、三维培养、基因编辑等的补充实验。该技术的未来应用将包括对供体和/或宿主组织进行遗传工程的额外操作。例如，供体细胞可以使用CRISPR-Cas9基因编辑系统在任何选定的基因组位点进行基因改造。同样，接受者大鼠也可以进行基因改造，以研究供体和受体工程遗传因素之间的相互作用。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

所有动物都被安置在AAALAC批准的设施中，该协议中描述的实验得到了MUSC机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。用于互惠移植的动物应为近亲繁殖或异种菌株，具有优选或背交至少6代优异的优生状态。

1. 收获供体大鼠乳腺上皮

1. 确定移植所需的供体大鼠数量。
   注:一般来说，1只供体大鼠（4周龄）可以提供足够的细胞，用于移植到4个受体动物中。该协议的某些应用将需要额外的细胞数量，并且在总产量上可能有特定于应变的差异。
2. 标记所有用品，并确保外科医生可进入位置（表1）。
3. 记录每只雌性捐赠大鼠的体重。遵循机构准则，对供体大鼠进行完全麻醉或安乐死。检查麻醉的深度，因为对脚趾捏没有反应。
4. 将动物移到无菌手术场。将动物放在其背上，用70%乙醇喷洒整个腹腔表面。
5. 做一个下垂，X形切口，允许进入胸腺，腹部和内脏乳腺。用剪刀从供体大鼠中切除所有的乳腺组织（图1）。删除所有可见的淋巴结。
6. 用钳子提取乳腺组织，放在冰上标有60毫米的盘子中。在 60 mm 盘中加入 500 μL 无血清 DMEM/F12 介质。调整乳腺组织的位置，使其保持完全湿润。
7. 用剪刀细切乳腺组织。为此，将组织切成 1-2 mm³大小的块（图 1C）。将腺体保持在冰上，直到所有供体组织被收获（不超过60分钟）。
   注:额外的人员可以分块乳腺，并额外准备胶原酶溶液，而外科医生继续进行组织提取。

2. 从安乐死捐赠者中提取脑组织

1. 小心地将捐赠动物的身体翻过来，使其处于易发位置。用针固定。用70%乙醇喷洒头部和上背部。
2. 找到头骨的底座，并在颅骨下切开一个切口。在皮肤下方插入锋利的剪刀，将皮肤从头骨上切开，包括头部的两侧。
3. 使用骨刀或强力剪刀沿中线切割头骨，从骨骼到前骨。保持刀片尽可能浅，并向上倾斜，以防止潜在的脑组织的破坏。
4. 用龙骨或强力钳子剥去骨头。将工具横向插入小脑，以折断两侧的骨骼，露出骨质听觉管。切断与脑膜炎的连接。
5. 用弯曲的细尖钳子轻轻抬起大脑。将大脑放在一块箔上并记录重量，然后立即转移到一个15 mL的管子上，管子的量（w:v）相同，储存在冰上。
   1. 可有，如果需要，使用细尖钳去除脑垂体（位于大脑下方），用于移植过程中的额外用途。
6. 使用机械均质器破坏组织。在低速下使大脑均匀化10-15。让混合物在冰上至少坐1分钟，然后再次均匀化。当最终混合物没有大块时，均质就足够了。
7. 通过 100 μm 过滤器过滤均质。将滤液保存在冰上，直到使用（小于 4 小时）。

3. 乳腺提取物的消化和处理

1. 如所示解冻或加热试剂（表1）。按照适当的步骤恢复有机物或单分散细胞。
2. 为每个供体动物准备10mL无血清消化培养基（不含胶原酶）（补充文件1）。
   注:使用消化介质的体积可以调整（向上或向下）以适应分组组织（如果适用）。
   1. 对于有机物，跳到3.3。
   2. 对于单分散细胞，除了无血清胶原酶消化介质外，还制备新鲜的单分散混合物和失活溶液（补充文件2，补充文件3）。继续步骤 3.3。
3. 当从捐赠者的所有乳腺组织被提取和切碎时，将胶原酶加入温暖（或室温）消化介质（补充文件1）。通过反转进行混合。
4. 通过20μm过滤器将胶原酶消化介质传递。在标有 50 mL 的管中分配 10 mL 的过滤介质，以便消化。
5. 为每个样品使用新的 1，000 μL 移液器尖端，并将切碎的供体组织从每个 60 mm 盘中转移到胶原酶消化管。将 1，000 μL 尖端末端的末端切 1 厘米，并在使用前手动将其放在设备上。通过上下移液1-2次，轻轻混合切碎的组织。
   注:如果组织在转移过程中难以移液，则使用50 mL管中的少量胶原酶消化介质，然后将其转移回。
6. 将样品置于摇动培养箱的水平位置，让样品在37°C、200-220 rpm下消化1.5-2小时。
   1. 对于器官跳到3.7。
   2. 对于单分散细胞，在消化的最后10分钟将DNase I（0.2μg/mL）添加到混合物中。像以前一样孵育，剧烈摇晃。继续步骤 3.7。
7. 当组织完全消化时，使用冷离心（4 °C）在1，200 x g下将悬浮液颗粒10分钟（图1D）。
   注:在每一步之间将管子放在冰上，以增加细胞的生存能力。
8. 确保颗粒已经形成，然后小心地倒出上清液和脂肪层。在 10 mL 的新鲜 DMEM/F12 介质中轻轻重新悬浮颗粒。
9. 以 68 x g短暂旋转约 10 s。如果没有细胞的明确分离，旋转的长度（但不是速度）可能会增加。在继续操作之前目视检查颗粒 （图 1D）。
10. 小心地取出上清液，留下一个小体积。继续下一步，根据是否需要有机物或单分散细胞。
    注意:在管中留下少量介质很重要，因为颗粒会非常松弛。介质的剩余体积将通过洗涤步骤稀释。
    1. 对于有机体，再添加 10 mL 体积的 DMEM/F12 介质，然后重复洗涤/旋转。第二次清洗后，将细胞重新悬浮在DMEM/F12介质的较小体积（1-2 mL）中进行过滤。继续步骤 3.11。
    2. 对于单分散细胞，溶解在2 mL的预加热HBSS与0.025%（w/v）胰蛋白酶和6.8 mM EDTA。在37°C下消化3-5分钟。立即停用。
       1. 添加 4 mL 的 DMEM/F12，带 10% FBS 以停止停用胰蛋白酶。
       2. 以 270 x g旋转单元格 5 分钟，然后在 DMEM/F12 中再次以 10% FBS 重新悬浮。继续执行步骤 3.11 以筛选单元格。
11. 使用放置在新 50 mL 管中的 40 μm 细胞滤网过滤细胞。通过移液1 mL的同一基介质预湿滤网，用于悬浮细胞，然后用移液器将细胞悬浮物通过过滤器，收集导管碎片/有机物。
    注:从单个4周大的供体大鼠的乳腺组织过滤上皮的近似产量为1 x 10⁶细胞。
    1. 对于有机物，丢弃滤液。乳腺有机物将留在细胞滤网的篮子内，更小、不需要的细胞将被消除。将细胞滤网倒置在新的 50 mL 管上，然后用收集细胞所需的任何体积冲洗。继续步骤 3.12。
    2. 对于单分散细胞，丢弃细胞滤网并保持滤液，因为乳腺上皮细胞将穿过过滤器，以及较小的基质和免疫细胞。用另一卷 DMEM/F12 用 10% FBS 冲洗用于消化/离心的管子，然后通过相同的细胞滤网。在1，200 x g下离心，将单分散细胞压成5分钟。继续步骤3.12。
       注: 重新挂起的单元格已准备好用于后续应用程序。
12. 脉冲旋转溶液，并确保形成细胞颗粒，然后再继续下一步。如有必要，再次脉冲旋转。
13. 小心地取出上清液。将颗粒重新悬浮在小体积（DMEM/F12 的 1，000-2，000 μL）中，以集中细胞进行计数。
14. 计算细胞，必要时稀释。在每个动物的20μL DMEM/F12介质中重新悬浮所需的移植细胞数量。总是把细胞放在冰上。
    注:基于研究的终点，每个移植部位需要1 x 10⁵ - 1 x 10⁶细胞范围内的供体细胞计数。例如，与其他应用相比，致癌实验通常需要更多的移植细胞。需要为每个菌株确定所需的细胞数量。如步骤3.16所述，在与大脑均质混合之前，本议定书中描述的程序在20μL培养物中每个移植位点使用250，000个供体细胞。
15. 准备其他实验所需的任何电池的等分（例如，FACS隔离3、26、27、30、33）。
    1. 对于有机体，继续步骤 3.16。
    2. 对于单分散细胞，使用Trypan或亚甲蓝色染色对可存活的细胞进行量化，然后继续。
16. 为所有移植接受者准备单批捐赠材料。将细胞悬浮液（20μL）的等量与50%脑均质（20μL）结合，用于每个移植部位。
    注:每个站点总共将注入40 μL，但建议至少包括25%的额外体积，用于浪费。
17. 立即进行移植或冷冻细胞，以便稍后移植（潜在停止点）。
    注:冷冻细胞尚未通过该协议进行测试，需要提前优化，以生成一组用于移植实验的动物。强烈建议移植新鲜细胞。

4. 移植程序（受体大鼠4-5周龄）

1. 称量每个受体大鼠，并计算将在手术中使用的经批准的镇痛药的正确剂量。
   注:在手术前，身体重量可测量至24小时。遵循机构指南，在剃须期间限制或短暂麻醉每只动物。
2. 使用电动剪子对每只动物进行手术区。识别头骨的底座和椎骨柱的起始部分。脊柱下部大约三分之一，在背部上胸部分有3厘米x2厘米的面积。
   注:剃须也可在移植当天麻醉下进行，但必须在无菌场外进行。把老鼠送回家里的笼子，直到需要它。
3. 找到移植所需的所有用品 （表 1）。
4. 使用前评估实验室动物麻醉系统。倒位所有液体，并更换任何需要的储罐或部件。确保进入麻醉室的气体管路畅通，并关闭所有外围线路，以便异体麻醉和氧气一旦放入腔室，便可自由流向动物。
5. 加热垫，支持受赠动物的体温。
6. 生成将用于手术的无菌场。按照表 1中所述排列耗材。
7. 根据机构批准的动物护理协议，为受体大鼠施用术前镇痛药。
8. 用无菌 DMEM/F12 介质冲洗汉密尔顿注射器，以防止细胞损失。确保针头固定在注射器的身体上，将针头插入液体中，然后拉回柱塞。填充到最大音量。按下柱塞并将内容物排入废物收集管中。重复3-5次。
9. 将捐赠材料的整个体积（在步骤 3.16 中准备）装入针对每种情况（例如，控制、治疗、野生型、挖空等）的单独注射器中。将针尖插入液体中，将柱塞拉回，并在管中的体积减小时将针头保持在混合物表面下方。
   注:在每个注射器中至少加入10%的额外体积。请勿将剩余的混合物关闭，并将其放在冰上，以防需要更多。
10. 完全装入注射器后，反转注射器，轻轻按压柱塞以去除针尖处的气泡。准备好一切后，继续执行下一步。
    注:确保针头从不接触任何其他表面，即使在无菌区域内也是如此。将注射器的身体放在一小容器的冰上，促进细胞的生存能力是有帮助的。
11. 将受体动物放在麻醉室中，然后打开机器。
12. 当动物完全放松时（对敲击或室的轻柔运动没有反应），将麻醉直接引导到鼻锥，并将动物转移到无菌场。
    注:大鼠不能很好地耐受麻醉的延长持续时间。在10分钟或更短的10分钟内完成每只动物的程序。
13. 将动物放在一个容易的位置（放在它的胃上），这样头部的背部和上脊柱是容易接近的。
    注意:确保随时为动物提供足够的热量支持，并使用牢固的脚趾捏定期评估麻醉深度。
14. 可选择应用眼科兽医膏，以防止眼睛干燥。
15. 清洁新剃掉的区域，去除多余的毛发。使用圆周运动，在皮肤上涂抹70%乙醇（或其他试剂，每个机构指南），然后使用防腐剂（如碘），然后重复。在动物上放置毛巾，以便只暴露被扫描区域的区域。
16. 确保动物对深部刺激没有反应，用坚定的脚趾捏，然后继续下一步。
17. 使用锋利的手术刀片进行小（2 厘米）的插形切口。
    注:切口必须是肤浅的，因为脂肪垫位于皮肤正下方。
18. 找到用于定向的中血管 （图 2B）。
19. 在进行移植时，用钳子抬起切口一侧的皮肤，并将其从脂肪垫上保持开走（图2B）。将针头插入移植部位。
    1. 或者，将针头的尖端移到组织内，并创建一个小口袋来收集细胞。使用小的重复动作。请勿取下针头。
       注: 建议首次使用该协议的用户执行此步骤。创建口袋时要格外小心，因为隔膜脂肪垫组织非常细腻。
20. 小心地将40μL的细胞混合物注射到细胞间脂肪垫组织中。慢慢取出针头。
21. 将组织保持原位，让移植的细胞沉淀3-5s。如果需要，使用另外一对钳子。
22. 取出针头。在第二次移植部位重复注射程序（步骤4.18-4.21）。
    注:一个供体组的上皮可以注射到每个动物脂肪垫的同一侧，或交替侧，以防止外科医生的手部优势产生批次效应。
23. 使用伤口夹或缝合线关闭手术伤口，然后停止麻醉。
24. 提供术后镇痛药，如机构批准的协议所示。
25. 立即将动物移到热支架的回收笼中。监测是否有不适的迹象，如切口出血或呼吸困难。
    注:动物应在5-10分钟内完全恢复。参考机构指南，将动物送回殖民地，并在存活程序后进行术后监测。
26. 在移植后3-4周内，通过给受体大鼠施用致癌物质，在移植部位进行致癌研究。
    注:通常，大鼠乳腺致癌作用是在50-57天使用化学致癌物处理。这种治疗决定了移植手术的年龄（必须在29-36天之间完成），以便移植细胞有足够的时间启动乳腺的生长。

5. 上皮生长的评估

1. 通过每日阴道洗漱来监测大鼠的细胞周期，并在显微镜幻灯片上检查细胞学。在研究结束前 8-12 天开始。在同一阶段牺牲所有老鼠。这是一个可选步骤。
   注:大鼠周期为4-5天。允许动物经历1-2个完整周期将便于解释，因为从以前的周期的洗漱幻灯片可用于比较。
2. 根据机构指南，在移植后6-8周牺牲移植受体大鼠。
   注:移植后3-6周通常可检测到生长外，但可能需要额外时间。
3. 将动物置于易感位置，用 70% 乙醇清洁身体。用钳子抬起皮肤，沿着椎骨柱切开，露出椎间脂肪垫。将皮肤从组织中分离出去，使大多数脂肪垫可见。
4. 识别分离体间脂肪垫中移植部位的内向血管。将整个垫子切除为一块组织或沿着血管切割，并单独去除两侧。
5. 将组织放在带正电的显微镜幻灯片上，以便进行整个安装。使用 2 对钝钳，轻轻铺开组织，以恢复其在幻灯片上的原始构象。
   注:大鼠乳腺组织极其精细。组织的边缘可能卷曲在自身下面。始终小心处理并按住到位，直到组织粘附在幻灯片上（几秒钟）。
6. 全安装至少一个内源性腹内性乳腺（带淋巴结进行定向）进行比较。
7. 将幻灯片放入70%乙醇中7-10天，以解冻组织。根据需要经常补充乙醇，以确保组织不会干涸。
8. 准备明胺染色，并在组织足够不透明时处理幻灯片。在使用前让污渍冷却 （补充文件 4）。
   注:污渍可在固定和补液步骤前一天准备。该解决方案可储存在 4°C 下，重复使用的可能性有限。
9. 将滑片放入25%的冰川醋酸:75%乙醇60分钟，修复组织。
   1. 在乙醇浓度降低的一系列3次中补充组织:70%乙醇15分钟，50%乙醇5分钟，dH₂O5分钟。
10. 污渍与铝胺4-8天。每天检查幻灯片的背面，以确定污渍是否完全渗透到组织。染色完成后，继续执行下一步。
    注:当腺体最厚的部分具有紫色色调且不再显示为白色时，染色已完成。
11. 通过一系列乙醇浓度增加的滑轨转移滑物，使组织脱色和脱水:70%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇30分钟。
12. 将脱水的幻灯片放入二甲苯中3天以上，以清除组织。转移到矿物油进行长期储存。
13. 清除幻灯片后，使用低功率光显微镜或高分辨率数字摄影获取幻灯片的图像进行分析。确保所有幻灯片的图像采集参数一致。
    注: 内皮生长必须明确区分。
14. 将外增长的存在视为二进制结果。
15. 使用采集的图像计算在 50% 的移植部位中产生 +1 乳腺生长的移植上皮细胞的平均数量。根据需要量化其他物理特征。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

捐赠者和受助人乳腺
图1A显示了分离和制备大鼠乳腺上皮细胞进行移植的步骤。在4周大时，供体大鼠的内源性乳腺已经开始成熟，上皮可以形象化在全安装的幻灯片上，上面沾满了明珠（图1B）。在这个年龄，一只供体大鼠将提供大约1 x 10⁶个细胞进行移植?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

该协议描述了一种针对大鼠工作而优化的乳腺上皮细胞移植技术。从供体大鼠（3-5周年龄）分离的乳腺上皮器官被移植到受体大鼠的间膜白脂肪垫（也是3-5周的年龄）。结果可以解释为4-6周后，使用光显微镜检查移植组织;然而，在进行完整实验之前，必须确定移植和牺牲之间的最佳时间。如果时间过得太少或过长，结果既不是可解释的，也不是有意义的。为了优化协议，分析移植后6-8周一小组动...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM syringe filters	Fisher Scientific	09-715G	sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)	Fisher Scientific	05-408-129	containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers	Corning	431752	filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles	Hamilton	81001 & 90525	For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette	-	-	transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube	Falcon (Corning)	352196	brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers	Corning	431750	filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes	Fisher Scientific	05-539-6	for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes	Thermo Scientific	130181	for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate	Sigma-Aldrich	243361/237086	staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use	-	-	follow institutional protocol
Beta-dine or iodine	-	-
Borosilicate glass culture tube for homogenization	Fisher Scientific	14-961-26	for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine	Sigma-Aldrich	C6152/1022	staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus	-	-
Clean animal cages for recovery	-	-	follow institutional protocol
Collagenase Type 3	Worthington Biochemical Corp.	LS004183	enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water	-	-	for chemical solutions
DMEM/F12	GIBCO	11320033	for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA	-	-	monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2705/2701	mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	-	inactivation solution
Gauze	-	-
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS	GIBCO	-	monodispersion mixture
Heating pads	-	-	follow institutional protocol
Ice buckets (x2)	-	-
Incubator with orbital rotation	-	-	must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia	-	-	follow institutional protocol
Light microscope or digital camera	-	-	visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer	Fisher Scientific	-	TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure	Sigma-Aldrich/ ACROS Organics	8042-47-5	long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer	-	-	follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes	-	-
Positively-charged microscope slides	Thermo Scientific	P4981-001	mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic	-	-	Institutional protocol
Scale			body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver	-	-	electric clippers, or other
Staining jars	-	-	minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes	IMCO	4410-IMC	used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)	-	-	autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)	-	-	for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin	Worthington		monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)	-	-
Wound clip applier, clips, and removal tool	Fine Science Tools	12020-00	Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes	Fisher Scientific	X3S-4	clearing mammary gland whole mount slides after staining