通过清除心脏三维成像捕获目标细胞群的心脏损伤反应

摘要

伤愈后心肌细胞增殖是一个动态过程，需要来自非肌细胞群的细胞外线索交响。利用谱系跟踪、被动CLARITY和三维全贴装共聚焦显微镜技术，可以分析各种细胞类型对心脏修复和再生的影响。

摘要

心血管疾病比所有其他死亡原因都多，是全世界31%的死亡原因。这种疾病表现为心脏损伤，主要是急性心肌梗死。受伤后恢复力小，曾经健康的心脏组织将被纤维化、非收缩性疤痕组织所取代，并且经常是心力衰竭的前奏。为了确定再生医学中新的治疗方案，研究的重点是具有先天再生能力的脊椎动物。新生儿小鼠是一种模型有机体，它通过强健的心肌再生对心脏损伤做出反应。为了引起新生儿小鼠的损伤，临床上相关，我们开发了一种手术，以遮挡左前部下部动脉（LAD），反映由人的心脏动脉粥样硬化引起的心肌梗死。当与跟踪心肌细胞和非肌细胞群内变化的技术相匹配时，该模型为我们提供了一个平台，用于识别指导心脏再生的机制。深入了解受伤后心脏细胞群的变化，曾经严重依赖组织切片和组织学检查等方法，这些方法仅限于二维分析，在此过程中经常损害组织。此外，这些方法缺乏跟踪细胞谱系变化的能力，而只是提供损伤反应的快照。在这里，我们描述了如何在谱系跟踪模型、整个器官清理和三维（3D）全安装显微镜中采用先进的技术方法来阐明心脏修复的机制。通过新生儿小鼠心肌梗死手术、组织清理和3D全器官成像方案，可以解开诱导心肌细胞增殖的复杂途径，揭示心脏再生的新治疗靶点。

引言

心脏长期以来一直被认为是一个后心肌器官，但最近的证据表明，心肌细胞更新发生在成人心脏约1%每年^1。然而，这些低的心肌细胞周转率不足以补充受伤后发生的组织大量损失。一颗患有心肌梗死的心脏会失去大约10亿心肌细胞，通常作为心力衰竭和心脏突然死亡的前奏^。,3全世界有超过2600万人受心力衰竭影响，因此对治疗治疗的需求得不到满足，这种疗法可以扭转心脏病^{造成的伤害。}

为了弥补治疗学的这一差距，科学家们已经开始研究在损伤后内源性再生的基础进化保护机制。研究哺乳动物心脏再生的一个模型是新生儿小鼠。在出生后的一周内，新生儿小鼠在心脏损伤⁵后有强大的再生反应。我们先前已经证明，新生儿小鼠可以通过心肌细胞增殖再生心脏后，一个呼吸节^5。虽然这种技术可以唤起新生儿的心脏再生，手术缺乏临床相关性的人的心脏损伤。为了模仿新生儿小鼠模型中的人体损伤，我们开发了一种通过冠状^{动脉阻塞6}诱导心肌梗死的技术。这项技术需要左前下部动脉（LAD）的手术结扎，负责将40%-50%的血液输送到左心室心肌^66，7。7因此，手术导致一个梗塞，影响左心室壁的很大一部分。这种对心肌损伤将刺激新生儿心肌细胞增殖和心脏再生^5。

冠状动脉闭塞手术提供了一种高度可重复和直接的转化方法，可以揭示心脏再生的内部工作。新生儿手术平行于人心脏冠状动脉粥样硬化，动脉内壁内斑块的积累可引起阻塞和随后的心肌梗死^8。由于心力衰竭患者的治疗无效，LAD的封闭与9^人受伤后一年内死亡率高达26%相关，因此被称为"寡妇制造者"。治疗的进步需要一个模型，准确地反映心脏损伤的复杂生理和病理影响。我们的新生儿小鼠心脏损伤手术方案提供了一个平台，使研究人员能够研究在受伤后向哺乳动物心脏再生发出信号的分子和细胞线索。

最近的研究强调了细胞外环境和增殖心肌细胞之间的动态关系。例如，产后再生窗口可以通过降低心脏周围细胞外基质的刚度^来延长。新生儿细胞外基质的生物材料也可促进心脏损伤后成年哺乳动物心脏的心脏再生^。伴随心肌细胞增殖的还有血管生成反应^12，13;12,新生儿小鼠再生心脏特有的动脉形成证明对刺激心脏再生^至关重要。此外，我们的实验室已经证明，神经信号通过调节生长因子水平，以及损伤后炎症反应调节心肌细胞增殖和心脏再生^14。这些发现强调需要追踪非肌细胞群，以回应心脏损伤。为了实现这一目标，我们利用了转基因小鼠系的Cre-lox重组系统，将荧光报告蛋白的组成或条件表达纳入系系追踪。此外，我们可以使用先进的方法确定与彩虹小鼠线的克隆扩张模式，它依赖于对克里依赖的、多色荧光机的随机表达来确定靶细胞群¹⁵的克隆扩张。使用新生儿冠状动脉闭塞手术进行系系追踪是剖析心脏再生复杂细胞机制的有力工具。

使用传统的切片和重建技术，很难使用三维（3D）全器官成像来跟踪荧光标记细胞的血统，尤其是在细胞群脆弱时，如神经纤维或血管。虽然通过光学切片直接全装成像器官可以捕获表面细胞群，但位于组织深处的结构仍然无法进入。为了避开这些障碍，已经开发出组织清除技术，以减少整个器官组织的不全性。最近，在透明脂质交换丙烯酰胺杂交硬成像兼容组织hYdrogel（CLARITY）-为基础的方法，通过脂质提取¹⁶清除固定组织取得了重大进展。还采取措施使折射率均质化，并在成像¹⁷时减少光散射。其中一种方法是活性CLARITY，它通过使用电泳来穿透整个组织¹⁸的洗涤剂来加速脂质分解。虽然有效，这种组织清除方法需要昂贵的设备，并可能导致组织损伤，使这种方法与脆弱的细胞群，如心脏神经¹⁹不相容。因此，我们采用被动的CLARITY方法，依靠热量轻轻促进洗涤剂的渗透，从而有助于保留复杂的细胞结构^{20，21。20,}

被动CLARITY通常被认为不如主动CLARITY¹⁸有效，因为该技术通常伴随着两个主要障碍:无法清除整个器官深度和清除成人组织所需的大量时间。我们的被动 CLARITY 方法通过加速清除过程克服了这两个障碍，能够完全清除新生儿和成人心脏组织。我们的被动 CLARITY 组织清除技术已达到一种效率，能够可视化各种心脏细胞群，包括分布在成人心脏的罕见人群。当用共聚焦显微镜成像清除的心脏时，可以在发育、疾病和再生期间照亮细胞特异性模式的架构。

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研究方案

所有实验均按照《实验室动物使用和护理指南》进行，并符合威斯康星大学麦迪逊分校医学和公共卫生学院的机构动物护理和使用委员会。所有方法均对从杰克逊实验室获得的野生C57BL/6J（B6）和转基因小鼠线执行。

1. 冠状动脉阻塞（心肌梗死）通过左前体下降动脉（LAD）在1天大新生儿小鼠⁶的结扎诱导

1. 将1天大的新生儿与母崽分开，将它们与一些原始的筑巢材料一起放入干净的笼子里。
2. 将一半的保持架放在加热垫上，以中热为温度。小狗应留在笼子未加热的一侧，只有在手术后才放在加热的一侧。
3. 在手术显微镜下创建无菌手术区域。收集消毒手术设备（表1）。
4. 通过体温过低对小狗进行麻醉:用纱布包裹小狗，避免皮肤直接接触冰，并将其埋在冰床上约3⁄4分钟。新生儿耐低温，然而，长期接触体温过低可能导致冻伤和随后的死亡。
5. 麻醉后，将鼠标放在手术区域的支撑位置，用胶带固定手臂和腿部。用防腐溶液对小鼠的手术区域进行消毒。
6. 找到下胸部区域，用小解剖剪刀在皮肤上进行横向切口。要拓宽肋骨的手术视野，请用一对敷料钳轻轻抬起皮肤，用封闭位置的小剪刀轻轻压压隔部间肌肉，将皮肤与肌肉分开。
7. 找到第四个间隔空间（图1A），并使用锋利的钳子进行一个小的、表面的穿刺，小心不要刺穿任何内脏器官。通过用敷料钳扩大间部肌肉之间的区域，进行钝剖面。切口的正确解剖定位对于正确进入心脏至关重要。
8. 轻轻引导心脏走出胸腔，放置一个手指，在腹部左侧施加增加的压力，同时用敷料钳保持间隔空间打开（图1B）。一旦心脏在胸部外，去除敷料钳，缓解压力，让心脏在间质肌肉上休息。
9. 将 LAD 定位为心脏的聚集血液较少且处于正确的解剖位置的区域（图 1C）。只有在开始手术后的几分钟内才能在显微镜下看到LAD。
10. 使用 6-0 缝合法缝合 LAD 执行 LAD 结扎（图 1D）。两次打一个方结，诱导心肌梗死（图1E）。缝合到心肌的深度可能有所不同，但是，LAD连接的正确解剖定位对于可重现性至关重要。在将 LAD 上用时，缝合线应紧密而小心地拉扯，以免切断 LAD。在心脏的顶点处的发泡将立即看到（图1E）
11. 让心脏滑回胸腔;这个过程可以轻轻地促进与敷料钳。缝合肋骨与外科医生的结，然后一个方形结，使用钝力抬起上部肋骨，同时通过6-0缝合通过上部和下组肋骨。
12. 拆下用于固定小狗后腿的胶带。
13. 通过在上腹部放置少量皮肤胶水，将皮肤粘在一起。然后，用细钳子抓住下腹部的皮肤，盖住暴露的胸部区域。限制在小狗身上残留的过量胶水的数量，因为这可能增加母亲拒绝和食人的可能性。
14. 立即通过将小狗放在加热垫上，以中等热量，促进麻醉的恢复。定期切换新生儿的位置，使身体的所有部位均匀地温暖。
15. 让新生儿直接留在加热垫上10-15分钟。 通常，运动在5分钟内被放入热。
16. 用酒精擦拭清洁残留的血液和胶水。
17. 用原笼子的床上用品摩擦整个身体，覆盖新生儿的异物气味。进行其他手术时，将小狗放入加热侧的笼子。
18. 一旦所有的手术完成，幼崽是温暖和移动的，将垃圾连同原始的筑巢材料转移到母亲的笼子。
19. 手术后对小鼠进行30~60分钟的监测，并通过筑巢和/或梳理观察母亲对小狗的接受程度。
20. 手术后的第二天早上检查老鼠。如果母亲心疼，没有筑巢的小狗，考虑为小狗寄养的母亲。

2. 用被动的 CLARITY 清除鼠标心脏^{21、,22、23}

1. 用西鲁兰麻醉老鼠。执行脚趾捏合，以确保鼠标完全镇静。
2. 将鼠标放在一个干净的手术区域，在支撑位置，用胶带固定手臂和腿部。
3. 使用鼻锥在小鼠身上保持心酸镇流，直到心脏被提取。
4. 用组织钳握住西福工艺正下方的毛皮，打开下胸，用大解剖剪刀切开肋骨宽度。
5. 用手术剪刀在肋骨笼的远端部分旁边切开。
6. 通过用组织钳抓住西福处理来暴露膜片肌肉。使用弯曲的钳子分离隔膜。
7. 在保持对西福过程的把握的同时，将组织颅骨拉起，直到跳动的心脏被接近。
8. 用弯曲的钳子抓住底座上的心脏，用虹膜剪刀切割主体和高级卡瓦卡，从胸腔中解剖心脏。
9. 当心脏仍在跳动时，将心脏放入一个装满PBS的培养皿中，这样心脏在持续跳动时会泵出里面的血液。通过检查缝合线的位置是否位于 LAD 结扎的正确解剖位置，可以确认心肌梗塞。
10. 用钳子轻轻挤压心脏，让心脏排出残留的血液。
11. 将鼠标心脏转移到一次性 2.5 mL 玻璃壳瓶中，带有 2 mL PBS。在室温 （RT） 下多次在振动器上孵育心脏 10 分钟，洗去残留的血液。每次更改 PBS 解决方案，直到 PBS 保持清晰。
12. 丢弃 PBS，用 2 mL 的冷 4% 甲醛 （PFA） 填充小瓶。在RT孵育4小时（图2A）。
13. 孵育后，丢弃2 mL PBS的PFA和小瓶。在RT上用摇摇器清洗心脏10分钟。重复洗涤步骤两次，每次排空用新的PBS排空并填充小瓶，以完全洗掉多余的PFA。
14. 丢弃 PBS，用 2 mL 4% 丙烯酰胺和 0.5% VA-044 溶液填充小瓶。在4°C孵育过夜。
15. 第二天，通过将小瓶转移到37°C的热块3小时进行聚合。
16. 将心脏转移到一个新的玻璃壳瓶和重复步骤2.12（PBS洗涤周期）。
17. 丢弃 PBS，用 2 mL 的清算解决方案填充小瓶（表 2）。在37°C孵育，直到心脏被清除。更换解决方案，每 2-3 天重新填充一次新的清算解决方案。清算过程可能需要数周（图2B-C）。
    注:P1心脏通常需要3~5天左右，而P21心脏可能需要近一个月的时间才能完成液化溶液的孵育。
18. 丢弃 PBS，用 2 mL 的 PBS 填充小瓶，重复步骤 2.12（PBS 洗涤循环）。用新鲜的PBS补充小瓶，并在37°C下孵育过夜。
19. 如果将进行免疫染色，跳过步骤 2.21_2.22，然后转到第 3 节进行免疫染色。如果完全依赖内源荧光，请继续步骤 2.21_2.22 并跳过第 3 节。
20. 丢弃 PBS 并将解决方案更改为折射索引匹配解决方案 （RIMS）（表 3）。在37°C孵育过夜。
21. 孵育后，清除的组织可以储存在RT的RIMS溶液中。组织在室温下孵育数周后应变得透明（图2D）。

3. 可选:全山小鼠心脏的免疫性活动化学染色

1. 从 RIMS 溶液中取出已清除的心脏，放入 2.5 mL 玻璃小瓶中，具有 2 mL PBST（带 0.1% Triton-X 100 的 PBS）
2. 在RT进行30分钟的孵育，在轨道旋转器上3次在PBST中洗涤心脏。
3. 通过将心脏浸入2 mL的20%阻塞缓冲液（在PBST中稀释）中，在RT时旋转3小时，将非特异性抗体结合物浸渍过夜。
   注:阻塞缓冲液由正常血清制成，与引发二次抗体的物种相匹配。
4. 在 PBST 中洗涤心脏 3 次，在 RT 中旋转 5 分钟孵育。
5. 将心脏浸入原抗体中（用PBST稀释在2%的阻塞缓冲液中），并通过用铝箔包裹玻璃瓶来防止光线照射。在 RT 进行一夜旋转孵育。
   注:从这一点开始，铝箔应持续使用，以保护二级免受环境光照射。
6. 在4°C下旋转再孵育24小时。
7. 在原发染色后，重复步骤 3.2（长 PBST 洗涤周期），从组织中去除未结合的主要抗体。在 RT 处旋转，通过夜间孵育延长洗涤。
8. 在照明受限的区域工作，以防止二次抗体光照射，将心脏浸入二次抗体中（用PBST在2%阻塞缓冲液中稀释），并在RT时旋转3小时孵育。
9. 第二天，重复步骤3.2（长PBST洗涤周期），以去除未结合的二次抗体。
10. 将溶液替换为 2% 的阻塞缓冲液（在 PBST 中稀释）。通过在 RT 处旋转过夜洗涤，去除残留未结合的抗体。
11. 第二天，检查多余的二次抗体已被去除使用共聚焦显微镜。根据需要扩展洗涤，每天更换 2% 的阻塞缓冲液。一旦存在很少或不存在非特异性辅助数据库，则继续操作。
12. 将免疫染色的心脏储存在4°C的PBS中。
13. 直接在全卡式显微镜之前，在37°C下在RIMS溶液中孵育心脏过夜。如果组织仍未完全清除，则将孵育再延长 24 小时。
14. 在 RT 的 RIMS 中存储完全清除和免疫染色的心脏。

4. 使用清除小鼠心脏的单光子共聚焦显微镜成像，在 3D 中可视化非肌细胞种群

注:如果小鼠心脏是胚胎收获的，请继续第4.1节。对于产后收获的小鼠心脏，继续第4.2节。

1. 成像清除的胚胎小鼠心脏
   1. 用 PBS 溶液填充显微镜凹陷幻灯片。
   2. 小心地用弯曲的钳子拾起清除的心脏，并将组织放在幻灯片上。
   3. 用玻璃盖玻片安装幻灯片。组织现在可以在共聚焦显微镜下成像。
2. 成像清除的产后老鼠心脏
   1. 用PBS溶液填充凹陷滑动室的一半。为了创建一个足够大的腔室，以适应成人小鼠的心脏，一个3D打印聚丙烯凹陷幻灯片是定制的（图4）。
   2. 小心地用弯曲的钳子拾起清除的心脏，并将组织放入腔室中。用 PBS 填充造型室的剩余体积。
   3. 用 PBS 填充造型室，使液体表面形成造型室顶部上方的圆顶。安装盖幻灯片。组织现在可以在直立共聚焦显微镜下成像。

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结果

通常，两个最具挑战性的步骤是引导心脏走出胸腔和将LAD与LAD连体。为了排除这些步骤的故障，可以调整第四节间肌肉之间的初始穿刺的位置;如果穿刺和钝剖面离胸骨太近，心脏可能无法退出胸腔（图1A）。

此外，可能需要增加左腹部的压力，以促进这一过程（图1B）。当心脏放在隔节间肌肉上时，也可?...

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讨论

心肌细胞和非肌细胞群之间的细胞相互作用是心脏在受伤后是否会经历纤维化或修复的决定性因素。发现表明，各种细胞类型，包括神经^14，表皮细胞^24，围毛体巨噬细胞^25，动脉12，13，和淋巴内皮^12,13细胞^26，都发挥着重要的调解心脏修复。通过在小鼠身上应用Cre-lox和CRISPR-Cas9技术...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator