Captura de la respuesta de la lesión cardíaca de las poblaciones celulares objetivo a través de imágenes tridimensionales del corazón despejado

Resumen

La proliferación de cardiomiocitos después de una lesión es un proceso dinámico que requiere una sinfonía de señales extracelulares de poblaciones de células no miocitos. Utilizando el trazado de linaje, la CLARIDAD pasiva y las técnicas tridimensionales de microscopía confocal de montaje completo, podemos analizar la influencia de una variedad de tipos de células en la reparación y regeneración cardíaca.

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares son las que más se operando a todas las demás causas de muerte y son responsables de un asombroso 31% de las muertes en todo el mundo. Esta enfermedad se manifiesta en lesiones cardíacas, principalmente en forma de un infarto agudo de miocardio. Con poca resiliencia después de una lesión, el tejido cardíaco una vez sano será reemplazado por tejido cicatricial fibroso, no contráctelo y a menudo será un preludio de la insuficiencia cardíaca. Para identificar nuevas opciones de tratamiento en medicina regenerativa, la investigación se ha centrado en vertebrados con capacidades regenerativas innatas. Uno de estos organismos modelo es el ratón neonatal, que responde a una lesión cardíaca con una sólida regeneración miocárdica. Con el fin de inducir una lesión en el ratón neonatal que es clínicamente relevante, hemos desarrollado una cirugía para ocluir la arteria descendente anterior izquierda (LAD), reflejando un infarto de miocardio desencadenado por la aterosclerosis en el corazón humano. Cuando se combina con la tecnología para realizar un seguimiento de los cambios tanto dentro de las poblaciones de cardiomiocitos como de no miocitos, este modelo nos proporciona una plataforma para identificar los mecanismos que guían la regeneración del corazón. Obtener información sobre los cambios en las poblaciones de células cardíacas después de la lesión una vez se basó en gran medida en métodos como la sección de tejidos y el examen histológico, que se limitan al análisis bidimensional y a menudo dañan el tejido en el proceso. Además, estos métodos carecen de la capacidad de rastrear los cambios en los linajes celulares, sino que proporcionan simplemente una instantánea de la respuesta a la lesión. Aquí, describimos cómo los métodos tecnológicamente avanzados en los modelos de trazado de linaje, la limpieza de órganos enteros y la microscopía tridimensional (3D) de montaje completo se pueden utilizar para dilucidar los mecanismos de reparación cardíaca. Con nuestro protocolo para la cirugía de infarto de miocardio de ratón neonatal, la limpieza de tejidos y la toma de imágenes de órganos enteros en 3D, las complejas vías que inducen la proliferación de cardiomiocitos pueden desentrañarse, revelando nuevas dianas terapéuticas para la regeneración cardíaca.

Introducción

El corazón ha sido considerado durante mucho tiempo como un órgano post-mitótico, sin embargo, la evidencia reciente demuestra que la renovación de cardiomiocitos ocurre en el corazón humano adulto en alrededor del 1% por año¹. Sin embargo, estas bajas tasas de rotación de cardiomiocitos son insuficientes para reponer la pérdida masiva de tejido que se produce después de una lesión. Un corazón que ha sufrido un infarto de miocardio perderá alrededor de mil millones de cardiomiocitos, a menudo sirviendo como preludio de la insuficiencia cardíaca y la muerte súbita cardíaca^2,3. Con más de 26 millones de personas afectadas por insuficiencia cardíaca en todo el mundo, existe una necesidad insatisfecha de terapias que puedan revertir los daños infligidos por la enfermedad cardíaca⁴.

Con el fin de cerrar esta brecha en las terapias, los científicos han comenzado a investigar los mecanismos evolutivamente conservados que subyacen a la regeneración endógena después de la lesión. Un modelo para estudiar la regeneración cardíaca de los mamíferos es el ratón neonatal. Dentro de la semana siguiente al nacimiento, los ratones neonatales tienen una respuesta regenerativa robusta después de daños cardíacos⁵. Hemos demostrado previamente que los ratones neonatales pueden regenerar su corazón a través de la proliferación de cardiomiocitos después de una resección apical⁵. Aunque esta técnica puede evocar la regeneración cardíaca en los neonatos, la cirugía carece de relevancia clínica para las lesiones cardíacas humanas. Con el fin de imitar una lesión humana en el modelo de ratón neonatal, hemos desarrollado una técnica para inducir un infarto de miocardio a través de una oclusión de la arteria coronaria^6. Esta técnica requiere ligadura quirúrgica de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), que es responsable de entregar 40%–50% de la sangre al miocardio ventricular izquierdo^6,7. Por lo tanto, la cirugía resulta en un infarto que afecta a una porción significativa de la pared ventricular izquierda. Este daño al miocardio estimulará la proliferación de cardiomiocitos y la regeneración del corazón en los neonatos^5.

La cirugía de oclusión de la arteria coronaria proporciona un método altamente reproducible y directamente traslacional para descubrir el funcionamiento interno de la regeneración cardíaca. La cirugía neonatal es paralela a la aterosclerosis de la arteria coronaria en el corazón humano, donde la acumulación de placa dentro de las paredes internas de las arterias puede causar una oclusión y posterior infarto de miocardio^8. Debido a un vacío en los tratamientos terapéuticos para pacientes con insuficiencia cardíaca, una oclusión en el LAD se asocia con tasas de mortalidad que alcanzan hasta el 26% dentro de un año después de la lesión^9,y en consecuencia se ha llamado el "fabricante de viudas". Los avances en el tratamiento requieren un modelo que refleje con precisión los complejos efectos fisiológicos y patológicos de las lesiones cardíacas. Nuestro protocolo quirúrgico para lesiones cardíacas de ratón neonatal proporciona una plataforma que permite a los investigadores investigar las señales moleculares y celulares que señalan la regeneración cardíaca de los mamíferos después de la lesión.

Investigaciones recientes ponen de relieve la relación dinámica entre el entorno extracelular y la proliferación de los cardiomiocitos. Por ejemplo, la ventana regenerativa postnatal se puede extender disminuyendo la rigidez de la matriz extracelular que rodea el corazón¹⁰. Los biomateriales de la matriz extracelular neonatal también pueden promover la regeneración cardíaca en corazones adultos de mamíferos después de una lesión cardíaca^11. También acompañando la proliferación de cardiomiocitos es una respuesta angiogénica^12,13; la formación de arterias colaterales únicas en el corazón regenerador del ratón neonatal demostró ser esencial para estimular la regeneración cardíaca^12. Además, nuestro laboratorio ha demostrado que la señalización nerviosa regula la proliferación de cardiomiocitos y la regeneración cardíaca a través de la modulación de los niveles de factor de crecimiento, así como la respuesta inflamatoria después de la lesión¹⁴. Estos hallazgos enfatizan la necesidad de rastrear las poblaciones de células no miocitos en respuesta a una lesión cardíaca. Para lograr este objetivo, hemos aprovechado el sistema de recombinación Cre-lox en líneas de ratones transgénicos para incorporar la expresión constitutiva o condicional de proteínas fluorescentes de reportero para el rastreo de linaje. Además, podemos utilizar métodos avanzados para determinar el patrón de expansión clonal con la línea de ratón Rainbow, que se basa en la expresión estocástica de los reporteros fluorescentes multicolores dependientes de Cre para determinar la expansión clonal de las poblaciones de células objetivo^15. El uso del trazado de linaje con la cirugía de oclusión de la arteria coronaria neonatal es una poderosa herramienta para disuacar los intrincados mecanismos celulares de la regeneración cardíaca.

El seguimiento del linaje de células etiquetadas fluorescentes con imágenes tridimensionales (3D) de órganos enteros es difícil de lograr utilizando la técnica tradicional de seccionamiento y reconstrucción, especialmente cuando las poblaciones celulares son frágiles, como las fibras nerviosas o los vasos sanguíneos. Mientras que las imágenes directas de montaje completo del órgano mediante seccionamiento óptico pueden capturar poblaciones celulares superficiales, las estructuras que residen profundamente dentro del tejido permanecen inaccesibles. Para eludir estas barreras, se han desarrollado técnicas de limpieza de tejidos para reducir la opacidad de los tejidos de órganos enteros. Recientemente, se han realizado avances significativos a los métodos basados en hidrogel rígido con imágenes rígidas híbridos con acrilamida transparente, que limpian el tejido fijo mediante la extracción de lípidos^16. También se toman medidas para homogeneizar el índice de refracción y, posteriormente, reducir la dispersión de la luz durante la toma de imágenes^17. Uno de estos métodos es la CLARIDAD activa, que acelera la descomposición de los lípidos mediante el uso de electroforesis para penetrar el detergente en todo el tejido¹⁸. Aunque eficaz, este método de limpieza de tejido requiere equipos costosos y puede causar daño tisular, haciendo que el enfoque sea incompatible con poblaciones celulares frágiles como los nervios cardíacos^19. Por lo tanto, empleamos el enfoque pasivo CLARITY, que se basa en el calor para facilitar suavemente la penetración del detergente, ayudando así en la retención de intrincadas estructuras celulares^20,21.

Por lo general, se piensa que la CLARIDAD Pasiva es menos eficiente que la CLARITY¹⁸activa, ya que la técnica suele ir acompañada de dos obstáculos principales: la incapacidad de eliminar toda la profundidad del órgano y la gran cantidad de tiempo necesario para limpiar los tejidos adultos. Nuestro enfoque pasivo DE CLARITY supera ambas barreras con un proceso de limpieza expeditado que es capaz de eliminar completamente el tejido cardíaco neonatal y adulto. Nuestra técnica pasiva de limpieza de tejido CLARITY ha alcanzado una eficiencia que permite la visualización de una variedad de poblaciones de células cardíacas, incluyendo poblaciones raras distribuidas por todo el corazón adulto. Cuando el corazón despejado se muestra con microscopía confocal, se puede iluminar la arquitectura del patrón específico de la célula durante el desarrollo, la enfermedad y la regeneración.

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Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio y de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Escuela de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin-Madison. Todos los métodos se realizaron en líneas de ratón transgénicas (B6) y transgénicas de tipo salvaje C57BL/6J (B6) y líneas de ratón transgénicas obtenidas de Jackson Laboratories.

1. Oclusión de la arteria coronaria (infarto de miocardio) Inducida a través de la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en ratones neonatales de 1 día de edad⁶

1. Separe los cachorros neonatales de 1 día de edad de la madre colocándolos en una jaula limpia junto con parte del material de anidación original.
2. Coloque la mitad de la jaula en una almohadilla de calentamiento a fuego medio. Los cachorros deben permanecer en el lado no calentado de la jaula, sólo se colocan en el lado calentado después de la cirugía.
3. Cree un área quirúrgica estéril bajo un microscopio operativo. Reunir equipo quirúrgico esterilizado (Tabla 1).
4. Anestesiar el cachorro a través de la hipotermia: envuelva el cachorro en gasa para evitar el contacto directo de la piel con el hielo y enterrarlo en un lecho de hielo durante aproximadamente 3-4 min. Compruebe la hipotermia de los ratones periódicamente realizando un pellizco en el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo. Sin embargo, los neonatos toleran bien la hipotermia, la exposición prolongada a la hipotermia puede provocar congelación y mortalidad posterior.
5. Una vez anestesiado, coloque el ratón sobre el área quirúrgica en la posición supina, asegurando los brazos y las piernas con cinta adhesiva. Esterilice el área quirúrgica del ratón con una solución antiséptica.
6. Localice la región inferior del pecho y haga una incisión transversal en la piel con pequeñas tijeras diseladores. Para ampliar la vista quirúrgica de las costillas, separe la piel del músculo levantando suavemente la piel con un par de fórceps de vendaje y presione suavemente contra los músculos intercostales con las tijeras pequeñas en la posición cerrada.
7. Localice el cuarto espacio intercostal(Figura 1A)y haga una pequeña punción superficial usando fórceps afilados, teniendo cuidado de no perforar ningún órgano interno. Realizar una disección contundente mediante el ensanchamiento de la zona entre los músculos intercostales con fórceps de vendaje. El posicionamiento anatómico adecuado de la incisión es esencial para un acceso adecuado al corazón.
8. Guíe suavemente el corazón fuera de la cavidad torácica colocando un dedo y aplicando una presión creciente en el lado izquierdo del abdomen mientras mantiene abierto el espacio intercostal con fórceps de apósito(Figura 1B). Una vez que el corazón está fuera del pecho, retire los fórceps del vendaje, alivie la presión y permita que el corazón descanse sobre los músculos intercostales.
9. Localice el LAD como el área del corazón que tiene menos sangre en la masa y está en la posición anatómica correcta(Figura 1C). El LAD solo se puede ver bajo el microscopio si se accede al corazón a los pocos minutos de comenzar la cirugía.
10. Realice la ligadura LAD suturando el LAD con una sutura 6-0(Figura 1D). Ate un nudo cuadrado dos veces para inducir el infarto de miocardio(Figura 1E). La profundidad de la sutura en el miocardio puede variar, sin embargo, el posicionamiento anatómico adecuado de la ligadura LAD es crucial para la reproducibilidad. Al ligar el LAD, la sutura debe ser tirada firmemente pero con cuidado para no cortar el LAD. El blanqueamiento en el ápice del corazón se verá inmediatamente(Figura 1E)
11. Permita que el corazón vuelva a caer en la cavidad torácica; este proceso se puede facilitar suavemente con fórceps de vendaje. Sutura las costillas junto con un nudo de cirujano seguido de un nudo cuadrado, usando fórceps contundentes para levantar el conjunto superior de costillas mientras pasa una sutura 6-0 a través del conjunto superior e inferior de costillas.
12. Retire la cinta que se utilizó para asegurar las patas traseras del cachorro.
13. Adherir la piel mediante la colocación de una pequeña cantidad de pegamento de la piel en la parte superior del abdomen. Luego, agarra la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps finos y cubre la región del pecho expuesta. Limitar la cantidad de exceso de pegamento que queda en los cachorros, ya que esto puede aumentar la probabilidad de rechazo y canibalismo por parte de la madre.
14. Facilitar inmediatamente la recuperación de la anestesia colocando el cachorro en una almohadilla de calentamiento a fuego medio. Cambie periódicamente la colocación de los neonatos para calentar uniformemente todas las partes del cuerpo.
15. Permita que el neonato permanezca directamente en la almohadilla de calentamiento durante 10-15 min. Típicamente, el movimiento se recupera dentro de 5 minutos de ser colocado sobre el calor.
16. Limpie la sangre residual y péguela con una toallita con alcohol.
17. Cubre los aromas extraños en los neonatos frotando todo el cuerpo con ropa de cama de la jaula original. Coloque el cachorro en la jaula del lado calentado mientras se realizan otras cirugías.
18. Una vez que todas las cirugías se hayan completado y los cachorros estén calientes y móviles, transfiera la basura junto con el material de anidación original a la jaula de la madre.
19. Monitoree a los ratones durante 30-60 minutos después de la cirugía y observe la aceptación de la madre de los cachorros anidando y/o acicalándose.
20. Revise a los ratones la mañana siguiente a la cirugía. Si la madre está angustiada y no ha anidado a los cachorros, considere una madre adoptiva para los cachorros.

2. Borrar el corazón del ratón con claridad pasiva^21,22,23

1. Anestetizar el ratón con isoflurano. Realice un pellizco de dedo del dedo del dedo del ratón para asegurarse de que el ratón está completamente sedado.
2. Coloque el ratón en un área quirúrgica limpia en la posición supina, asegurando los brazos y las piernas con cinta adhesiva.
3. Mantenga la sedación de isoflurano en el ratón usando un cono nasal hasta que se extraiga el corazón.
4. Abra la parte inferior del pecho sosteniendo el pelaje justo debajo del proceso de xifoide con fórceps de tejido y haga una incisión que abarque el ancho de la caja torácica usando las tijeras de diselación grandes.
5. Corte junto a las porciones distales de la caja torácica con tijeras quirúrgicas.
6. Exponga el músculo del diafragma agarrando el proceso de xifoide con fórceps tisulares. Separe el diafragma con fórceps curvos.
7. Mientras mantiene una comprensión del proceso de xifoide, tire del tejido cranealmente hasta que el corazón latiendo sea accesible.
8. Sujete el corazón a la base con fórceps curvos y diseccione el corazón de la cavidad torácica cortando la aorta y la vena cava superior con tijeras de iridectomía.
9. Mientras el corazón todavía late, coloca el corazón en un plato de Petri lleno de PBS para que el corazón bombee la sangre dentro mientras sigue latiendo. El infarto de miocardio se puede confirmar comprobando que la colocación de la sutura está en la posición anatómica adecuada para la ligadura LAD.
10. Apriete suavemente el corazón con fórceps para permitir que el corazón expulse la sangre residual.
11. Transfiera el corazón del ratón a un vial desechable de 2,5 ml de cáscara de vidrio con 2 ml de PBS. Lavar la sangre residual incubando el corazón en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) varias veces. Cambie la solución PBS cada vez hasta que PBS permanezca claro.
12. Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de frío 4% paraformaldehído (PFA). Incubar durante 4 horas en RT(Figura 2A).
13. Después de la incubación, deseche el PFA y el vial con 2 ml de PBS. Lavar el corazón en una coctelera durante 10 minutos en RT. Repita el paso de lavado dos veces, drenando y llenando el vial con nuevo PBS cada vez para lavar completamente el exceso de PFA.
14. Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de 4% de acrilamida y 0,5% de solución VA-044. Incubar durante la noche a 4oC.
15. Al día siguiente, realice la polimerización transfiriendo el vial a un bloque de calor establecido a 37oC durante 3 horas.
16. Transfiera el corazón a un nuevo vial de cáscara de vidrio y repita el paso 2.12 (ciclo de lavado DE PBS).
17. Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de solución de compensación (Tabla 2). Incubar a 37oC hasta que el corazón se despeje. Cambie la solución y rellene con una solución de compensación fresca cada 2-3 días. El proceso de compensación podría tardar hasta varias semanas(Figura 2B-C).
    NOTA: Los corazones P1 suelen tardar entre 3 y 5 días, mientras que los corazones P21 pueden tardar casi un mes antes de que se complete la incubación de la solución.
18. Deseche el PBS y llene el vial con 2 ml de PBS y repita el paso 2.12 (ciclo de lavado de PBS). Rellene el vial con PBS fresco e incubar durante la noche a 37 oC.
19. Si se realizará inmunostaining, omita los pasos 2.21–2.22 y proceda a la Sección 3 para la inmunomancha. Si se basa únicamente en fluorescencia endógena, proceda con los pasos 2.21–2.22 y omita la Sección 3.
20. Deseche PBS y cambie la solución a Refractive Index Matching Solution (RIMS)(Tabla 3). Incubar durante la noche a 37oC.
21. Después de la incubación, el tejido despejado se puede almacenar en la solución RIMS en RT. El tejido puede parecer blanco y opaco en el centro cuando se transfiere por primera vez a RIMS; tejido debe volverse transparente después de ser incubado en RIMS a temperatura ambiente durante varias semanas (Figura 2D).

3. Opcional: Mancha inmunohistoquímica del corazón del ratón de montaje completo

1. Retire el corazón despejado de la solución RIMS y colóquelo en un vial de vidrio limpio de 2,5 ml con 2 ml de PBST (PBS con 0,1% De tritón-X 100)
2. Lave el corazón en PBST 3 veces en un rotador orbital con incubaciones de 30 minutos a RT.
3. Bloquear la unión de anticuerpos no específicos sumergiendo el corazón en 2 ml de tampón de bloqueo del 20% (diluido en PBST) e incubar con rotación durante 3 horas en RT. Transfiera a 4 oC a la mancha con rotación durante la noche.
   NOTA: El tampón de bloqueo está hecho de suero normal que coincide con la especie en la que se elevó el anticuerpo secundario.
4. Lave el corazón en PBST 3 veces con rotación para incubaciones de 5 minutos a RT.
5. Sumerja el corazón en anticuerpos primarios (diluido en un tampón de bloqueo del 2% con PBST) y evite la exposición a la luz envolviendo el vial de vidrio en papel de aluminio. Incubar con rotación durante la noche a RT.
   NOTA: A partir de este momento, la lámina de aluminio debe utilizarse continuamente para proteger el secundario de la exposición a la luz ambiental.
6. Incubar durante 24 horas adicionales con rotación a 4oC.
7. Después de la tinción primaria, repita el paso 3.2 (ciclo de lavado PBST largo) para eliminar el anticuerpo primario no unido del tejido. Extienda el lavado con una incubación durante la noche con rotación en RT.
8. Trabajando en un área con iluminación limitada para prevenir la exposición a la luz de anticuerpos secundarios, sumergir el corazón en anticuerpos secundarios (diluido en un tampón de bloqueo del 2% con PBST) e incubar con rotación durante 3 horas en RT. Transfiera a 4 oC para manchar con rotación durante la noche.
9. Al día siguiente, repita el paso 3.2 (ciclo de lavado PBST largo) para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
10. Reemplace la solución por un búfer de bloqueo del 2% (diluido en PBST). Retire el anticuerpo residual sin consolidar lavando durante la noche con rotación en RT.
11. Al día siguiente, compruebe que el exceso de anticuerpos secundarios se ha eliminado mediante microscopía confocal. Extienda el lavado según sea necesario, reemplazando diariamente la solución de tampón de bloqueo del 2%. Proceda una vez poco o ningún secundario no específico está presente.
12. Almacene el corazón inmunomanchado en PBS a 4 oC.
13. Directamente antes de la microscopía de montaje completo, incubar el corazón en la solución RIMS durante la noche a 37 oC. Extienda la incubación 24 horas adicionales si el tejido aún no está completamente despejado.
14. Almacene el corazón completamente despejado e inmunoconservado en RIMS en RT.

4. Visualización de poblaciones no miocitos en 3D con imágenes de microscopía confocal de un solo fotón del corazón de ratón despejado

NOTA: Si los corazones del ratón se cosechan embrionariasmente, continúe con la sección 4.1. Para los corazones de ratón cosechados postnatalmente, continúe con la sección 4.2.

1. Imagen del corazón de ratón embrionario despejado
   1. Llene la diapositiva de depresión del microscopio con la solución PBS.
   2. Recoja cuidadosamente el corazón despejado con fórceps curvos y coloque el tejido en la diapositiva.
   3. Monte el portaobjetos con una cubierta de vidrio. El tejido ahora se puede crear una imagen bajo un microscopio confocal.
2. Imagen del corazón de ratón postnatal despejado
   1. Llene la mitad de la cámara de la diapositiva de depresión con solución de PBS. Con el fin de crear una cámara lo suficientemente grande como para adaptarse a un corazón de ratón adulto, una diapositiva de depresión de polipropileno impresa en 3D fue hecha a medida(Figura 4).
   2. Recoja cuidadosamente el corazón despejado con fórceps curvos y coloque el tejido en la cámara. Llene el volumen restante de la cámara con PBS.
   3. Llene la cámara con PBS para que la superficie del líquido forme una cúpula por encima de la parte superior de la cámara. Monte el portaobjetos de la cubierta. El tejido ahora se puede crear una imagen bajo un microscopio confocal vertical.

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Resultados

A menudo, los dos pasos más desafiantes son guiar el corazón fuera de la cavidad torácica y ligar el LAD. Para solucionar estos pasos, se pueden realizar ajustes en la colocación de la punción inicial entre los cuartos músculos intercostales; si la punción y la disección contundente están demasiado cerca del esternón, es posible que el corazón no pueda salir de la cavidad torácica(Figura 1A).

Además, puede ser necesario aumentar la pr...

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Discusión

Las interacciones células celulares entre los cardiomiocitos y las poblaciones no miocitos son un factor determinante de si el corazón sufrirá fibrosis o reparación después de una lesión. Se han realizado descubrimientos demostrando que una variedad de tipos de células, incluyendo nervios^14,células epicardiales²⁴, macrófagos peritoneales²⁵, arteriolas^12,,13,y células endoteliales li...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator