JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

انتشار القلب وخلايا القلب بعد الإصابة هي عملية ديناميكية تتطلب سيمفونية من الإشارات خارج الخلية من مجموعات الخلايا غير myocyte. باستخدام تتبع النسب ، والوضوح السلبي ، وتقنيات المجهر ثلاثي الأبعاد كامل جبل confocal ، يمكننا تحليل تأثير مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا على إصلاح القلب والتجدد.

Abstract

ويفوق عدد أمراض القلب والأوعية الدموية جميع أسباب الوفاة الأخرى، وهو مسؤول عن 31% من الوفيات المذهلة في جميع أنحاء العالم. يتجلى هذا المرض في الإصابة القلبية ، في المقام الأول في شكل احتشاء عضلة القلب الحاد. مع القليل من المرونة بعد الإصابة ، سيتم استبدال أنسجة القلب السليمة ذات مرة بأنسجة ندبة ليفية وغير منقدة وغالباً ما تكون مقدمة لفشل القلب. لتحديد خيارات العلاج الجديدة في الطب التجديدي ، ركزت الأبحاث على الفقاريات ذات القدرات التجديدية الفطرية. أحد هذه الكائنات النموذجية هو الفأر الوليدي ، الذي يستجيب لإصابة القلب بتجديد عضلة القلب القوي. من أجل الحث على إصابة في الفأر الوليدي ذات الصلة سريريا، قمنا بتطوير عملية جراحية لانسداد الشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD)، مما يعكس احتشاء عضلة القلب الناجم عن تصلب الشرايين في قلب الإنسان. عندما تتطابق مع التكنولوجيا لتتبع التغييرات على حد سواء داخل خلايا القلب والسكان غير myocyte، وهذا النموذج يوفر لنا منصة لتحديد الآليات التي توجه تجديد القلب. كان اكتساب نظرة ثاقبة في التغيرات في مجموعات خلايا القلب بعد الإصابة يعتمد بشكل كبير على طرق مثل تقسيم الأنسجة والفحص النسيجي ، والتي تقتصر على التحليل ثنائي الأبعاد وغالباً ما تتلف الأنسجة في هذه العملية. وعلاوة على ذلك، تفتقر هذه الأساليب إلى القدرة على تتبع التغيرات في أنساب الخلايا، وبدلاً من ذلك تقدم مجرد لقطة من استجابة الإصابة. هنا ، ونحن نصف كيف يمكن استخدام الأساليب المتقدمة تكنولوجيا في نماذج تتبع النسب ، وتطهير الجهاز كله ، والمجهر ثلاثي الأبعاد (3D) كامل جبل لتوضيح آليات إصلاح القلب. مع بروتوكول نا لجراحة احتشاء عضلة القلب الماوس الوليدي، وتطهير الأنسجة، وتصوير الجهاز كله 3D، يمكن كشف المسارات المعقدة التي تحفز انتشار عضلة القلب، والكشف عن أهداف علاجية جديدة لتجديد القلب.

Introduction

منذ فترة طويلة يعتبر القلب أن يكون جهاز ما بعد mitotic، ولكن الأدلة الأخيرة تثبت أن تجديد عضلة القلب يحدث في قلب الإنسان الكبار في حوالي 1٪ في السنة1. ومع ذلك، هذه المعدلات المنخفضة من دوران عضلة القلب غير كافية لتجديد فقدان هائلة من الأنسجة التي تحدث بعد الإصابة. القلب الذي عانى من احتشاء عضلة القلب سوف تفقد حوالي مليار عضلة القلب، وغالبا ما تكون بمثابة مقدمة لفشل القلب والموت القلبي المفاجئ2،3. مع أكثر من 26 مليون شخص يعانون من قصور القلب في جميع أنحاء العالم، هناك حاجة غير ملباة للعلاجات التي يمكن أن تعكس الأضرار الناجمة عن أمراض القلب4.

من أجل سد هذه الفجوة في العلاجات، بدأ العلماء التحقيق في الآليات المحفوظة تطوريا التي تكمن وراء التجديد الذاتي ة بعد الإصابة. نموذج واحد لدراسة تجديد القلب الثدييات هو الفأر الوليدي. في غضون الأسبوع التالي للولادة ، تتمتع الفئران الوليدية باستجابة تجديدية قوية بعد تلف القلب5. لقد أثبتنا سابقا أن الفئران حديثي الولادة يمكن تجديد قلوبهم عن طريق انتشار عضلة القلب بعد استئصال apical5. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تثير تجديد القلب في الولدان، فإن الجراحة تفتقر إلى الصلة السريرية لإصابات القلب البشرية. من أجل تقليد إصابة بشرية في نموذج الفأر الوليدي ، قمنا بتطوير تقنية للحث على احتشاء عضلة القلب من خلال انسداد الشريان التاجي6. تتطلب هذه التقنية الربط الجراحي للشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD) ، وهو مسؤول عن توصيل 40٪ -50٪ من الدم إلى عضلة القلب البطينية اليسرى6،7. وبالتالي ، فإن الجراحة تؤدي إلى احتشاء يؤثر على جزء كبير من جدار البطين الأيسر. هذا الضرر الذي يلحق بعضلة القلب سيحفز انتشار عضلة القلب وتجديد القلب في الولدان5.

توفر جراحة انسداد الشريان التاجي طريقة مترجمة وقابلة للاستنساخ بشكل كبير للكشف عن الأعمال الداخلية لتجديد القلب. ويوازي جراحة حديثي الولادة تصلب الشرايين التاجية في قلب الإنسان، حيث تراكم البلاك داخل الجدران الداخلية للشرايين يمكن أن يسبب انسداد واحتشاء عضلة القلب اللاحقة8. بسبب الفراغ في العلاجات العلاجية لمرضى قصور القلب ، يرتبط الانسداد في LAD بمعدلات الوفيات التي تصل إلى 26٪ في غضون عام بعد الإصابة9، وبالتالي تم تسميته "صانع الأرملة". تتطلب التطورات في العلاجات نموذجًا يعكس بدقة الآثار الفسيولوجية والمرضية المعقدة لإصابة القلب. يوفر البروتوكول الجراحي لإصابة قلب الفأر الوليدية منصة تسمح للباحثين بالتحقيق في الإشارات الجزيئية والخلوية التي تشير إلى تجديد قلب الثدييات بعد الإصابة.

يسلط البحث الأخير الضوء على العلاقة الديناميكية بين البيئة خارج الخلية وخلايا القلب المنتشرة. على سبيل المثال ، يمكن تمديد نافذة التجدد بعد الولادة عن طريق تقليل صلابة المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالقلب10. المواد الحيوية من مصفوفة خارج الخلية الوليدية يمكن أيضا تعزيز تجديد القلب في قلوب الثدييات البالغة بعد إصابة القلب11. كما يرافق انتشار عضلة القلب هو استجابة أنجيوجينيك12،13؛ وقد تبين أن تكوين الشريان الجانبي الفريد من نوعه لقلب الفأر الوليدي التجدد ضروري لتحفيز تجديد القلب12. وعلاوة على ذلك، أثبت مختبرنا أن الإشارات العصبية تنظم انتشار عضلة القلب وتجديد القلب عن طريق تعديل مستويات عامل النمو، فضلا عن الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة14. هذه النتائج تؤكد على الحاجة إلى تتبع مجموعات الخلايا غير myocyte استجابة لإصابات القلب. من أجل تحقيق هذا الهدف، استفدنا من نظام إعادة تركيب Cre-lox في خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدمج التعبير التأسيسي أو المشروط لبروتينات مراسل الفلورسنت لتتبع النسب. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام أساليب متقدمة لتحديد نمط التوسع clonal مع خط الماوس قوس قزح، الذي يعتمد على التعبير العشوائي من المراسلين الفلورسنت تعتمد على Cre، متعددة الألوان لتحديد التوسع clonal من مجموعات الخلايا المستهدفة15. توظيف تتبع النسب مع جراحة انسداد الشريان التاجي الوليدي هو أداة قوية لتشريح الآليات الخلوية المعقدة لتجديد القلب.

من الصعب تتبع نسب الخلايا المسماة بالفلورسنت مع تصوير الأعضاء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام تقنية الإخراج وإعادة البناء التقليدية - خاصة عندما تكون مجموعات الخلايا هشة ، مثل الألياف العصبية أو الأوعية الدموية. في حين أن التصوير المباشر الكامل للجهاز عن طريق الإخراج البصري يمكن التقاط مجموعات الخلايا السطحية ، فإن الهياكل التي توجد في عمق الأنسجة لا تزال غير قابلة للوصول. للتحايل على هذه الحواجز ، تم تطوير تقنيات إزالة الأنسجة للحد من غموض أنسجة الأعضاء بأكملها. في الآونة الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في مسح الدهون تبادل الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة الأنسجة المتوافقة hYdrogel (وضوح) - الأساليب القائمة ، والتي واضحة الأنسجة الثابتة عن طريق استخراج الدهون16. كما يتم اتخاذ خطوات لتجانس مؤشر الانكسار وتقليل بعد ذلك تشتت الضوء أثناء التصوير17. واحدة من هذه الطريقة هي الوضوح النشط ، مما يسرع تحلل الدهون باستخدام الكهربية لاختراق المنظفات في جميع أنحاء الأنسجة18. على الرغم من فعالية، وهذا الأسلوب تطهير الأنسجة يتطلب معدات باهظة الثمن ويمكن أن يسبب تلف الأنسجة، مما يجعل النهج غير متوافق مع مجموعات الخلايا الهشة مثل الأعصاب القلبية19. وهكذا ، فإننا نستخدم نهج الوضوح السلبي ، الذي يعتمد على الحرارة لتسهيل اختراق المنظفات بلطف ، وبالتالي المساعدة في الاحتفاظ بهياكل الخلايا المعقدة20،21.

ويعتقد عادة الوضوح السلبي لتكون أقل كفاءة من الوضوح النشط18، كما يرافق هذه التقنية في كثير من الأحيان من قبل اثنين من العقبات الرئيسية : عدم القدرة على مسح عمق الجهاز بأكمله وكمية طويلة من الوقت اللازم لمسح أنسجة الكبار. يتغلب نهج الوضوح السلبي لدينا على كل من هذه الحواجز من خلال عملية تطهير سريعة قادرة على إزالة أنسجة القلب الوليدية والبالغين بشكل كامل. وقد وصلت تقنية إزالة الأنسجة السلبية CLARITY لدينا إلى الكفاءة التي تسمح بتصور مجموعة متنوعة من مجموعات خلايا القلب ، بما في ذلك مجموعات نادرة موزعة في جميع أنحاء قلب البالغين. عندما يتم تصوير القلب مسح مع المجهر المعالبؤر، يمكن إضاءة الهندسة المعمارية للنقش الخلايا محددة أثناء التنمية، والمرض، والتجدد.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لدليل استخدام ورعاية الحيوانات المختبرية وامتثالا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب والصحة العامة في جامعة ويسكونسن ماديسون. تم تنفيذ جميع الأساليب على النوع البري C57BL/6J (B6) وخطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها من مختبرات جاكسون.

1. انسداد الشريان التاجي (احتشاء عضلة القلب) الناجمة عن طريق ربط الشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD) في الفئران حديثي الولادة 1-Day-old6

  1. فصل الجراء حديثي الولادة البالغ من العمر يوم واحد من الأم عن طريق وضعها في قفص نظيف جنبا إلى جنب مع بعض المواد التعشيش الأصلي.
  2. ضع نصف القفص على وسادة تدفئة على حرارة متوسطة. يجب أن تبقى الجراء على الجانب غير الساخن من القفص ، يتم وضعها فقط على الجانب الساخن بعد الجراحة.
  3. إنشاء منطقة جراحية معقمة تحت مجهر التشغيل. جمع المعدات الجراحية المعقمة(الجدول 1).
  4. قم بتنويم الجرو عن طريق انخفاض حرارة الجسم: لف الجرو في الشاش لتجنب ملامسة الجلد المباشر للجليد ودفنه في سرير جليدي لمدة 3-4 دقيقة تقريبًا. تحقق من انخفاض حرارة الفئران بشكل دوري عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. الولدان يتسامحان مع انخفاض حرارة الجسم بشكل جيد، ومع ذلك، فإن التعرض المطول لانخفاض حرارة الجسم قد يؤدي إلى قضمة الصقيع والوفيات اللاحقة.
  5. مرة واحدة في esesthetized، وضع الماوس على المنطقة الجراحية في موقف supine، وتأمين الذراعين والساقين مع الشريط. قم بتعقيم المنطقة الجراحية للفأر ة بمحلول مطهر.
  6. تحديد موقع منطقة الصدر السفلي وجعل شق عرضي في الجلد مع مقص تشريح الصغيرة. لتوسيع الرؤية الجراحية للأضلاع، فصل الجلد عن العضلات عن طريق رفع الجلد بلطف مع زوج من ملقط خلع الملابس واضغط بلطف ضد العضلات بين الوبمعمع مع مقص صغير في موقف مغلق.
  7. تحديد موقع الفضاء بين الوكوستال الرابع(الشكل 1A)وجعل ثقب صغير سطحي باستخدام ملقط حادة، مع الحرص على عدم ثقب أي أعضاء داخلية. إجراء تشريح حاد عن طريق توسيع المنطقة بين العضلات بين الوب مع ملقط خلع الملابس. الموضع التشريحي السليم للشق ضروري للوصول المناسب إلى القلب.
  8. توجيه بلطف القلب من تجويف الصدر عن طريق وضع إصبع وتطبيق ضغط متزايد على الجانب الأيسر من البطن في حين عقد الفضاء بين الوكوستية مفتوحة مع ملقط خلع الملابس(الشكل 1B). بمجرد أن يكون القلب خارج الصدر ، قم بإزالة ملقط الملابس ، وتخفيف الضغط ، والسماح للقلب بالراحة على العضلات بين الوُرَك.
  9. تحديد موقع LAD كمنطقة من القلب يحتوي على دم أقل تجمعًا وهو في الموضع التشريحي الصحيح(الشكل 1C). يمكن رؤية LAD فقط تحت المجهر إذا تم الوصول إلى القلب في غضون بضع دقائق من بدء الجراحة.
  10. تنفيذ ربط LAD عن طريق خياطة LAD مع خياطة 6-0(الشكل 1D). التعادل عقدة مربعة مرتين للحث على احتشاء عضلة القلب(الشكل 1E). عمق خياطة في عضلة القلب قد تختلف، ومع ذلك، تحديد المواقع التشريحية المناسبة من الربط LAD أمر بالغ الأهمية لإعادة المستنسخة. عند ربط LAD ، يجب سحب الخياطة بإحكام ولكن بعناية حتى لا نقطع LAD. سيتم رؤية التبييض في قمة القلب على الفور(الشكل 1E)
  11. السماح للقلب أن تنزلق مرة أخرى إلى تجويف الصدر; ويمكن تسهيل هذه العملية بلطف مع ملقط خلع الملابس. خياطة الأضلاع جنبا إلى جنب مع عقدة الجراح تليها عقدة مربعة، وذلك باستخدام ملقط حادة لرفع المجموعة العليا من الأضلاع أثناء تمرير خياطة 6-0 من خلال المجموعة العليا والسفلى من الأضلاع.
  12. إزالة الشريط الذي كان يستخدم لتأمين الساقين الخلفيتين من الجرو.
  13. تلتصق يالجلد معا عن طريق وضع كمية صغيرة من الجلد الغراء على الجزء العلوي من البطن. ثم، والاستيلاء على الجلد من أسفل البطن مع ملقط غرامة وتغطي منطقة الصدر المكشوفة. الحد من كمية الغراء الزائد الذي لا يزال على الجراء، وهذا يمكن أن تزيد من احتمال الرفض وأكل لحوم البشر من قبل الأم.
  14. تسهيل الانتعاش فورا من التخدير عن طريق وضع الجرو على لوحة التدفئة تعيين إلى الحرارة المتوسطة. تبديل دوريا موضع الولدان لتدفئة بالتساوي في جميع أجزاء الجسم.
  15. السماح لحديثي الولادة بالبقاء مباشرة على وسادة التدفئة لمدة 10-15 دقيقة.
  16. تنظيف الدم المتبقية والغراء مع مسح الكحول.
  17. تغطية الروائح الأجنبية على حديثي الولادة عن طريق فرك الجسم كله مع الفراش من القفص الأصلي. ضع الجرو في القفص على الجانب الساخن بينما يتم إجراء عمليات جراحية أخرى.
  18. بمجرد الانتهاء من جميع العمليات الجراحية والجراء دافئة ومتنقلة، ونقل القمامة جنبا إلى جنب مع المواد التعشيش الأصلي إلى قفص الأم.
  19. راقب الفئران لمدة 30-60 دقيقة بعد الجراحة وراقب قبول الأم للجراء عن طريق التعشيش و / أو الاستمالة.
  20. تحقق على الفئران في صباح اليوم التالي للجراحة. إذا كانت الأم حزينة ولم تعشش الجراء ، ففكر في أم حاضنة للجراء.

2. تطهير قلب الماوس مع الوضوح السلبي21،22،23

  1. قم بتنويم الفأرة بـ"إيزوغلوران" قم بإجراء قرصة إصبع القدم لضمان أن الفأر ة مُسَسَّبة بالكامل.
  2. وضع الماوس على منطقة نظيفة والجراحية في موقف supine، وتأمين الذراعين والساقين مع الشريط.
  3. الحفاظ على الإيأووفلوران يُسَيّر على الفأرة باستخدام مخروط الأنف حتى يتم استخراج القلب.
  4. فتح أسفل الصدر عن طريق عقد الفراء فقط تحت عملية xiphoid مع ملقط الأنسجة وجعل شق تمتد عرض القفص الصدري باستخدام مقص تشريح كبير.
  5. قطع جنبا إلى جنب مع أجزاء من القفص الصدري مع مقص الجراحية.
  6. فضح العضلة الحجاب الحاجز من خلال استيعاب عملية xiphoid مع ملقط الأنسجة. فصل الحجاب الحاجز باستخدام ملقط المنحني.
  7. مع الحفاظ على فهم لعملية xiphoid ، اسحب الأنسجة بشكل قحفي حتى يمكن الوصول إلى القلب النابض.
  8. فهم القلب في القاعدة مع ملقط المنحني وتشريح القلب من تجويف الصدر عن طريق قطع الأورطا والوريد الوريد الكافا متفوقة مع مقص اإرديكتو.
  9. في حين أن القلب لا يزال ينبض، ضع القلب في طبق بيتري مليئة برنامج تلفزيوني بحيث يضخ القلب من الدم في الداخل كما أنه يحتفظ بالنبض. يمكن تأكيد احتشاء عضلة القلب عن طريق التحقق من أن وضع الخياطة في الموضع التشريحي المناسب لربط LAD.
  10. ضغط بلطف على القلب مع ملقط للسماح للقلب لطرد الدم المتبقي.
  11. نقل قلب الماوس إلى قارورة قذيفة زجاجية يمكن التخلص منها 2.5 مل مع 2 مل من PBS. غسل الدم المتبقي عن طريق احتضان القلب على شاكر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) عدة مرات. تغيير حل PBS في كل مرة حتى يبقى PBS واضحًا.
  12. تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من الباردة 4٪ paraformaldehyde (PFA). احتضان لمدة 4 ساعات في RT(الشكل 2A).
  13. بعد الحضانة، تخلص من PFA والقارورة مع 2 مل من PBS. غسل القلب على شاكر لمدة 10 دقائق في RT. كرر خطوة الغسيل مرتين، واستنزاف وملء القارورة مع برنامج تلفزيوني جديد في كل مرة لغسل تماما PFA الزائدة.
  14. تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من 4٪ أكريلاميد و 0.5٪ VA-044 الحل. احتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
  15. في اليوم التالي، قم بإجراء البلمرة عن طريق نقل القارورة إلى كتلة حرارية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  16. نقل القلب إلى قارورة قذيفة زجاجية جديدة وتكرار الخطوة 2.12 (دورة غسل PBS).
  17. تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من حل المقاصة(الجدول 2). احتضان في 37 درجة مئوية حتى يتم تطهير القلب. قم بتغيير الحل وإعادة تعبئته ابلي مع حل المقاصة الجديد كل 2-3 أيام. قد تستغرق عملية المقاصة عدة أسابيع(الشكل 2B-C).
    ملاحظة: عادة ً ما تستغرق قلوب P1 حوالي 3-5 أيام، في حين أن قلوب P21 يمكن أن تستغرق ما يقرب من شهر قبل اكتمال حضانة حل المقاصة.
  18. تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وتكرار الخطوة 2.12 (دورة غسل PBS). إعادة ملء القارورة مع PBS الطازجة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  19. إذا تم إجراء تلطيخ المناعة، فتخطى الخطوات 2.21-2.22 وانتقل إلى القسم 3 للكشف عن المناعة. إذا كنت تعتمد فقط على الفلورسة الذاتية، فتابع الخطوات 2.21-2.22 وتخطي القسم 3.
  20. تجاهل برنامج تلفزيوني وتغيير الحل إلى حل مطابقة مؤشر الانكسار (RIMS)(الجدول 3). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  21. بعد الحضانة، يمكن تخزين الأنسجة الخالية في محلول RIMS في RT. قد تبدو الأنسجة بيضاء ومبهمة في المركز عند نقلها لأول مرة إلى RIMS. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة بعد احتضانها في RIMS في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع(الشكل 2D).

3. اختياري: المناعة هيستوكيمياء تلطيخ قلب الفأر كامل جبل

  1. إزالة القلب مسح من حل RIMS ووضعها في قارورة زجاجية نظيفة 2.5 مل مع 2 مل من PBST (PBS مع 0.1٪ تريتون-X 100)
  2. غسل القلب في PBST 3 مرات على دوار مداري مع 30 حضانة دقيقة في RT.
  3. منع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة عن طريق غمر القلب في 2 مل من 20٪ حجب العازلة (مخففة في PBST) واحتضان مع التناوب لمدة 3 ساعات في RT. نقل إلى 4 درجة مئوية لوصمة عار مع التناوب بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يتم إجراء حظر المخزن المؤقت من المصل العادي مطابقة الأنواع التي أثيرت الأجسام المضادة الثانوية.
  4. غسل القلب في PBST 3 مرات مع التناوب لمدة 5 دقيقة حضانة في RT.
  5. تزج القلب في الأجسام المضادة الأولية (المخفف في 2٪ حجب العازلة مع PBST) ومنع التعرض للضوء عن طريق التفاف قارورة الزجاج في رقائق الألومنيوم. احتضان مع التناوب بين عشية وضحاها في RT.
    ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، يجب أن تستخدم رقائق الألومنيوم بشكل مستمر لحماية الثانوية من التعرض للضوء المحيط.
  6. احتضان لمدة 24 ساعة إضافية مع دوران في 4 °C.
  7. بعد تلطيخ الأولية، كرر الخطوة 3.2 (دورة غسيل PBST طويلة) لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المنضمة من الأنسجة. تمديد غسل مع حضانة بين عشية وضحاها مع التناوب في RT.
  8. العمل في منطقة ذات إضاءة محدودة لمنع التعرض الثانوي للضوء الأجسام المضادة، تزج القلب في الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في 2٪ حجب العازلة مع PBST) واحتضان مع التناوب لمدة 3 ساعات في RT. نقل إلى 4 درجة مئوية لوصمة عار مع التناوب بين عشية وضحاها.
  9. في اليوم التالي، كرر الخطوة 3.2 (دورة غسيل PBST طويلة) لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المنضمة.
  10. استبدال الحل مع 2٪ حظر المخزن المؤقت (مخففة في PBST). إزالة الأجسام المضادة غير المنضمة المتبقية عن طريق الغسيل بين عشية وضحاها مع التناوب في RT.
  11. في اليوم التالي، تحقق من إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة باستخدام المجهر المعالبؤر. قم بتمديد الغسيل حسب الحاجة، لتحل محل حل العازلة العازلة 2٪ يوميا. المضي قدما مرة واحدة قليلا إلى أي ثانوية غير محددة موجودة.
  12. تخزين القلب الملطخبالمناعة في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية.
  13. مباشرة قبل المجهر كامل جبل، احتضان القلب في حل RIMS بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تمديد الحضانة 24 ساعة إضافية إذا كان النسيج لا يزال غير مسح تماما.
  14. قم بتخزين القلب الملطخ بالمناعة والمناعي بالكامل في RIMS في RT.

4. تصور السكان غير myocyte في 3D مع التصوير المجهري كونكورس واحد الفوتون من قلب الماوس مسح

ملاحظة: إذا تم حصاد قلوب الماوس جنينياً، تابع القسم 4.1. بالنسبة لقلوب الفئران التي يتم حصادها بعد الولادة، تابع القسم 4.2.

  1. تصوير قلب الفأر الجنيني المنجلي
    1. ملء شريحة الاكتئاب المجهر مع حل برنامج تلفزيوني.
    2. التقط بعناية القلب مسح مع ملقط المنحني ووضع الأنسجة على الشريحة.
    3. قم بتركيب الشريحة بقسيمة غلاف زجاجية. يمكن الآن تصوير الأنسجة تحت المجهر البؤري.
  2. تصوير قلب الفأر بعد الولادة بعد الولادة
    1. ملء نصف غرفة الشريحة الاكتئاب مع حل PBS. من أجل إنشاء غرفة كبيرة بما يكفي لتناسب قلب الماوس الكبار ، تم وضع شريحة اكتئاب البولي بروبلين المطبوعة ثلاثية الأبعاد حسب الطلب(الشكل 4).
    2. التقاط بعناية القلب مسح مع ملقط المنحني ووضع الأنسجة في الغرفة. ملء حجم المتبقية من الغرفة مع برنامج تلفزيوني.
    3. ملء الغرفة مع برنامج تلفزيوني حتى سطح السائل يشكل قبة فوق الجزء العلوي من الغرفة. قم بتركيب شريحة الغطاء. يمكن الآن تصوير الأنسجة تحت مجهر بؤري منتصب.

النتائج

في كثير من الأحيان خطوتين الأكثر تحديا هي توجيه القلب للخروج من تجويف الصدر وligating LAD. لاستكشاف هذه الخطوات، قد يتم إجراء تعديلات في موضع الثقب الأولي بين العضلات بين الوكوستية الرابعة; إذا كان الثقب والتشريح الحاد قريبين جدًا من القص ، فقد لا يتمكن القلب من الخروج من تجويف الصدر...

Discussion

تفاعلات الخلية بين خلايا القلب والسكان غير myocyte هي عامل حاسم في ما إذا كان القلب سيخضع للتليف أو إصلاح بعد الإصابة. وقد تم إجراء اكتشافات تثبت أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الأعصاب14،الخلايا epicardial24،الضامة الباسيمي25، الشرايين12،,<...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل كلية الطب والصحة العامة في جامعة ويسكونسن من برنامج الشراكة في ولاية ويسكونسن (A.I.M.)، وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 19CDA34660169 (A.I.M. ).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-thioglycerol
6-0 Prolene SuturesEthicon8889HPolypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved ForcepsExcelta16-050-146Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing ForcepsFisherbrand13-812-39Dissecting, 4.5 in
Glass VialFisherbrand03-339-26A12 x 35 mm Vial with Cap
HistodenzSigma-AldrichDensity gradient medium
Iridectomy ScissorsFine Science Tools15000-032 mm Cutting Edge
Large Dissecting ScissorsFisherbrand08-951-20Straight, 6 in
Needle HolderFisherbrand08-966Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp ForcepsSigma-AdrichZ168777Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting ScissorWalter Stern Inc25870-00230 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue ForcepsExcelta16050133Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044Wako ChemicalsWater-soluble azo initiator

References

  1. Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  2. Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
  3. Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
  4. Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
  8. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  9. MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
  10. Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
  11. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  12. Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
  13. Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
  14. Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
  15. Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
  16. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  17. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  18. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  19. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
  20. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  21. Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
  22. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
  23. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
  24. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  25. Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  26. Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved