לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

Summary

התפשטות הקרדיוציט לאחר הפציעה היא תהליך דינאמי הדורש סימפוניה של רמזים בלתי-מיכיים מאוכלוסיות תאים שאינן מיוציט. ניצול מעקב אחר השושלת, בהירות פסיבית, ושלושה מימדים שלמים של מיקרוסקופ ההרכבה טכניקות, אנחנו יכולים לנתח את ההשפעה של מגוון סוגי תאים על תיקון לב והתחדשות.

Abstract

מחלות לב וכלי דם הבטן כל סיבות אחרות של המוות והוא אחראי על 31% מדהים של מורטליקצבאות ברחבי העולם. מחלה זו מתבטאת בפגיעה בלב, בעיקר בצורה של אוטם שריר הלב חריפה. עם מעט חוסן לאחר הפציעה, רקמת לב בריאה פעם יוחלפו על ידי סיבי, לא הקונקטילה צלקת רקמה ולעתים קרובות להיות הקדמה אי ספיקת לב. כדי לזהות אפשרויות טיפול הרומן ברפואה רגנרטיבית, המחקר התמקד בחוליות עם יכולות משובי מולדת. אחד כזה אורגניזם מודל הוא עכבר ה, אשר מגיב לפציעה לב עם התחדשות חזקה שריר הלב. כדי לגרום לפציעה בעכבר ה, כי הוא רלוונטי קלינית, פיתחנו ניתוח כדי לסגר את העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), שיקוף אוטם שריר הלב המופעל על ידי טרשת עורקים בלב האנושי. מודל זה מספק לנו פלטפורמה לזיהוי המנגנונים המנחים את התחדשות הלב באמצעות הטכנולוגיה למעקב אחר שינויים בתוך האוכלוסיות האנטי-מיוציטים והלא-מיציט. קבלת תובנה על שינויים באוכלוסיות של תאי לב לאחר הפציעה הסתמך פעם בכבדות על שיטות כגון הבחנה רקמות הבדיקה היסטולוגית, אשר מוגבלים ניתוח דו מימדי ולעיתים קרובות נזק הרקמה בתהליך. יתר על כן, שיטות אלה חסרות את היכולת לעקוב אחר שינויים בתאי התאים, במקום זאת מספקת רק תמונה של תגובת הפציעה. כאן, אנו מתארים כיצד שיטות מתקדמות מבחינה טכנולוגית במודלים לאיתור השושלת, ניקוי איברים שלם ותלת מימדי (3D) המיקרוסקופיה מלאה יכול לשמש כדי להבהיר מנגנונים של תיקון לב. עם הפרוטוקול שלנו לניתוח אוטם שריר הלב של העכבר, ניקוי רקמות, 3D איברים שלמים הדמיה, מסלולים מורכבים לגרום להתפשטות הקרדיוציט יכול להיות מורכב, חשיפת מטרות טיפוליות הרומן להתחדשות הלב.

Introduction

הלב כבר זמן רב נחשב להיות עוגב פוסט-mitotic, אך הראיות האחרונות מראות כי התחדשות הקרדיוציט מתרחשת בלב האנושי המבוגר בערך 1% לשנה¹. עם זאת, אלה שיעורי נמוך של מחזור קרדיומיקוציט אינם מספיקים כדי לחדש את אובדן מסיבי של רקמות המתרחשת לאחר הפציעה. לב שסבל אוטם שריר הלב יאבדו סביב 1,000,000,000 קרדיוציטים, לעתים קרובות משמש כהקדמה לכישלון הלב ומוות לב פתאומי^2,3. עם מעל 26,000,000 אנשים מושפעים אי ספיקת לב ברחבי העולם, יש צורך בלתי מתקיים עבור therapeutics שיכול להפוך את הנזקים שנגרמו על ידי מחלת לב⁴.

על מנת לגשר על פער זה בtherapeutics, החלו מדענים לחקור מנגנונים שאינם מנוצלים ושמרו על התחדשות האנדודוגני בעקבות הפציעה. מודל אחד ללימוד התחדשות לב היונקים הוא עכבר ה, הנמצא בתנועה. בתוך שבוע לאחר הלידה, עכברים בעלי הילודה יש תגובה משובי חזקה בעקבות נזק לב⁵. בעבר הדגמנו כי עכברים בעלי שם מסוגלים לחדש את הלב באמצעות התפשטות הקרדיוציט בעקבות כריתת הקודקוד⁵. למרות שטכניקה זו יכולה לעורר התחדשות לב בneonates, הניתוח חסר רלוונטיות קלינית לפציעות לב אנוש. כדי לחקות פציעה אנושית במודל העכבר של התינוק, פיתחנו טכניקה כדי לגרום אוטם שריר הלב דרך עורק כלילי הסגר⁶. טכניקה זו דורשת הארכה כירורגית של העורק האחורי השמאלי הקדמי (בחור), אשר אחראי על אספקת 40%-50% של הדם אל שריר הלב השמאלי בשריר המוח^6,7. כך, הניתוח מביא לסיכונים ההשפעות על חלק ניכר מהחומה השמאלית החדרית. הנזק הזה לשריר הלב יעורר את התפשטות הקרדיוציט ואת התחדשות הלב בneonates⁵.

בעורק העורק הכלילי מספק שיטה מאוד מיועלת וישירה לחשוף את פעולתו הפנימית של התחדשות הלב. הניתוח המנותח מקבילה טרשת עורקים עורק כלילי בלב האדם, שבו הצטברות של הפלאק בתוך הקירות הפנימיים של העורקים יכול לגרום לחסימה ואת אוטם שריר הלב הבאים⁸. בשל חוסר בטיפולים טיפוליים לחולי אי ספיקת לב, חסימה בנער קשורה לשיעורי התמותה המגיעים עד 26% בתוך שנה לאחר פציעה⁹, וכתוצאה מכך נקרא "האלמנה maker". פיתוחים בtherapeutics דורשים מודל המשקף במדויק את ההשפעות הפיסיולוגיים והפתולוגיים המורכבים של פגיעה בליבו. הפרוטוקול הכירורגי שלנו לפגיעה בליבם של העכברים מספק פלטפורמה המאפשרת לחוקרים לחקור את הרמזים המולקולריים והסלולריים המספקים התחדשות לב היונקים לאחר הפציעה.

מחקר שנערך לאחרונה מדגיש את הקשר הדינמי בין סביבת החילוץ לבין הקרדיוומיציטים מתרבים. לדוגמה, חלון התחדשות לידה ניתן להאריך על ידי הפחתת הנוקשות של מטריצה החילוץ סביב הלב¹⁰. ביואטיריאלס מהמטריקס המגמיותיים יכולים גם לקדם התחדשות לב בלבבות יונקים למבוגרים לאחר פגיעה בלב¹¹. גם ליווי התפשטות הקרדיוציט היא תגובה לאנגיוגנטית^12,13; היווצרות עורק הסביבתי ייחודי ליבה מתחדשות של עכבר ה, היתה הכרחית לעירור התחדשות הלב¹². יתר על כן, המעבדה שלנו הוכיחה כי מווסת את הפצת הקרדיוציט ואת התחדשות הלב באמצעות אפנון של רמות גורם הצמיחה, כמו גם את התגובה הדלקתית בעקבות פציעה¹⁴. ממצאים אלה מדגישים את הצורך לעקוב אחר אוכלוסיות תאים שאינן מיציט בתגובה לפציעה בלב. כדי להשיג מטרה זו, אנו יש לנו לנצל את המערכת שילוב מחדש של היצור-לקס בשורות עכברים טרנסגניים לשלב הביטוי הקונסטיטוטיבי או מותנה של כתבת הפלורסנט חלבונים עבור מעקב השושלת. יתר על כן, אנו יכולים להשתמש בשיטות מתקדמות כדי לקבוע התרחבות התפשטות שבטים עם קו העכבר קשת, אשר מסתמך על ביטוי סטוכסטי של כתבים תלויי-צבע התלויים, רב צבעים כדי לקבוע את התפשטות המשובטים של אוכלוסיות ממוקדות תאים¹⁵. העסקת מעקב אחר השושלת עם הניתוח הכלילי של הדום העורקים הוא כלי רב עוצמה לנתח את המנגנונים הסלולריים המורכבות של התחדשות הלב.

מעקב אחר שושלת היוחסין של תאים בעלי תווית של שלושה מימדים (3D) הדמיה של איבר שלם קשה להשיג באמצעות הציבור המסורתי וטכניקת שחזור – במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים הם שבירים, כגון סיבי עצב או כלי דם. בעוד הדמיה מלאה הדמיית העוגב על ידי הדגשות אופטיות יכולות ללכוד אוכלוסיות תאים שטחיות, מבנים השוכנים עמוק בתוך הרקמה נותרים בלתי נגישים. כדי לעקוף מחסומים אלה, טכניקות ניקוי רקמות פותחו כדי להפחית את האטימות של רקמות איברים שלם. לאחרונה, מקדמות משמעותיות נעשו לנקות השומנים-החליפו אקרילאמיד-הוכלא קשיח הדמיה תואם רקמות הידרוג'ל (בהירות)-שיטות מבוססות, אשר רקמה קבועה ברורה באמצעות הפקת ליפיד¹⁶. צעדים נלקחים גם כדי המגון את המדד השבירה ולאחר מכן להפחית פיזור אור בזמן הדמיה¹⁷. שיטה אחת כזאת היא בהירות פעילה, אשר מזירוז פירוק השומנים באמצעות אלקטרופורזה לחדור את אבקת הניקוי לאורך הרקמה¹⁸. למרות יעיל, זה ניקוי רקמות שיטה דורשת ציוד יקר יכול לגרום נזק לרקמות, מה שהופך את הגישה לא תואם אוכלוסיות תאים שברירי כגון עצבי הלב¹⁹. לפיכך, אנו מעסיקים את הגישה בהירות פסיבית, אשר נשענת על חום כדי להקל בעדינות על חדירת חומרי ניקוי, ולכן לסייע בשמירה של מבני תאים מסובכים^20,21.

בהירות פסיבית היא בדרך כלל נחשב פחות יעיל מאשר בהירות פעילה¹⁸, כמו הטכניקה מלווה לעתים קרובות על ידי שני מכשולים עיקריים: חוסר היכולת לנקות את עומק האיבר כולו ואת כמות נרחבת של זמן הנדרש כדי לנקות רקמות מבוגרים. הגישה הפסיבית שלנו בהירות גוברת על שני המחסומים הללו עם תהליך ניקוי מהיר שמסוגל לנקות במלואו את החול ואת רקמת הלב מבוגרים. טכניקת הניקוי הפסיבי של רקמת הבהירות הגיעה ליעילות המאפשרת הדמיה של מגוון אוכלוסיות של תאי לב, כולל אוכלוסיות נדירות המופצות ברחבי הלב המבוגר. כאשר הלב הנקי הוא התמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי, את הארכיטקטורה של המבנה הספציפי לתא במהלך פיתוח, מחלה, והתחדשות יכול להיות מואר.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לשימוש ולטיפול בבעלי חיים מעבדתיים ובציות לועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים בבית הספר לרפואה ובריאות הציבור באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. כל השיטות נערכו על סוג פראי C57BL/6J (B6) וקווי העכבר הטרנסגניים שהתקבלו ממעבדות ג'קסון.

1. סגר עורק כלילי (אוטם שריר הלב) הנגרמת באמצעות הארכה של העורק הקדמי שמאלי (LAD) ב-1-יום עכברים של המלך הישן⁶

1. הפרד את גורי התינוק בן היום מהאמא על ידי הצבת אותם לכלוב נקי יחד עם החומר הקינון המקורי.
2. מניחים חצי כלוב על כרית חימום שנקבעה לחום בינוני. הגורים צריכים להישאר בצד הבלתי מחומם של הכלוב, רק להיות ממוקם על הצד המחומם לאחר הניתוח.
3. צור אזור כירורגי סטרילי תחת מיקרוסקופ הפעלה. איסוף ציוד כירורגי מעוקר (שולחן 1).
4. הגור הכלבלב באמצעות היפותרמיה: לעטוף את הגור בגזה כדי למנוע מגע ישיר בעור עם קרח ולקבור אותו במיטת קרח בערך 3 – 4 דקות. בדוק היפותרמיה של העכברים מדי פעם על ידי ביצוע צביטה בבוהן. Neonates לסבול היפותרמיה היטב, עם זאת, חשיפה ממושכת להיפותרמיה עלולה לגרום לכוויות קור ולתמותה שלאחר מכן.
5. פעם מורדם, למקם את העכבר על האזור כירורגי במצב פרקדן, אבטחת הזרועות והרגליים עם קלטת. לחטא את האזור הכירורגי של העכבר עם פתרון אנטיספטי.
6. לאתר את אזור החזה התחתון ולעשות חתך רוחבי בעור עם המספריים מבתר קטן. כדי להרחיב את ההשקפה כירורגית של הצלעות, להפריד את העור מן השריר על ידי הרמת העור בעדינות עם זוג מלקחיים ההלבשה ולחץ בעדינות על השרירים הבינקוסטל עם מספריים קטנים במצב סגור.
7. אתר את החלל הבינקוסטל הרביעי (איור 1א) והפוך לנקב קטן ושטחי בעזרת מלקחיים חדים, והיזהר שלא לנקב איברים פנימיים. בצע ניתוח קהה על ידי הרחבת האזור בין השרירים הבינקורבית עם מלקחיים ההלבשה. המיקום האנטומי הנכון של החתך חיוני לגישה המתאימה ללב.
8. בעדינות להנחות את הלב מתוך חלל החזה על ידי הצבת אצבע והפעלת לחץ הולך וגובר בצד שמאל של הבטן תוך החזקת החלל האינטרקוסטל פתוח עם מלקחיים ההלבשה (איור 1B). לאחר הלב הוא מחוץ לחזה, להסיר את מלקחיים ההלבשה, להקל על הלחץ, ולאפשר ללב לנוח על השרירים הבינקוסטל.
9. אתר את הנער כאזור הלב כי יש פחות דם במאגר והוא בתנוחה האנטומית הנכונה (איור 1ג). הנער ניתן לראות רק מתחת למיקרוסקופ אם הגישה ללב בתוך כמה דקות של התחלת הניתוח.
10. ביצוע הקשר lad על ידי תפירה הנער עם תפר 6-0 (איור 1D). לקשור קשר מרובע פעמיים כדי לגרום אוטם שריר הלב (איור 1E). העומק של תפר לתוך שריר הלב עשוי להשתנות, עם זאת, מיקום אנטומי נאות של ליטל בחור הוא חיוני לצורך התוכסות. כאשר ליגפת הנער, יש למשוך את התפר בחוזקה אך בזהירות כדי לא לנתק את הנער. החולצ'ינג בקודקוד הלב יראו מיד (איור 1E)
11. הניחו ללב להחליק בחזרה לחלל החזה; תהליך זה ניתן להקל בעדינות עם מלקחיים ההלבשה. תפר את הצלעות יחד עם הקשר של מנתח ואחריו קשר מרובע, באמצעות מלקחיים קהה להרים את הסט העליון של צלעות תוך העברת תפר 6-0 דרך החלק העליון והתחתון של צלעות.
12. הסר את הקלטת ששימש לאבטחת הרגליים האחוריות של הכלבלב.
13. לדבוק את העור יחד על ידי הצבת כמות קטנה של דבק העור על הבטן העליונה. ואז, לתפוס את העור של הבטן התחתונה עם מלקחיים עדינים לכסות את אזור החזה חשוף. הגבל את כמות הדבק העודף שנשאר על הגורים, משום שזה יכול להגביר את הסבירות לדחייה ולקניבליזם על ידי האם.
14. מיד להקל על ההתאוששות מן ההרדמה על ידי הצבת הגור על כרית חימום להגדיר חום בינוני. מדי פעם מחליפים את מיקום הneonates כדי לחמם את כל חלקי הגוף באופן שווה.
15. אפשר neonate להישאר ישירות על משטח החימום עבור 10 – 15 דקות. בדרך כלל, התנועה היא חזרה בתוך 5 דקות של להיות ממוקם על החום.
16. נקו את שרידי הדם והדבק בעזרת מחיקת אלכוהול.
17. כיסו ריחות זרים על neonates על ידי לשפשף את כל הגוף עם מצעים מהכלוב המקורי. מניחים את הגור לתוך הכלוב בצד המחומם בעוד ניתוחים אחרים מתבצעים.
18. לאחר כל הניתוחים הושלמו, גורי הם חמים וניידים, להעביר את הפסולת יחד עם החומר הקינון המקורי לכלוב של האם.
19. לעקוב אחר העכברים עבור 30-60 דקות לאחר הניתוח ולצפות הקבלה של האם של הגורים על ידי קינון ו/או לטפח.
20. בדקו את העכברים. בבוקר שאחרי הניתוח אם אמא במצוקה ולא מקוננת גורים, שקול אם מאמצת לגורים.

2. ניקוי לב העכבר עם בהירות פסיבית^21,22,23

1. . לדבר עם העכבר בעזרת מלגלית לבצע צביטה הבוהן כדי להבטיח את העכבר הוא הרגעה לחלוטין.
2. מניחים את העכבר על האזור נקי, כירורגי במצב פרקדן, אבטחת הזרועות והרגליים עם קלטת.
3. לשמור על הרגעה על העכבר באמצעות חרוט האף עד שהלב מופק.
4. פתח את החזה התחתון על ידי החזקת הפרווה ממש מתחת לתהליך xiphoid עם מלקחיים רקמות ולעשות חתך מבעד לרוחב של הצלעות באמצעות מספריים לבתר גדול.
5. חותכים לצד החלק המרוחק של. כלוב הצלעות עם מספריים כירורגיים
6. לחשוף את שריר הסרעפת על ידי האוחז התהליך xiphoid עם מלקחיים רקמות. ניתוק הסרעפת באמצעות מלקחיים מעוקלים.
7. תוך שמירה על התפיסה של תהליך xiphoid, למשוך את גולגולת הרקמה עד הלב הפועם נגיש.
8. לתפוס את הלב בבסיס עם מלקחיים מעוקל ולנתח את הלב מחלל החזה על ידי חיתוך העורקים והבנה העליון מעולה עם מספריים iridectomy.
9. בעוד הלב עדיין פועם, הניחו את הלב לתוך צלחת פטרי מלאה בערוץ ה-PBS כך שהלב מונע את הדם בפנים כפי שהוא ממשיך לפעום. אוטם שריר הלב יכול להיות מאושר על ידי בדיקה כי המיקום של תפר הוא בתנוחה האנטומית הנכונה עבור ליטל בחור.
10. לסחוט בעדינות את הלב עם מלקחיים כדי לאפשר ללב לגרש את שרידי הדם.
11. העבר את לב העכבר לתוך בקבוקון חד פעמי 2.5 מ"ל זכוכית עם 2 מ ל של PBS. לשטוף את הדם שיורית על ידי הדגירה של הלב על שייקר עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מספר פעמים. שינוי פתרון ה-PBS בכל פעם. עד שערוץ הpbs יישאר נקי
12. להיפטר PBS ולמלא את המבחנה עם 2 מ ל קר 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית). דגירה 4 שעות ב RT (איור 2א).
13. לאחר הדגירה, למחוק את התחתית ואת המבחנה עם 2 מ ל של PBS. לשטוף את הלב על שייקר במשך 10 דקות ב RT. חזור על צעד הכביסה פעמיים, ניקוז ומילוי המבחנה עם PBS חדש בכל פעם כדי לשטוף לחלוטין את החצי השני של החצי השני.
14. להיפטר PBS ולמלא את הבקבוקון עם 2 מ ל של 4% אקרילide ו 0.5% VA-044 פתרון. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
15. למחרת, לבצע פולימוניזציה על ידי העברת המבחנה לבלוק חום להגדיר ב 37 ° c עבור 3 שעות.
16. להעביר את הלב לתוך בקבוקון מעטפת זכוכית חדשה וחזור על שלב 2.12 (מחזור כביסה PBS).
17. להיפטר PBS ולמלא את הבקבוקון עם 2 מ ל ניקוי פתרון (שולחן 2). מודטה ב 37 ° c עד שהלב נקי. לשנות את הפתרון ומילוי מחדש עם פתרון ניקוי טרי מדי 2 – 3 ימים. תהליך הסליקה יכול להימשך עד מספר שבועות (איור 2ב-ג).
    הערה: לבבות P1 בדרך כלל לקחת סביב 3 – 5 ימים, בעוד P21 לבבות יכולים לקחת כמעט חודש לפני סליקה הדגירה הפתרון הושלמה.
18. להיפטר PBS ולמלא את הבקבוקון עם 2 מ ל של PBS ולחזור על שלב 2.12 (מחזור כביסה PBS). למלא את המבחנה עם PBS טרי ו הדגירה לילה ב 37 ° c.
19. אם יבוצע כתמים, דלג על שלבים 2.21 – 2.22 והמשך לסעיף 3 עבור כתמים חיסוני. אם להסתמך אך ורק על הזריחה אנדודוגני, להמשיך עם צעדים 2.21 – 2.22 ולדלג על סעיף 3.
20. להיפטר PBS ולשנות את הפתרון להתאמה התאמת אינדקס פתרון (החישוקים) (שולחן 3). המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
21. לאחר הדגירה, הרקמה הנקיה ניתן לאחסן בתמיסה המכון ב RT. הרקמה עשויה להיראות לבן ואטום במרכז כאשר הועברו לראשונה לתוך החישוקים; רקמות צריך להיות שקוף לאחר הדגירה ב החישוקים בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות (איור 2ד).

3. אופציונלי: מכתים אימונוהיסטוכימיה של הלב המלא של הר העכבר

1. הסר את הלב הנקי מהפתרון המכון והמקום לתוך בקבוקון זכוכית נקי 2.5 mL עם 2 מ ל של PBST (PBS עם 0.1% טריטון-X 100)
2. לשטוף את הלב ב PBST 3 פעמים על מסובבי מסלולית עם 30 דקות incubations ב RT.
3. בלוק כריכת נוגדנים לא ספציפית על ידי העברת הלב ב 2 מ ל של 20% חסימת מאגר (מדולל ב-PBST) ו דגירה עם סיבוב עבור 3 שעות ב RT. העברה עד 4 ° צ' כדי לכתם עם סיבוב לילה.
   הערה: חסימת המאגר עשויה מנסיוב רגיל התואם את המינים בהם הועלה הנוגדן המשני.
4. לשטוף את הלב ב PBST 3 פעמים עם סיבוב עבור 5 דקות incubations ב RT.
5. לטבול את הלב של הנוגדן העיקרי (מדולל ב 2% חסימת מאגר עם PBST) ולמנוע חשיפה באור על ידי גלישת בקבוקון זכוכית רדיד אלומיניום. דגירה עם סיבוב לילה ב RT.
   הערה: מנקודה זו קדימה, רדיד אלומיניום צריך להיות משמש ללא הרף כדי להגן על המשני מפני חשיפה לאור סביבתי.
6. המשך 24 שעות נוספות עם סיבוב ב-4 ° c.
7. בעקבות כתמים ראשוניים, חזור על שלב 3.2 (מחזור לשטוף PBST ארוך) כדי להסיר את הנוגדן העיקרי מפני הרקמה. להאריך את השטיפה עם הדגירה לילה עם סיבוב ב RT.
8. עבודה באזור עם תאורה מוגבלת כדי למנוע חשיפה משנית האור, לטבול את הלב בנוגדן משני (מדולל ב 2% חסימת מאגר עם PBST) ו דגירה עם סיבוב עבור 3 שעות ב RT. העברה עד 4 ° צ' כדי לכתם עם סיבוב לילה.
9. ביום למחרת, חזור על שלב 3.2 (מחזור PBST לשטוף הארוך) כדי להסיר נוגדן משני לא מאוגד.
10. החלף את הפתרון עם מאגר חסימה של 2% (מדולל ב-PBST). להסיר נוגדנים מאוגד שיורית על ידי שטיפת לילה עם סיבוב ב RT.
11. ביום שלמחרת, בדוק כי הנוגדן המשני העודף הוסר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית. הארך את הכביסה בהתאם לצורך, והחליף את פתרון המאגר של 2% מדי יום. המשך פעם קטנה ללא משנית שאינה מסוימת קיימת.
12. יש לאחסן את הלב החיסוני ב-PBS ב-4 ° c.
13. ישירות לפני המיקרוסקופיה מלאה, מודיית את הלב בפתרון המכון ללילה ב 37 ° c. להאריך את הדגירה 24 שעות נוספות אם הרקמה עדיין לא מנוקה לחלוטין.
14. אחסן את הניקוי המלא ואת לב חיסוני ב החישוקים ב RT.

4. המחשה של אוכלוסיות שאינן מיציט ב-3D עם הדמיה חד-פוטון Confocal יקרוסקופית מיקרוסקופיה של לב העכבר הנקי

הערה: אם לבבות העכבר הם קצרו embryonically, להמשיך עם סעיף 4.1. עבור לבבות עכבר שנקטפו postnatally, להמשיך עם סעיף 4.2.

1. הדמיה הלב עובריים מנוקה העכבר
   1. מלא את השקע המיקרוסקופ באמצעות פתרון ה-PBS.
   2. בזהירות להרים את הלב נקי עם מלקחיים מעוקל ולמקם את הרקמה על השקופית.
   3. הר את השקופית עם שמיכות זכוכית. הרקמה יכולה להיות מיועלת כעת. תחת מיקרוסקופ קונמוקד
2. הדמיה של לב העכבר פוסטנטאל מנוקה
   1. מלא את מחצית החדר של שקופית הדיכאון עם פתרון PBS. על מנת ליצור חדר גדול מספיק כדי להתאים לב עכבר למבוגרים, שקופית דיכאון מודפס 3D-פוליפרופילן היה מותאם אישית (איור 4).
   2. בזהירות להרים את הלב נקי עם מלקחיים מעוקל ולמקם את הרקמה לתוך החדר. מלא את הנפח הנותר של התא עם PBS.
   3. מלאו את החדר עם PBS כך שהמשטח של הנוזל מהווה כיפה מעל החלק העליון של החדר. הבהר את שקופית הכיסוי. הרקמה יכולה להיות מיועלת כעת. תחת מיקרוסקופ ממוקד זקוף

תוצאות

לעתים קרובות שני הצעדים המאתגרים ביותר מנחה את הלב מתוך חלל החזה ליגגאת LAD. כדי לפתור את הפעולות הבאות, ניתן לבצע התאמות במיקום הניקוב הראשוני בין השרירים הבין-מפרידים הרביעית; אם הניקוב והניתוח הקהה קרובים מדי בסמיכות לעצם החזה, ייתכן שהלב לא יוכל לצאת מחלל החזה (איור 1...

Discussion

אינטראקציות תא תא בין האוכלוסייה הקרדיוציטים לבין אוכלוסיות שאינן מיוציט הן גורם הקובע אם הלב יעבור פיברוזיס או יתקן לאחר הפציעה. תגליות נעשו להפגין כי מגוון של סוגי תאים, כולל עצבים¹⁴, תאים אפירחיוג²⁴, מקרופאגים הצפק²⁵, העורקי העורקים^12...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator