JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول بسرعة وسهوله قياس العامل النووي كابا-ضوء سلسله-محسن من الخلايا المنشطة ب (NF-κB) التنشيط في خطوط الخلايا التعبير عن NF-κB:: يبني مراسل luciferase ، عن طريق قياسات التلالؤ في الخلية lysate. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تحديد التعبير الجيني عن طريق RT-qPCR معزولة عن الخلايا المصابة السالمونيلا التيفوئيد.

Abstract

وينظم عامل النسخ ديميريك NF-κB العديد من مسارات الاستجابة الخلوية ، بما في ذلك المسارات التهابيه عن طريق الحث علي التعبير عن مختلف السايتوكينات والكيمياء الكيميائية. وأعرب عن الدستورية NF-κb ويتم عزله في عصارة من البروتين المثبطة عامل النووية من كابا الخفيفة ببتيد الجينات محسن في المانع الخلايا ب ، الفا (iκbα). تفعيل NF-κB يتطلب تدهور IκBα ، والذي يكشف بعد ذلك اشاره التعريب النووي علي NF-κB ويعزز الاتجار بها إلى النواة. مره واحده في النواة ، NF-κB يربط إلى المنطقة بروموتور من NF-κB الجينات المستهدفة مثل انترلوكين 6 (آيل-6) و IL-23 ، لتعزيز التعبير عنها.

يحدث تنشيط NF-κB بشكل مستقل عن النسخ أو الترجمة. لذلك ، يجب ان يتم قياس حاله التنشيط NF-κB اما عن طريق التحديد الكمي NF-κB بشكل خاص في النواة ، أو عن طريق قياس التعبير عن الجينات الهدف NF-κB. في هذا البروتوكول ، والخلايا بشكل ثابت مع NF-κB:: تم التهاوي بناء مراسل luciferase ل NF-κB التنشيط باستخدام في المختبر تقنيات ثقافة الانسجه. يتم أصابه هذه الخلايا مع السالمونيلا التيفوئيد لتنشيط NF-κb ، الذي يتاجر إلى النواة ويربط إلى المواقع κb في منطقه المروج من luciferase ، مما يحفز التعبير عنها. يتم فحص الخلايا وتحليلها مع نظام مقايسة لوسيفيراز. يرتبط مقدار لوسيفيراز التي تنتجها الخلايا مع كثافة اشاره التلالؤ ، والتي يتم الكشف عنها من قبل قارئ لوحه. توفر اشاره التلالؤ الناتجة عن هذا الاجراء طريقه سريعة وحساسة للغاية لتقييم التنشيط NF-κB ضمن مجموعه من الشروط. يستخدم هذا البروتوكول أيضا النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) للكشف عن مستويات mRNA النسبية التي تدل علي التعبير الجيني.

Introduction

العامل النووي-κB (نف-κB) الاسره من البروتينات هي المنشطات النسخ الهامه التي تنظم التعبير الجيني في مختلف المسارات البيولوجية. تنشيط NF-κb يدفع النسخ من الجينات المستهدفة ، والعديد منها مهمة للاستجابات المناعية والتهابيه ، وانتشار الخلايا ، والاستجابات الإجهاد والسرطان التقدم1،2. NF-κB يلعب دورا أساسيا في التوسط في النتائج التهابيه المبكرة لأزاله الممرض. النظر إلى العمليات البيولوجية العديدة التي توسط فيها NF-κB التنشيط ، يمكن ان يكون للاضطرابات في الإشارات لها عواقب وخيمه علي الصحة والمرض. فقدان الطفرات وظيفة في NF-κB الإشارات المرتبطة في العديد من الظواهر الظاهرية نقص المناعة ، في حين يرتبط كسب الطفرات وظيفة مع عده أنواع من السرطانات ، بما في ذلك الأورام اللمفاوية الخلية B وسرطان الثدي3. بالاضافه إلى ذلك, وقد ثبت العديد من مسببات الامراض لتعدل مباشره حاله التنشيط NF-κb من خلال التعبير عن عوامل الضراوة4,5,6,7.

ومن المعروف ان تنشيط NF-κB لتكون نتيجة للعديد من المحفزات المتغيرة بما في ذلك المنتجات البكتيرية مثل الليبووليساشاريدس (LPS) ، والصواري والتي تعرف باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs). يتم الكشف عن هذه PAMPs بواسطة مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل مستقبلات الأرقام مثل (TLRs) ومستقبلات شبيهه بالإيماءات (NLRs) مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB والتعبير اللاحق لمجموعه من الجينات التهابيه NF-κB المعتمدة8. بالاضافه إلى التنشيط PRR من قبل PAMPs ، المنتجات البكتيرية الأخرى ، مثل البروتينات البكتيرية المستجيب ، يمكن ان تحفز تنشيط NF-κB. ومن المثير للاهتمام ، والبكتيريا أيضا التعبير عن البروتينات المستجيب الذي يخفف بنشاط NF-κB المسار وتعزيز الامراضيهم ، مما يؤكد علي اهميه NF-κB كوسيط أساسي للحصانة9.

هناك خمس وحدات فرعيه مختلفه التي تشكل الدمامل NF-κB ؛ p50 ، p52 ، ريلا (p65) ، RelB و cRel. الرئيسيتين NF-κB المتغايرة هي p50: ريلا و p52: الدمامل RelB. المنشطات NF-κB تنشيط ربط إلى مواقع الحمض النووي ، والمعروفة باسم المواقع κB ، في المروج ومحسن المناطق من الجينات المستهدفة المختلفة. في ظل ظروف التماثل الطبيعي ، يتفاعل NF-κB مع عائله من البروتينات المثبطة المعروفة باسم بروتينات IκB لتبقي غير نشطه. عند التحفيز ، فان IκB هو الفوسفارلاتيد من قبل كيناز IκB (IKK) ، والذي يسمح لها ان تكون مستهدفه للابده ، وبعد ذلك تدهور. التحلل من IκB ينشط NF-κB عن طريق الكشف عن اشاره التعريب النووي. NF-κB ثم ينتقل إلى النواة ، حيث انه يربط مواقع κB في منطقه المروج من الجينات المستهدفة وتعزيز النسخ10. التالي ، تفعيل nf-κb اوبريجولاتيس mrna التعبير عن الجينات الهدف nf-κb ، ويمكن قياس هذا التغيير من خلال اختبارات التحديد الكمي RNA مثل RT-qpcr11.

توجد عده طرق وتستخدم عاده لقياس التنشيط NF-κB ، بما في ذلك اختبارات تحول التنقل الكهربي (EMSA) ، والنقل النووي ، واختبارات مراسل الجينات. يستخدم EMSA للكشف عن مجمعات البروتين مع الأحماض النووية. يتم تجزئه الخلايا المحفزة لعزل البروتينات النووية ، بما في ذلك NF-κB ، الذي يتم احتضانه بعد ذلك مع نوكليوتيد الشعاعية التي تحتوي علي مجال ربط NF-κB. يتم تشغيل العينات علي هلام والتي تصوير عن طريق أوتوغرافي من 32P-المسمي الحمض النووي. إذا NF-κB موجود في جزء البروتين ، فانه سيتم ربط النيوبوتيدس ، والتي سوف تهاجر إبطا من خلال هلام والحاضر والعصابات المنفصلة. الكسور النووية من الخلايا التي تفتقر إلى تنشيط NF-κB (علي سبيل المثال ، خلايا التحكم غير المحفزة) سوف تنتج اي عصابات كما نوكليوديس تهاجر بشكل أسرع إلى نهاية الهلام. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو انه من الناحية الكمية إلى حد كبير في الحس الثنائي (اي ، أو إيقاف تشغيله) ولا يلتقط بشكل كاف اختلافات ذات مغزى في القدرة الملزمة NF-κB. بالاضافه إلى ذلك ، لا يعتبر هذا الأسلوب بنيات الكروماتين الهامه وظيفيا NF-κb الهدف الجينات12,13.

وعلي غرار الطريقة السابقة ، هناك اختبار "عدم التحول" الذي يتم فيه تغليف لوحات البئر المتعددة بالنواة التي تحتوي علي تسلسل الربط NF-κB. بعد العلاج من الخلايا مع الكسور النووية من البروتين ، وسوف NF-κB ربط إلى النيوبوتيدس منضما إلى البئر. وبعد ذلك تضاف الأجسام المضادة-NF-κB ، والتي ستتفاعل مع المنضم NF-κB وتنتج اشاره قياس ألوان تتناسب مع كميه NF-κB ، مما يشير إلى درجه التنشيط NF-κB. هذا الأسلوب هو مفيد علي EMSA في انه لا يتطلب الأحماض النووية الشعاعية والكمية ، في المقارنة. مهما, تحذير من هذا أسلوب ان هو ثانيه لا يميز بين [كروماتين] دول من [نف-Κب] هدف مورثات14.

طريقه أخرى التي NF-κb التنشيط قد يتم الكشف عنها بواسطة الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن (رقاقه) ، حيث الحمض النووي والبروتينات المتفاعلة هي عبر مرتبطة مع الفورمالديهايد والإيمونوبريسيبيتاتيد مع الأجسام المضادة لمكافحه nf-κb محدده. ثم يتم تنقيه شظايا النيوكليوتيد المحددة وتحديدها من خلال تضخيم PCR أو التسلسل الإنتاجي العالي المباشر. وتوفر النتائج المتولدة من هذه الطريقة نتائج شبه كميه للنشاط الملزم NF-κB مع الجينات المستهدفة. ومع ذلك ، فان النتائج تعتمد بشكل كبير علي شروط التثبيت وعمليات التنقية في كل خطوه15.

في اختبارات نقل المواقع النووية ، يتم تحفيز الخلايا للحث علي تنشيط NF-κB ومن ثم إصلاحها. يتم أضافه الأجسام المضادة لp65 إلى الخلايا الثابتة. وبدلا من ذلك ، يمكن وضع علامة علي الوحدة الفرعية p65 نفسها باستخدام ببتيد فلوري مثل الأخضر الفلوري الأخضر (GFP). في كلتا الحالتين ، سيسمح المناعي التصوير من توطين p65 لتحديد توزيع الخلوية. من خلال قياس نسبه البروتين الموضعي الخلوي والنووي ، يمكن للمحققين تحديد حاله التنشيط النسبية NF-κB. والعيب في هذا الأسلوب هو ان المناعي هو مضيعه للوقت نسبيا ، ويتطلب الأجسام المضادة مكلفه ، ويحتاج إلى خبره تقنيه أكبر نسبيا16.

ويشيع استخدام الجينات مراسل أدوات لدراسة الأنماط التنظيمية والتعبير من جين الفائدة. عاده ، يتم بناء الجينات مراسل من تسلسل المروج لجين الفائدة تنصهر إلى الترميز الجينات لبروتين قابل للكشف بسهوله. يتم اختيار البروتينات مع الانشطه الانزيميه ، فلوري ، أو خصائص التلالؤ عاده لقدرتها علي ان تكون التهاوي والكمية. وهكذا ، فان القراءة (علي سبيل المثال ، التلالؤ ، الفلورية) بمثابه اشاره للكشف عن التعبير الجيني. ويمكن بعد ذلك إدخال هذه الثوابت الصحفية في أنواع مختلفه من الخلايا ، مثل الخلايا الظهاريه أو الضامة.

الموصوفة في البروتوكول هو استخدام خط الخلية هيلا المستنسخة (هيلا 57a) التي يتم نقلها بشكل ثابت مع مراسل لوسيفيراز تحتوي علي ثلاث نسخ من توافق الآراء κb من κ الغلوبولين المناعي المنطقة17المروج. التعبير عن لوسيفيراز يعتمد علي تنشيط NF-κb ، الذي يحدث بعد تحفيز الخلايا. الخلايا المحفزة بسهوله باستخدام الخلية تحلل العازلة المقدمة في مجموعه الفحص لوسيفيراز. ثم يتم خلط جزء من محلله الخلية مع العازلة الفحص لوسيفيراز الذي يحتوي علي لوسيفيراز. Luciferin هو الركيزة من luciferin ومطلوب لتوليد الضوء في وجود luciferin. بعد الجمع بين العازلة الفحص مع lysate ، فان الحل تنبعث الضوء في عمليه تعرف باسم التلالؤ. كميه الضوء المنتجة ، نظرا في شمعه ، يتناسب مع كميه لوسيفيراز الموجودة في محلله وبمثابه مقياس للتنشيط NF-κb. وتفسر قراءات التجويف بالمقارنة مع معيار غير محفز لحساب النشاط NF-κB خط الأساس والاشاره نفسها مستقره لعده دقائق للسماح لقياس موثوق بها. الاضافه إلى ذلك ، يتم نقل خط الخلية هيلا 57A بشكل ثابت مع مراسل غالاكتوزيداز المستقلة NF-κB. المراسلة [β-غالاكتوزيداز عبر عن دستوريا, و [β-غالاكتوزيداز] نشاط يستطيع كنت قست إلى تحكم لخليه بقاء أو تغير في خليه أرقام17. ويمكن بعد ذلك تعديل قيم لوسيفيراز إلى قيم β-غالاكتوزيداز والإبلاغ عنها كزيادة اضعاف علي خلايا التحكم غير المحفزة.

منذ NF-κB هو عامل النسخ المسؤولة عن زيادة التعبير عن الجينات الهدف NF-κB المعتمدة ، ومتابعه التجربة للسيطرة علي NF-κB-تعتمد زيادة التعبير الجينات هو النسخ العكسي العددية تفاعل البلمره سلسله ( RT-qPCR). ان RT-qPCR هي طريقه حساسة للغاية يمكن من خلالها قياس التغيرات في التعبير الجيني علي عده أوامر بالحجم. يتم حصاد الخلايا المحفزة والمسيطرة للجيش النيبالي الريبي عبر استخراج كلوروفورم الفينول. بعد فصل مرحله, استخرجت [رنا] كالعنصر رئيسيه من الطبقة مائية. ثم عجلت RNA وغسلها لإنتاج بيليه نقيه. ثم يتم أعاده تشكيل هذا بيليه وتنظيفها من الحمض النووي الملوث عن طريق العلاج DNase. ثم يتم عكس الحمض النووي الريبي النقي لإنشاء DNA التكميلي (cDNA). ويمكن بعد ذلك تحليل هذه التقنية من خلال تقنيات PCR الكمية ، حيث يتم قياس وفره تسلسل mRNA محدده لتحديد التعبير الجيني. لا توضح هذه التقنية التحكم الانتقالي ، أو التعديل بعد الانتقالية ، أو وفره البروتين ، أو نشاط البروتين. ومع ذلك ، يتم تنظيم العديد من الجينات ، ولا سيما تلك التي تشارك في العمليات الموالية للالتهابات ، عن طريق NF-κB ووفرتها mRNA يدل علي التعبير عنها.

الطريقة المقترحة هنا يستخدم طريقه سريعة وبسيطه التي NF-κB التنشيط يمكن الكشف عنها عن طريق اختبارات التلالؤ من lysate الخلوية. ويمكن استخدام RT-qPCR من NF-κB الهدف التعبير الجيني لقياس التعبير عن جينات معينه ، فضلا عن التحقق من صحة النشاط الوظيفي NF-κB التنشيط. المزايا الرئيسية لمثل هذا النظام هي بساطته والسرعة ، والذي يسمح لفحص الانتاجيه العالية من مجموعه من الشروط التي تعدل NF-κB التنشيط. هذا البروتوكول هو مناسبه لخطوط الخلايا الأخرى التعبير عن NF-κB:: المراسل luciferase ، وقد ثبت في الخلايا 264.7 الخام المتحولة بشكل ثابت18. مقدار الوقت اللازم للتعامل مع العينات ، بدءا من تحلل الخلية لتوليد اشاره التلالؤ ، هو الحد الأدنى وياخذ فتره حوالي ساعة. قياس NF-κB يتطلب فقط المعدات المختبرية الاساسيه مثل لوحات مبهمه ، قارئ لوحه قادره علي قياس التلالؤ ، والبرمجيات تحليل البيانات البسيطة مثل برنامج جدول بيانات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خليه العبور والبذر

  1. الحفاظ علي الخلايا هيلا 57A في 75 سم2 قارورة تحتوي علي 10 مل من وسائل الاعلام النسر المعدلة دولبيكو (dmem) تستكمل مع 5 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط المصل (الدم) في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 حاضنه.
  2. يستنشق الخلية ثقافة الاعلام ويغسل مع 1 مل من 0.05 ٪ من الحل تريبسين-أدتا. يستنشق التربسين ويستبدل مع 1 مل اضافيه. وضع القارورة في 37 درجه مئوية حاضنه لمده 4-5 دقيقه للسماح للخلايا لفصل من قارورة.
  3. أضافه 9 مل من وسائل الاعلام الثقافة الخلية ويغسل بلطف الجزء السفلي من قارورة بضع مرات لأزاحه الخلايا وتشكيل تعليق متجانسة.
  4. تمييع هيلا 57A الخلايا 1:6 أو 1:8 في وسائل الاعلام الطازجة والبذور في قوارير جديده. مرور الخلايا عندما تكون 90 ٪ متموج أو كل ثلاثه أيام والحفاظ علي الخلايا في الحد الأدنى من 25 ٪ كونفلوينسي.
  5. قبل يوم واحد من تحفيز الخلايا ، ترسينزي هيلا 57A الخلايا وتعليق في 10 مل من وسائل الاعلام النمو. عد الخلايا في تعليق باستخدام مقياس اللزوجة واستخدام وسائل الاعلام النمو لتمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من 2.5 x 105 خلايا/مل في أنبوب مخروطي 50 ml.
  6. نقل 250 μL من تعليق الخلية (~ 6.25 × 104 خلايا) لكل بئر من لوحه 48-حسنا. بشكل دوري غطاء وتسليم الأنبوب المخروطي لضمان تعليق الخلية متجانسة. اضغط علي اللوحة برفق علي الجانب للتاكد من ان الخلايا توزع بشكل موحد في الآبار.
  7. انقل الصفيحة إلى 37 درجه مئوية في حاضنه 5% CO2 واترك الخلايا تلتصق وتنمو بين عشيه وضحيها.

2. اعداد البكتيريا

  1. قبل يومين من العدوى ، والمخزونات المجمدة من السالمونيلا علي لوحات أجار LB لإنتاج مستعمرات واحده. نقل لوحات إلى حاضنه تعيين إلى 37 درجه مئوية والسماح للنمو بين عشيه وضحيها.
  2. قبل يوم واحد من الاصابه ، أضف 3 مل من مرق اللايجين (LB) إلى أنابيب الثقافة البكتيرية المعقمة ، مضيفا المضادات الحيوية المناسبة لوسائل الاعلام.
  3. باستخدام حلقه التلقيح العقيمة ، واختيار مستعمره واحده من الثقافات البكتيرية التي يشوبها وتلمس حلقه إلى وسائل الاعلام LB. كاب الأنابيب بعد تطعيم وتجاهل حلقه.
  4. وضع الأنابيب في حاضنه الاهتزاز تعيين في 37 درجه مئوية ، 180 دوره في الدقيقة ، والسماح لتنمو بين عشيه وضحيها.
  5. في يوم العدوى ، واسترداد الثقافات البكتيرية بين عشيه وضحيها من الحاضنة.
  6. اعداد أنابيب للثقافة الفرعية عن طريق أضافه 3 مل من LB الطازجة ، التي تحتوي علي المضادات الحيوية عند الاقتضاء.
  7. نقل 30 μL من الثقافة البكتيرية بين عشيه وضحيها (1 في 100 التخفيف) إلى وسائل الاعلام المعدة حديثا. وضع الأنابيب في حاضنه الاهتزاز تعيين في 37 درجه مئوية لمده 3 ساعات.
  8. بعد الحضانة 3 ح ، نقل 1 مل من مرق LB العقيمة في كوفيت البلاستيك لتكون بمثابه فارغه. نقل 900 μL LB في cuvettes أخرى لاستخدامها في تحليل العينة.
  9. نقل 100 μl من الثقافة الفرعية البكتيرية إلى كوفيت التي تحتوي علي 900 μl من LB وماصه صعودا وهبوطا عده مرات لخلط. كرر هذا لكل تعليق البكتيرية.
  10. بدوره علي مقياس الطيف لقياس الكثافة البصرية (OD) من الثقافات البكتيرية في الطول الموجي من 600 نانومتر (OD600).
  11. ضع الفراغ في المقياس الطيفي. الاحاطه علما بالتوجه ، كما ينبغي ان يكون هناك علامة نحو الأعلى مشيرا إلى مثل هذه.
  12. اغلق الغطاء واضغط علي الزر الفارغ علي مقياس الطيف للحصول علي امتصاص الخلفية.
  13. استبدال كوفيت فارغه مع كوفيت عينه في نفس الاتجاه والصحافة قراءه.
  14. تسجيل القيم OD600 هذه العينات. ضاعف القيمة بمقدار 10 لحساب عامل التخفيف.
  15. تمييع الثقافة الفرعية البكتيرية مع LB الطازجة لتحقيق قيمه الامتصاص من حوالي 1.0 ، والذي يتوافق تقريبا مع 1 × 109 Cfu/مل. تمييع هذا التعليق 1:10 في كوفيت وقياس الامتصاص-التي ينبغي ان تعطي قيمه ~ 0.1.
  16. في أنبوب جديد ، أضافه حجم المناسبة من الثقافة الفرعية المخففة إلى LB الطازجة لتحقيق تعليق من 1 × 108 كفو/مل لاستخدامها باعتبارها inكوه.
  17. اعداد التخفيفات التسلسلية من لقاح عن طريق نقل 50 μl من تعليق البكتيرية إلى أنبوب يحتوي علي 450 μl من العقيمة تلفزيوني (10 اضعاف ضعف) حتى يتم التخفيف النهائي من حوالي 102 كفو/مل.
  18. نقل 100 μl من اثنين من ادني تخفيفات (102 و 103 المقابلة مع 10 و 100 مستعمره تشكيل وحدات ، علي التوالي) إلى لوحه أجار رطل ونشر تعليق مع موزع الخلية للحصول علي مستعمرات واحده. نقل هذه اللوحات إلى حاضنه 37 درجه مئوية واحتضان بين عشيه وضحيها.
  19. في اليوم التالي عد المستعمرات وحساب التركيز البكتيري للعين الاوليه لتحديد التركيز الفعلي للعين.

3. عدوي الخلايا

ملاحظه: عند هذه النقطة ، يجب ان تكون الخلايا في حوالي 90% كونفلوينسي. لخلايا هيلا 57A في لوحه 48 البئر ، وهذا هو ما يقرب من 1 × 105 خلايا لكل بئر. سيتم أصابه الخلايا مع تعدد العدوى (وزاره الداخلية) من 10 ، أو 106 كفو/حسنا.

  1. تسميه غطاء اللوحة وفقا لظروف العدوى التي سيتم استخدامها لكل بئر ، مع كل شرط يتم القيام به في ثلاث نسخ.
  2. أضف 10 ميكرولتر من العجان إلى الآبار المناسبة. أضافه 10 μL من LB العقيمة لآبار التحكم غير المصابة.
  3. لمزامنة وقت العدوى ، ضع اللوحة في جهاز الطرد المركزي المنضديه وتدور في 500 x g لمده 5 دقائق ، وضمان ان اللوحة هي مضاده متوازنة.
  4. نقل الخلايا المصابة إلى 5% CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
  5. وضع قسامه من وسائل الاعلام الثقافة الخلية في 37 °c حمام المياه للاستخدام في الخطوة التالية.
  6. بعد ساعة واحده من وقت الاصابه ، وأزاله وسائل الاعلام الخلية ثقافة من حمام المياه ومسح الخارج مع 70 ٪ الايثانول. نقل لوحه ثقافة الانسجه إلى مجلس السلامة البيولوجية.
  7. باستخدام تقنيه معقمه ، يستنشق وسائل الاعلام من الآبار واستبدال مع 250 μL من وسائل الاعلام الطازجة والدافئة ثقافة الخلية.
  8. عوده لوحات إلى 5 ٪ CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية لمده 4 ساعات اضافيه.
  9. أزاله لوحات من CO2 حاضنه ويستنشق وسائل الاعلام من الآبار. لتحليل لوسيفيراز تواصل الخطوة 4.1. لعزله RNA المضي قدما إلى الخطوة 5.1.

4. تحليل luciferase

  1. أضافه 100 μL من 1x خليه تحلل العازلة إلى الآبار. قد تحتاج العازلة أولا ان تضعف إلى تركيز العمل ، اعتمادا علي كاشف.
  2. نقل لوحه إلى 80 درجه مئوية الفريزر واحتضان لمده 30 دقيقه علي الأقل لضمان كفاءه تحلل الخلية.
  3. وضع لوحه تحتوي علي الخلية المجمدة محلله علي مقاعد البدلاء لأذابه الجليد واعداد الكواشف الركيزة لوسيفيراز وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  4. السماح للكواشف الركيزة لوسيفيراز تتوازن إلى درجه حرارة الغرفة.
  5. قم بتشغيل قارئ اللوحة وافتح برنامج القارئ المطابق. تعيين الجهاز لقياس التلالؤ.
  6. نقل 10 μL من كل عينه إلى بئر من لوحه 96 معتمة جيدا.
  7. أضافه 50 μL من كاشف الفحص Luciferase باستخدام ماصه متعددة القناات لكل بئر من لوحه مبهمه.
  8. انقر برفق علي اللوحة علي الجانب لخلط الآبار وتاكد من ان السطح السفلي مغطي بالسائل. وضع لوحه في قارئ لوحه وبدء القراءة.
  9. انسخ قيم التلالؤ إلى برنامج جدول بيانات وارسم النتائج.

5. الحمض الريبي المعزول

  1. أضافه 500 μL من guanidium ثيوسيانات إلى كل بئر وماصه صعودا وهبوطا عده مرات لضمان تحلل كامله.
  2. نقل المحتويات إلى أنبوب الطرد المركزي المسمي. الحفاظ علي عينات علي الجليد قدر الإمكان للحفاظ علي جوده RNA.
  3. تعيين جهاز الطرد المركزي المنضديه إلى 4 درجه مئوية والحفاظ علي أجهزه الطرد المركزي في هذه الحرارة لبقية البروتوكول.
  4. لكل أنبوب عينه ، أضافه 100 μL من كلوروفورم ، وغطاء باحكام ، ويهز ل 15 ثانيه. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
  5. الطرد المركزي في 12,000 x ز ل 15 دقيقه في 4 ° c. خلال هذا الوقت ، والاستعداد للخطوة التالية من تنقيه الجيش النيبالي الريبي عن طريق وضع العلامات أنابيب جديده.
  6. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد يحتوي علي 250 μL من الايزوبروبانول ، ويجري الحرص علي عدم إزعاج الطبقات الوسطي أو السفلي.
  7. تخزين المنتج غير المستخدمة في 80 درجه مئوية الفريزر ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم لتحليل البروتين. قد تكون الطبقة المائية المتبقية أيضا بمثابه نسخه احتياطيه إذا كانت هناك حاجه إلى الحمض الريبي النيبالي في وقت لاحق.
  8. دوامه خليط من طبقه مائية و الايزوبروبانول والسماح للعينات الجلوس في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
  9. الطرد المركزي العينات في 12,000 x ز ل 10 دقيقه في 4 ° c.
  10. أزاله الأنابيب من أجهزه الطرد المركزي. الحمض الريبي النيبالي يعجل يشكل بيليه بيضاء علي الجانب والجزء السفلي من الأنبوب. فتح الأنابيب وأزاله بعناية ماده طافي من خلال تتدفق إلى حاويه نفايات.
  11. غسل بيليه الحمض الريبي النيبالي عن طريق أضافه 500 μL من الايثانول 75 ٪ ودوامه.
  12. الطرد المركزي في 8,000 x ز ل 5 دقيقه في 4 ° c.
  13. أزاله ماده طافي عن طريق سكب ومره أخرى غسل بيليه مع 75 ٪ الايثانول.
  14. الطرد المركزي في 8,000 x ز ل 5 دقيقه في 4 ° c.
  15. باستخدام ماصه حجم صغير (علي سبيل المثال ، 10-200 حجم μl) ، يستنشق أكبر قدر ممكن من ماده طافي ، والحرص علي عدم دفع اي السائل مره أخرى في الأنبوب أو أزاحه بيليه مع طرف ماصه. إذا أصبح بيليه طردت ، الطارد المركزي لفتره وجيزة ومره أخرى في محاولة لأزاله supernatant.
    1. الهواء الجاف الكريات RNA. إذا كانت الكريات مرئية لأي عينه ، بشكل دوري (كل 5 دقائق) تحقق منها لمعرفه ما إذا كانت تتغير من الأبيض إلى واضح ، مشيرا إلى انها جافه. مره واحده تبدا الكريات تتحول واضحة ، أضافه 20 μL من ultrapure ، RNase المياه الحرة لحل الحمض الريبي النيبالي.
    2. إذا لم تكن الكريات مرئية في البداية لأي عينات ، ببساطه أضافه الماء نقاء 5 دقيقه بعد أزاله supernatant.
  16. لزيادة الذوبان ، وتمرير الحل عده مرات من خلال غيض ماصه واحتضان لمده 10 دقيقه في 55-60 درجه مئوية.

6. علاج DNase من RNA

  1. للحفاظ علي سلامه الجيش النيبالي الريبي ، تخزين عينات RNA علي الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك. في هذا الوقت ، يمكن أزاله المخزن المؤقت DNase 10x من الفريزر ويسمح لذوبان علي الجليد.
  2. اعداد مقياس الطيف لتحليل العينة عن طريق تنظيف جميع أسطح تحليل العينات بقطعه قماش خاليه من الوبر.
  3. اتخاذ قياس الخلفية قبل التحليل. للقيام بذلك ، قم بتحميل جهاز الاستشعار مع 1.5 μl من نفس المياه نقاء المستخدمة لأذابه الكريات RNA. اضغط الزر " قراءه فارغه " لإنشاء قراءه خلفيه.
  4. استخدم قطعه قماش خاليه من الوبر لمسح سطح تحميل عينه الاداه. كرر هذه الخطوة بعد كل نموذج القراءة.
  5. تحميل 1.5 μL من أعاده تعليق RNA إلى حامل العينة وحدد قراءه عينه. كرر حتى يتم قراءه كافة العينات.
  6. اعداد المزيج الرئيسي DNase من خلال الجمع بين 2.4 μL من 10x العازلة DNase و 1 μL من DNase ، في العينة ، في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL. اعداد المزيج الرئيسي لحجمين إضافيين.
  7. خلط المزيج الرئيسي عن طريق تحريك الأنبوب عده مرات. لفتره وجيزة الطرد المركزي أنبوب لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب. أضافه 3.4 μL من ماسترميكس إلى 20 μL من عينه RNA. مزيج محتويات عن طريق الخداع والطرد المركزي لفتره وجيزة ، كما كان من قبل.
  8. نقل العينات إلى كتله الحرارة تعيين في 37 درجه مئوية لمده 20 دقيقه. أزاله كاشف التنشيط DNase من الفريزر وذوبان الجليد في درجه حرارة الغرفة.
  9. 20 دقيقه بعد وضع عينات علي كتله الحرارة ، ونقل العينات إلى رف أنبوب وضعت علي مقاعد البدلاء العمل.
  10. الدوامة بلطف محتويات الكاشف التعطيل DNase. نقل 2.6 μL من الكاشف التنشيط DNase إلى الأنابيب التي تحتوي علي الجيش النيبالي الريبي ومن ثم نفض الغبار الأنابيب لإنشاء خليط متجانس.
  11. الطرد المركزي العينات في 12,000 x ز ل 1 دقيقه.
  12. ماصه بعناية ماده طافي إلى أنبوب جديد ، المسمي.

7. عكس النسخ من mRNA إلى cDNA

  1. اعداد مزيج رئيسي اعتمادا علي كميه من العينات زائد اثنين اضافيه لحساب للخسارة من خلال التنضيد (الجدول 1). استخدام 1 ميكروغرام من RNA وأضافه H2O إلى حجم 50 μl المجموع.
كاشفالحجم (μL)التركيز النهائي
MgCl2 (25mm)3.51.75 مم
المخزن المؤقت للنسخ العكسي (10x)51x
dNTP مزيج (10 μM ، لكل منهما)2.5500 نيوتن متر
hexamer عشوائي (100 μM)1.252.5 μM
ناسخ عكسي متعدد الناسخ (50 U/μL)11 U/μL
مثبطات RNase (20 U/μL)1.251.25 U/μL
RNA (1 ميكروغرام)20 نانوغرام/uL
H2Oاعلي إلى 50

الجدول 1: مكونات ووصفه لمزيج رئيسي النسخ العكسي.

  1. كاب العينات باحكام وتسميه أنابيب PCR علي الجانب كما تسميات علي الغطاء يمكن ازالتها من غطاء ساخن لثيرموسيكلير في وقت لاحق. مزيج من قبل vortexing.
  2. لفتره وجيزة الطرد المركزي أنابيب PCR لجمع العينات إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. وضع أنابيب PCR في ثيرموسيكلير وتشغيل العينات تحت الإعدادات التالية:
    25 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، 48 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ثم عقد عند 10 درجه مئوية.
  4. نقل الأنابيب التي تحتوي علي cDNA توليفها حديثا إلى-20 درجه مئوية الفريزر أو استخدامها علي الفور في تحليل qPCR.

8. اعداد وتحميل لوحه لتحليل RT-qPCR

  1. قبل البدء ، خطط لاعداد لوحه qPCR 384 لتحليل العينة.
  2. الإشعال الذوبان و cDNA علي الجليد.
  3. اعداد مزيج رئيسي (انظر الجدول 2) ، بالاضافه إلى ما يقرب من 10 ٪ اضافيه لحساب الخسارة من خلال التنضيد.
كاشفالحجم (μL)
10 μM F التمهيدي1
10 μM R التمهيدي1
Ultrapure H2O4
2x الأخضر SYBR10

الجدول 2: مكونات ووصفه لمزيج الماجستير qPCR.

  1. دوامه المزيج الرئيسي والاستغناء عن 8 μL في الآبار من لوحه 384 البئر باستخدام ماصه مكرر. سيتم تحليل عينات في نسخه مكرره لكل التمهيدي ومجموعه عينه cDNA.
  2. باستخدام الماصة P10 (أو أصغر) ، انقل 2 μL من cDNA لتكرار الآبار لكل مجموعه تمهيديه ليتم تحليلها. استبدل النصائح بعد كل بئر لتجنب التلوث المتقاطع.
  3. ختم اللوحة عن طريق تطبيق بعناية الفيلم لاصقه علي السطح ، وضمان ان يتم تغطيه جميع الآبار. اضغط علي الفيلم باستخدام مجداف الختم أو بكره لختم بحزم.
  4. وضع لوحه في جهاز الطرد المركزي ، مع لوحه فارغه كموازنة. الطرد المركزي لوحه في 500 x ز لمده 5 دقائق.

9. تشغيل الثيرموسيكلير لتحليل qPCR

  1. السلطة علي جهاز الكمبيوتر والوقت الحقيقي PCR الصك.
  2. افتح برنامج RT-qPCR وحدد تجربه جديده.
  3. ضمن علامة التبويب "اعداد " ، حدد خصائص التجربة، حيث يمكن تعيين معلمات التشغيل.
  4. قم بتعريف اسم التجربة، الذي سيقوم بتعيين اسم الملف والإعدادات المستخدمة لتخزين النتائج.
  5. لاختيار الصك، حدد الاداه المتصلة حاليا التي سيتم تشغيل التحليل. حدد المقارنة CT (δδct) تشغيل الأسلوب .
  6. حدد Sybr الكواشف الخضراء كصبغه الحمض النووي الفلورسنت لاستخدامها ومعيار كسرعة المنحدر.
  7. تاكد من تحديد المربع المجاور لتضمين المنحني الذائب .
  8. ضمن علامة التبويب تعريف ، عين الأهداف (اي الجينات التي سيتم تضخيمها) ، والعينات (اي الظروف التجريبية).
  9. حدد علامة التبويب تعيين . تسميه الآبار مع الأهداف المناسبة والعينات ، كما انها تتوافق مع مخطط التحميل من لوحه 384-حسنا.
  10. حدد تشغيل الأسلوب. استخدم المعلمات للتحليل المدرج في (الجدول 3).
عقد المرحلةPCR المرحلةتذوب المرحلة المنحني
الخطوة 1الخطوة 2الخطوة 1الخطوة 2الخطوة 1الخطوة 2الخطوة 3
Temp50 درجه مئوية95 درجه مئوية95 درجه مئوية60 درجه مئوية95 درجه مئوية60 درجه مئوية95 درجه مئوية
الوقت2:0010:000:151:000:151:000:15
جمع البياناتنعمنعم
عدد الدورات1x40x1x

الجدول 3: معلمات الدورة لثيرموسيكلير.

  1. وضع لوحه 384 البئر في ثيرموسيكلير وبدء التحليل.

10. تحليل النتائج مع الدلتا-دلتا الطريقة Ct (2-δδct)

  1. تحليل النتائج التي تم إنشاؤها من رد فعل qPCR للأخطاء التي قد تتداخل مع التحليل المصب. سيتم وضع علامة علي العديد من الأخطاء تلقائيا بواسطة النظام.
  2. للإشعال التي شيدت بشكل صحيح ، يجب ان تكون منحنيات تذوب واحده فقط الذروة. استبعاد اي الآبار التي تحتوي علي منحني تذوب مع أكثر من ذروه واحده من المزيد من التحليل.
  3. تصدير القيم المقطعية إلى برنامج جدول بيانات لتحليلها باستخدام أسلوب ΔΔCt. ويرد شكل مقترح (الجدول 4). العمود الأخير هو تغيير التعبير اضعاف العينة ، نسبه إلى عينات عنصر التحكم.
التدبير المنزلي الجينات (جابده)جين الاهتمام (IL6)
Ct1Ct2أفي CtCt1Ct2أفي Ctδctأفي ΔCt كتلسδδct2 ^-(ΔΔCt)Geomean
التحكم 115.3315.3715.3526.8126.9126.8611.5110.511.000.501.00
التحكم 216.8316.7716.8026.8926.9226.9110.1110.51-0.411.33
السيطرة 317.5617.5317.5427.3827.5627.479.9310.51-0.591.50
Sl1344 115.5015.4115.4522.1522.1322.146.6910.51-3.8314.2113.23
SL1344 216.0215.9816.0023.0122.9622.986.9810.51-3.5311.57
SL1344 317.2717.3017.2823.9923.9823.986.7010.51-3.8214.09
الوكالة الsopE2ه للتحقيقات 115.3815.4115.3923.3123.0923.207.8010.51-2.716.567.29
الوكالة الsopE2ه للتحقيقات 216.0116.0516.0323.8923.9223.917.8810.51-2.646.23
الوكالة الsopE2ه للتحقيقات 316.7816.7816.7824.0224.0624.047.2710.51-3.259.49
sopE2 سووب 115.5215.6015.5627.0427.0327.0311.4710.510.960.510.79
sopE2 سووب 215.5615.5915.5726.3726.4226.3910.8210.510.310.81
sopE2 سووب 315.9115.9215.9126.2426.1226.1810.2710.51-0.251.19

الجدول 4: الشكل الخاص بتحليل البيانات الخاصة ب qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويركز الفحص الموصوف هنا علي تنشيط عامل النسخ nf-κb باستخدام مراسل لوسيفيراز المعتمد من nf-κb والذي يتم تحويله بشكل ثابت إلى خط من خلايا هيلا. ينشط NF-κB ينتقل إلى النواة حيث انه يربط المواقع الملزمة κB من الجينات المستهدفة ، بما في ذلك السايتوكينات الموالية للالتهابات IL6 و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المساهمة الرئيسية للبروتوكول الموصوفة هي انه يوفر طريقه سريعة وسهله للكشف عن التنشيط NF-κB في الخلايا ، والذي يسمح لتحليل الانتاجيه العالية من الظروف تنشيطية متعددة أو الادويه التي تؤثر علي تنشيط NF-κB. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتنشيط NF-κB في الخلايا هيلا المصابة السالمونيلا. ويمكن استخد?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويدعم البحوث في مختبر كيسترا-غندر بمنح من NIAID من المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21AI122092 ومن جمعيه السكري الامريكيه تحت جائزه رقم 1-18-JDF-035.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive filmVWR International60941-070
ChloroformFisher BioreagentsC298-500
DMEMThermo Fisher11665092
DNAse treatment kitQiagen79254
dNTPsPromegaU1511
EthanolFisher BioreagentsBP2818100molecular grade
FBSSigma-AldrichF0926
HeLa 57A cellsRef # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814
IsopropanolFisher BioreagentsBP26181
KanamycinFisher BioreagentsBP906-5
LB agarFisher BioreagentsBP1425-500
Lysogeny brothFisher BioreagentsBP1426-500
MgCl2Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000Thermo Scientificspectrophotometer
Promega luciferase assay systemPromegaE1501Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random HexamersThermo ScientificSO142
Real-time GAPDH forward primer5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse TranscriptaseApplied Biosystems4308228
RNAse inhibitorThermo ScientificEO0381
RT bufferPromegaA3561
SL1344Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039Ref # 18
SYBR greenApplied Biosystems43091552x mastermix
Tri-reagentMolecular Research CenterTR 118guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTAThermo Fisher253000540.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure waterFisher BioreagentsBP248450
Well plate for PCRVWR International89218-294384-well plate

References

  1. Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
  2. Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
  3. Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651(2009).
  4. Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
  5. Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
  6. Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708(2009).
  7. Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
  8. Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
  9. Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
  10. Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
  11. Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
  12. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  13. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
  14. Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21(2001).
  15. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
  16. Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
  17. Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
  18. Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
  19. Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
  20. Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
  21. Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70(2011).
  22. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  23. Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
  24. Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 NF B luciferase RT qpcr

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved