JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול במהירות ובקלות למדוד גורם גרעיני קפא-אור-שרשרת-משפר של תאים B מופעל (NF-κB) הפעלה קווי התא המבטא NF-κB:: לוציפראאז בונה הכתב, דרך מדידות של לומינציה בתא ליפוסט. בנוסף, ביטוי הגנים נקבע באמצעות RT-qPCR מבודדים מתאים נגועים סלמונלה typhimurium.

Abstract

Dimeric שעתוק מקדם NF-κB מסדיר מסלולים רבים תגובה תאית, כולל מסלולים דלקתיים על ידי גרימת ביטוי של ציטוקינים שונים ונוגדנים. NF-κB הוא ביטא מבחינה חוקתית והוא מוקף בציטוזול על ידי הגורם הגרעיני של חלבון המעכב של קאפה אור פוליפטידים גנים משפר ב-B מעכב תאים, אלפא (IκBα). ההפעלה של NF-κB דורש השפלה של IκBα, אשר חושף אות לוקליזציה גרעינית על NF-κB ומקדם את הסחר שלה לגרעין. פעם אחת בגרעין, NF-κB נקשר לאזור מקדם של κB מטרה גנים כגון אינטרלויקין 6 (il-6) ו-IL-23, כדי לקדם את הביטוי שלהם.

ההפעלה של NF-κB מתרחשת באופן עצמאי של תמלול או תרגום. לכן, מצב ההפעלה של NF-κB חייב להיות נמדד על ידי כימות NF-κB במיוחד בגרעין, או על ידי כימות הביטוי של הגנים היעד NF-κB. בפרוטוקול זה, תאים באופן מאוד מנוכר עם NF-κB:: בניית הכתב לוציפראז הם המאייד עבור הפעלה NF-κB באמצעות טכניקות התרבות של רקמת מבחנה. תאים אלה נגועים בסלמונלה typhimurium כדי להפעיל את NF-κB, אשר טרפיics לגרעין ונקשר לאתרי κB באזור המקדם של לluciferase, גרימת הביטוי שלה. התאים מנותחים ומנותח עם. מערכת השיטת הליפראז כמות לוציפראז המיוצר על ידי התאים באמצעות העוצמה של אות האור, אשר מזוהה על ידי קורא צלחת. האות שנוצר על ידי הליך זה מספק שיטה מהירה ורגישה מאוד להערכת הפעלה NF-κB תחת מגוון של תנאים. פרוטוקול זה מנצל גם שעתוק כמותי הפוכה PCR (RT-qPCR) כדי לזהות רמת mRNA היחסי המעידים על ביטוי גנים.

Introduction

משפחת הגרעין κB (NF-κB) של חלבונים הם שעתוק חשוב המווסת את הביטוי הגנטי במסלולים ביולוגיים שונים. הפעלה של NF-κB גורם שעתוק של גנים היעד, רבים מהם חשובים לתגובות החיסונית דלקתית, התפשטות התא, התגובות לחץ התקדמות הסרטן1,2. NF-κB משחק תפקיד בלתי נפרד בתוצאות דלקתיות מוקדם עבור סיווג הפתוגן. בהינתן תהליכים ביולוגיים רבים מתווכת על ידי הפעלה NF-κB, שיבושים איתות יכול להיות השלכות חמורות על בריאות ומחלות. הפסד של פונקציה מוטציות ב-NF-κB איתות משויכים מספר פנוטיפים החיסונית מחסור, בעוד הרווח של מוטציות פונקציה משויכים עם מספר סוגים של סרטן, כולל B-cell לימפומה השד סרטן3. בנוסף, פתוגנים רבים הוכחו ישירות לווסת את מצב ההפעלה של NF-κB באמצעות ביטוי של גורמים התקפה אלימה4,5,6,7.

ההפעלה של NF-κB ידוע להיות תוצאה של גירויים משתנים רבים כולל מוצרים חיידקיים כגון ליפופוליסכולידים (LPS), הפלאג ו peptidoglycans המכונה דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMPs). PAMPs אלה מזוהים על ידי קולטני זיהוי תבנית (PRRs) כגון קולטני חיוג כמו (TLRs) ו הנהון כמו קולטנים (NLRs) המוביל ההפעלה של NF-κB ואת הביטוי הבא של מערך של NF-κB-התלויים גנים דלקתיים8. בנוסף הפעלת PRR ידי PAMPs, מוצרים בקטריאליים אחרים, כגון חלבונים אפקטור חיידקי, יכול לגרום להפעלה של NF-κB. מעניין, חיידקים גם לבטא חלבונים אפקטור כי פעיל מחליש את המסלול NF-κB ולשפר את הפתוגניות שלהם, הבקיע את החשיבות של NF-κB כמגשר חיוני של חסינות9.

ישנן חמש יחידות משנה שונות היוצרות את ה-NF-κB דימרס; p50, p52, לה (p65), RelB ו-cRel. שני הטרודינים העיקריים של NF-κB הם p50: לה והp52: הדימרס. הפעיל NF-κB דימרים לאגד אתרי DNA, המכונה אתרי κB, במקדם ומשפר אזורים של היעד גנים שונים. תחת תנאים נורמליים הומסטטיים, NF-κB אינטראקציה עם משפחה של חלבונים מעכבי המכונה IκB חלבונים להישאר פעילים. עם הגירוי, IκB מIκB קינאז (IKK), אשר מאפשר לו להיות ממוקד עבור אוביקווינציה, ולאחר מכן השפלה. השפלה של IκB מפעילה NF-κB על ידי חשיפת אות לוקליזציה גרעינית. NF-κB אז העברה לגרעין, שם הוא מאגד אתרי κB באזור המקדם של גנים היעד ולקדם שעתוק10. כך, הפעלה של nf-κB upregulates mrna ביטוי של גנים היעד nf-κB, ושינוי זה ניתן למדוד באמצעות כימות RNA בחני כגון RT-qpcr11.

מספר שיטות קיימות ומשמשות בדרך כלל עבור המדידה של הפעלה NF-κB, כולל משמרת חשמלית אלקטרופיניטית לנוע (emsa), טרנסלוקציה גרעינית, ו כתבת גנים בחני. EMSA משמש כדי לזהות מכלולי חלבון עם חומצות גרעין. תאים ממריצים הם מאבקים כדי לבודד חלבונים גרעיניים, כולל ממוקם NF-κB, אשר לאחר מכן מודדת עם הנוקלאוטידים מקרינה המכילה את התחום איגוד NF-κB. הדגימות מופעל על ג'ל והוא בתמונה על-ידי האדיגרפיה האוטומטית של חומצה הגרעין 32P שכותרתו. אם NF-κB נמצא בשבר החלבון, זה יהיה לאגד את נוקלאוטידים, אשר יועברו לאט דרך הג ולהציג כמו להקות דיסקרטית. שברים גרעיניים של תאים חסר NF-κB (למשל, בתאי בקרה בלתי מגורה) יפיק לא להקות כמו נוקלאוטידים להגר מהר יותר לסוף ג'ל. החיסרון העיקרי של שיטה זו היא כי היא כמותית במידה רבה במובן הבינארי (כלומר, on או off) ואינו מספיק ללכוד הבדלים משמעותיים בקיבולת האיגוד NF-κB. בנוסף, שיטה זו אינה מחשיבה מבנים כרומטין החשובים מבחינה פונקציונלית עבור גנים היעד של NF-κB12,13.

בדומה לשיטה הקודמת, קיים שיטת "ללא משמרת", שבה לוחות מרובים מצופים בנוקלאוטידים המכילים את רצף הכריכה NF-κB. לאחר טיפול בתאים עם שברים גרעיניים של חלבון, NF-κB יהיה לאגד את הנוקלאוטידים כרוך לבאר. נוגדנים Anti-NF-κB לאחר מכן, אשר יהיה אינטראקציה עם מאוגד NF-κB ולייצר אות מטרי צביעה ביחס לסכום של NF-κB, המציין את מידת ההפעלה NF-κB. שיטה זו היא יתרון על EMSA כי הוא אינו דורש חומצות גרעין רדיויניום והוא כמותי, בהשוואה. עם זאת, אזהרה של שיטה זו היא כי שוב אינו מבדיל בין מדינות כרומטין של היעד NF-κB גנים14.

שיטה נוספת שבאמצעותה ההפעלה NF-κB ניתן לזהות היא על-ידי כרומטין immunoprecipitation (שבב), לפיו ה-DNA ו חלבונים אינטראקציה הם מקושרות עם פורמלדהיד ו immunoprecipitated עם נוגדנים אנטי NF-κB ספציפי. שברי הנוקלאוטידים הספציפיים מטוהרים ומזוהים באמצעות הגברה של PCR או רצף התפוקה הגבוה הישיר. תוצאות שנוצרו משיטה זו מספקות תוצאות חצי כמותיים של פעילות איגוד NF-κB עם גנים מכוונים. עם זאת, התוצאות תלויות מאוד בתנאי הקיבוע ובתהליכי הטיהור בכל שלב15.

ב טרנסלוקציה גרעינית, תאים מגורה כדי לגרום NF-κB הפעלה ולאחר מכן תוקן. נוגדנים נגד p65 נוספים לתאים קבועים. לחילופין, p65 יחידת עצמה יכול להיות מתויג עם פפטיד פלורסנט כגון פלורסנט ירוק ירוק (gfp). בכל מקרה, האימונולובורנציה יאפשרו הדמיה של הלוקליזציה של p65 כדי לקבוע התפלגות תאית. על ידי מדידת הפרופורציה של cytosolic וחלבון גרעיני מקומי, החוקרים יכולים לקבוע את מצב ההפעלה היחסי של NF-κB. חיסרון של שיטה זו היא כי הimmunofluorescence היא יחסית זמן רב, דורש נוגדנים יקרים, והוא זקוק למומחיות טכנית גבוהה יחסית16.

גנים עיתונאי משמשים בדרך כלל כלים לחקר דפוסי הרגולציה והביטוי של גן של עניין. בדרך כלל, גנים העיתונאי נבנים מרצף היזם של גן של עניין התמזגו לקידוד גנים עבור חלבון ניתן לזיהוי בקלות. חלבונים עם פעילויות אנזימטיות, מאפיינים של קרינה פלואורסצנטית, או מאפייני האור, נבחרים בדרך כלל ליכולתם להיות מרותחת וכימות. לפיכך, הקריאה-out (למשל, לומינציה, זריחה) משמש כאות לגילוי הביטוי הגן. בנייה אלה עיתונאי ניתן להציג לאחר מכן סוגי תאים שונים, כגון תאים אפיתל או מקרופאגים.

המתואר בפרוטוקול הוא השימוש קו משוכפל תא החלה (הלה 57 א) כי הוא העביר באופן מספק עם כתב לוציפראז המכיל שלושה עותקים של הקונצנזוס κB של הκ החיסוני של מקדם השרשרת של השיווק באזור17. הביטוי של לוציפראז תלוי בהפעלה של NF-κB, אשר מתרחשת בעקבות גירוי התא. תאים ממריצים הם בקלות לאחר באמצעות מאגר לפירוק תאים המסופקים בערכת שיטת לוציפראז. חלק של התא ליפוסט מעורבב אז עם מאגר שיטת ללוציפראז המכיל ללוציפראז. לluciferin היא מצע של לוציפראז והוא נדרש עבור דור האור בנוכחות של לוציפראז. לאחר שילוב מאגר העיבוד עם הליפוסט, הפתרון פולט אור בתהליך הידוע בשם הומינסנציה. כמות האור המיוצר, שניתנה ב לומן, הוא פרופורציונלי כמות לוציפראז נוכח בבית הליפוסט ומשמש כמדד של הפעלה NF-κB. קריאות לומן מפורשים בהשוואה לתקן בלתי מגורה לחשבון עבור פעילות בסיסית NF-κB והאות עצמו יציב למשך מספר דקות כדי לאפשר מדידה אמינה. בנוסף, ה-"הלה 57" קו התאים מנוכר באופן מאוד עם כתבת β-κB. הכתבת הβ-גלטוסידאז מתבטאת באופן מכונן, והפעילות הβ-גלטוסידאז יכולה להיות נמדדת לשליטה על הכדאיות התאית או הווריאציה במספר התאים17. הערכים לוציפראז יכולים להיות מותאמים לערכים β-גלטוסידאז ודיווחו על הגדלת הקיפול על תאי הבקרה הבלתי ממריצים.

מאז NF-κB הוא הגורם שעתוק אחראי על הביטוי המוגבר של גנים היעד התלויים NF-κB, ניסוי מעקב כדי לשלוט על NF-κB תלויי תלוי ביטוי הגנים הוא שעתוק הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( RT-qPCR). RT-qPCR היא שיטה רגישה מאוד, שבאמצעותה ניתן לכמת את השינויים בביטוי הגנים במספר הזמנות של סדר גודל. תאים ממריצים ובקרה נקצרו עבור RNA באמצעות כלורופורם פנול-הכלורופורם. לאחר הפרדת הפאזה, ה-RNA מופק כמרכיב העיקרי של השכבה הימית. RNA הוא אז זירז ונשטף כדי לייצר גלולה טהורה. גלולה זו היא לאחר מכן מחדש וניקה נוספת של דנ א מזוהם באמצעות טיפול DNase. ה-RNA הטהור הפוך לאחר מכן ליצירת דנ א משלים (cDNA). CDNA זה יכול להיות מנותח באמצעות טכניקות PCR כמותיים, שבו שפע של רצף mRNA ספציפי הוא כימות כדי לקבוע ביטוי גנים. טכניקה זו אינה מחשיבה את השליטה בשיטת התרגום, שינוי העברה באמצעות שינויים, שפע החלבון או פעילות החלבונים. עם זאת, גנים רבים, במיוחד אלה המעורבים בתהליכים הפרו-דלקתיים, מוסדרים דרך NF-κB ו-mRNA שלהם מעיד על הביטוי שלהם.

השיטה המוצעת כאן משתמשת בדרך מהירה ופשוטה, שבאמצעותה ההפעלה NF-κB ניתן לזהות באמצעות האור הדרך של ליפוסט הסלולר. RT-qPCR של הביטוי הגנטי NF-κB היעד יכול לשמש לכמת ביטוי של גנים מסוימים, כמו גם לאמת פעילות פונקציונלית של הפעלה NF-κB. היתרונות העיקריים של מערכת כזו הם הפשטות והמהירות שלה, אשר מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של מגוון של מצבים לווסת הפעלה NF-κB. פרוטוקול זה מתאים קווי תאים אחרים המבטא NF-κB:: הכתב לluciferase, ו הפגינו באופן בלתי נשכח 264.7 תאים גולמיים RAW18. כמות הזמן הנדרשת לטיפול בדגימות, החל מפירוק התא ליצירת אות הארה, היא מינימלית ואורכת כשעה. מדידת NF-κB דורש רק ציוד מעבדה בסיסי כגון לוחות אטומים, קורא צלחת המסוגל למדוד הזדקנות, ותוכנות ניתוח נתונים פשוטים כגון תוכנית גיליון אלקטרוני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הפסעות תא וזריעת

  1. שמור על הלה 57 תאים בבקבוקון 75 ס"מ2 בקבוקון המכיל 10 מ ל של מדיה שונה של הנשר של דולבקו (dmem) שיושלם עם 5% חום העובר מופעל סרום העוברי (fbs) ב 37 ° c בחממה 5% CO2 .
  2. מנושף את מדיית תרבות התאים ומכבסת באמצעות 1 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון. מלבין טריפסין ומחליפים. בתוספת של 1 מ ל מניחים את הבקבוקון בחממה 37 ° c עבור 4-5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מבקבוקון.
  3. הוסף 9 מ ל של מדיית תרבות התא ושטוף בעדינות את החלק התחתון של הבקבוקון כמה פעמים כדי להוציא תאים וליצור השעיה הומוגנית.
  4. לדלל את הלה 57 תאים 1:6 או 1:8 במדיה ובזרעים טריים לתוך מבחנות חדשות. מעבר תאים כאשר הם 90% שוטפת או כל שלושה ימים ולשמור על התאים במינימום של 25% שטף.
  5. יום אחד לפני גירוי התאים, טריזיציזציה של הלה 57 a תאים ולהשעות 10 מ ל של מדיה צמיחה. לספור תאים בהשעיה באמצעות הומוציטוטומטר ולהשתמש במדיית הצמיחה כדי לדלל תאים לריכוז הסופי של 2.5 x 105 תאים/mL בצינור 50 mL חרוט.
  6. העבר 250 μL של השעיית תא (~ 6.25 x 104 תאים) לכל טוב של הצלחת 48-באר. כיפה מעת לעת והפוך את צינור החרוט כדי להבטיח השעיית תא הומוגנית. הקש על הצלחת בעדינות בצד כדי לוודא שהתאים מפיצים בצורה אחידה בבארות.
  7. העבר את הצלחת ל 37 ° c בחממה של 5% CO2 ואפשר לתאים לצרף ולצמוח בן לילה.

2. הכנת חיידקים

  1. יומיים לפני ההדבקה, רצף קפוא מניות של סלמונלה אל LB אגר צלחות לייצר מושבות יחיד. העברת צלחות לחממה שנקבעה ל-37 ° c ומאפשרת צמיחת לילה.
  2. יום אחד לפני הזיהום, להוסיף 3 מ ל של מרק lysogeny קימוט (LB) לצינורות התרבות החיידקית סטרילי, הוספת אנטיביוטיקה המתאים למדיה.
  3. באמצעות לולאה סטרילית, לבחור מושבה אחת מתרבויות חיידקי מקוטע ולגעת את הלולאה למדיה LB. מכסה את החצוצרות לאחר הסרת הלולאה ומתעלם מהלולאה.
  4. מניחים את הצינורות באינקובטור רועד הממוקם ב-37 ° c, 180 סל"ד, ומאפשרים לגדל בן לילה.
  5. ביום של זיהום, לשחזר את התרבויות חיידקי הלילה מן החממה.
  6. הכינו צינורות עבור תת-תרבות על ידי הוספת 3 מ ל ליברות טריים, המכילים אנטיביוטיקה כאשר הם מתאימים.
  7. העברה 30 μL של התרבות לילה בקטריאלי (1 ב 100 דילול) אל התקשורת המוכן טרי. מניחים את הצינורות באינקובטור רועד שנקבע ב-37 ° צ' למשך 3 שעות.
  8. לאחר הדגירה 3 h, להעביר 1 מ ל של ציר LB סטרילי לתוך קובט פלסטיק לשמש כריק. העבר 900 μL של LB לתוך כימיקלים אחרים כדי לשמש לניתוח לדוגמה.
  9. העברת 100 μL של תת-תרבות חיידקית לתוך קובט המכיל 900 μL של LB ו פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב. חזור על זה עבור כל השעיה בקטריאלי.
  10. הפעל את הספקטרוסקופיה כדי למדוד את צפיפות אופטית (OD) של תרבויות חיידקי באורך הגל של 600 ננומטר (OD600).
  11. מניחים את הריק בספקטרוסקופיה. שימו לב לאוריינטציה, כפי שאמור להיות סימן כלפי החלק העליון המעיד על כך.
  12. סגור את המכסה ולחץ על כפתור ריק על ספקטרוסקופיה כדי לקבל את ספיגת הרקע.
  13. החלף את הקובט הריקות בקובט לדוגמה באותו כיוון ולחץ על ' קרא'.
  14. הקלט את ה-OD600 ערכים של דגימות אלה. הכפל את הערך ב-10 כדי להתחשב בפקטור הדילול.
  15. דלל את תת-תרבות החיידקית באמצעות ליברות טרייה כדי להשיג ערך ספיגה של כ-1.0, שמתאים בערך ל-1 x 109 cfu/mL. לדלל את ההשעיה 1:10 בקובט ולמדוד את ספיגת-אשר צריך לתת ערך של ~ 0.1.
  16. בצינור חדש, להוסיף את הנפח המתאים של תת-בית מדולל ליברות טרי כדי להשיג השעיה של 1 x 108 cfu/mL כדי לשמש לצורך השעיית.
  17. להכין מדלל סדרתי של האינוןעל ידי העברת 50 μL של הבולם החיידקי לצינור המכיל 450 μL של ה-PBS הסטרילי (10-קיפול דילול) עד הדילול הסופי של כ 102 cfu/mL הוא עשה.
  18. העברת 100 μl של שתי הדילול הנמוך ביותר (102 ו-103 המקביל עם 10 ו 100 המושבה היוצרים יחידות, בהתאמה) לצלחת אגר LB ולהפיץ את ההשעיה עם פסק תא להשיג מושבות יחיד. העבירו את הצלחות האלה לחממה 37 ° c ומטה בלילה.
  19. למחרת היום סופרים את המושבות ומחשבים את הריכוז החיידקי של האינואוציה הראשונית כדי לקבוע את הריכוז הממשי.

3. זיהום תאים

הערה: בשלב זה, התאים אמורים להיות בערך 90% שליטה. עבור הלה 57 תאים בצלחת 48-באר, זה בערך 1 x 105 תאים לכל טוב. תאים יהיו נגועים בריבוי של זיהום (מוי) של 10, או 106 cfu/טוב.

  1. סמן את מכסה הלוחית בהתאם לתנאי הזיהום שישמשו עבור כל היטב, כאשר כל תנאי נעשה בטרילקאט.
  2. הוסף 10 μL של האירשת לבארות המתאימות. הוסף 10 μL של LB סטרילי לבארות בקרה נגוע.
  3. כדי לסנכרן את הזמן של זיהום, למקם את הצלחת בצנטריפוגה שולחן וספין ב 500 x g עבור 5 דקות, להבטיח כי הצלחת מאוזנת הדלפק.
  4. העבר תאים נגועים 5% בחממה2 ב 37 ° c עבור 1 h.
  5. מניחים מדיה של תרבות התא באמבט מים 37 ° c לשימוש בשלב הבא.
  6. שעה לאחר הזמן של זיהום, להסיר מדיה תרבות התא מאמבט מים ולנגב את החוץ עם 70% אתנול. להעביר את הצלחת תרבות הרקמה לארון בטיחות.
  7. באמצעות טכניקה סטרילית, מחממים מדיה מבארות ולהחליף עם 250 μL של מדיה טרייה וחמימה של תרבות התא.
  8. החזר צלחות לחממה 5% CO2 ב 37 ° c עבור נוספים 4 h.
  9. להסיר צלחות מתוך CO2 חממה ומלא את התקשורת מן הבארות. עבור ניתוח לוציפראז להמשיך לשלב 4.1. עבור בידוד RNA להמשיך לשלב 5.1.

4. ניתוח לוציפראז

  1. הוסף 100 μL של מאגר פירוק תאים של 1x לבארות. ייתכן שיהיה צורך לדלל תחילה את המאגר לריכוז תקין, בהתאם לסוג המגיב.
  2. להעביר את הצלחת ל-80 מקפיא ° c ו-דגירה עבור לפחות 30 דקות כדי להבטיח הליזה תאים יעילה.
  3. מניחים את הצלחת המכילה תא קפוא ליפוסט על ספסל להפשיר ולהכין לוציפראז המצע ריאגנטים על פי המלצות היצרן.
  4. אפשר לוציפראז במצע ריאגנטים למתן שיווי משקל לטמפרטורת החדר.
  5. הפעל את קורא הצלחות ופתח את תוכנית הקורא המתאימה. הגדר את המכונה כדי למדוד הזדקנות.
  6. העברה 10 μL של כל מדגם לבאר של מ96 לוחית אטומה.
  7. הוסף 50 μL של השימוש לוציפראז מגיב באמצעות פיפטה רב-ערוצית לכל טוב של הלוח האטום.
  8. הקש בעדינות על הצלחת בצד כדי לערבב בארות ולוודא כי המשטח התחתון מכוסה בנוזל. מניחים את הצלחת בקורא צלחת ליזום קריאה.
  9. העתק את ערכי האור לתוך תוכנית גיליון אלקטרוני והתווה את התוצאות.

5. בידוד RNA

  1. הוסף 500 μL של הגואנידיום thiocyanate כל טוב ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח להשלים את הפירוק.
  2. העבר את התוכן לשפופרת מיקרוצנטריפוגה המסומנת בתווית. שמור דגימות על הקרח ככל האפשר כדי לשמור על איכות RNA.
  3. הגדר צנטריפוגה שולחן ל-4 ° c ושמור על הצנטריפוגה בטמפרטורה זו לשארית הפרוטוקול.
  4. לכל דגם שפופרת, הוסף 100 μL של כלורופורם, כיפה ומטלטל עבור 15 ס מ. מודאנאט בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  5. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. במהלך הזמן הזה, להתכונן לשלב הבא של טיהור RNA ידי תיוג צינורות חדשים.
  6. העבר את השלב הגבוה מימית לצינור החדש המכיל 250 μL של איזופנול, להיזהר לא להפריע את השכבות האמצעית או התחתונה.
  7. אחסן מוצר שאינו בשימוש במקפיא של a-80 ° c, אשר יכול לשמש גם עבור ניתוח חלבון. שרידי השכבה מימית עשוי גם לשמש כגיבוי אם יש צורך ב-RNA מאוחר יותר.
  8. מערבולת תערובת של שכבה מימית ו איזופנול ולאפשר דגימות לשבת בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.
  9. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  10. להסיר צינורות מצנטריפוגה. רנ א מזרז צורות גלולה לבנה בצד התחתון של הצינור. פתחו את הצינורות והסירו בזהירות את הסופרנטנט על ידי שפיכת החוצה למיכל פסולת.
  11. לשטוף את הגלולה RNA על ידי הוספת 500 μL של 75% אתנול ומערבולת.
  12. צנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  13. הסר את סופרנטנט על ידי שפיכת ושטוף שוב את הגלולה עם 75% אתנול.
  14. צנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  15. באמצעות פיפטה נפח קטן (g., 10-200 μL נפח), מנושף כמו הרבה supernatant ככל האפשר, להיות זהירים לא לדחוף את כל נוזל בחזרה לתוך הצינור או להוציא את הגלולה עם קצה הפיפטה. אם הגלולה הופכת מסירה, צנטריפוגה לזמן קצר ושוב לנסות להסיר supernatant.
    1. האוויר יבש את כדורי RNA. אם כדורי גלויים עבור כל דוגמה, מדי פעם (כל 5 דקות) לבדוק אותם כדי לראות אם הם משתנים מלבן לנקות, המציין כי הם יבשים. לאחר כדורי להתחיל לפנות ברור, להוסיף 20 μL של ultrapure, RNase מים חופשיים כדי לפזר את ה-RNA.
    2. אם כדורי לא היו גלויים בתחילה עבור כל הדגימות, פשוט להוסיף מים אלקטרופורזה 5 דקות לאחר הסרת supernatant.
  16. כדי להגדיל את המיסיסות, להעביר את הפתרון כמה פעמים דרך טיפ פיפטה ו הדגירה עבור 10 דקות ב 55-60 ° c.

6. DNase טיפול של RNA

  1. כדי לשמור על שלמות RNA, אחסן דגימות RNA על הקרח אלא אם צוין אחרת. בשלב זה, מאגר DNase 10x ניתן להסיר מן המקפיא ומותר להפשיר על הקרח.
  2. הכינו את הספקטרוסקופיה לניתוח לדוגמה על ידי ניקוי כל משטחי ניתוח לדוגמה עם מטלית ללא מוך.
  3. קח מדידה ברקע לפני הניתוח. כדי לעשות זאת, לטעון את החיישן עם 1.5 μL של מים באולטרסאונד זהה בשימוש כדי לפזר את כדורי RNA. לחצו על הלחצן ' קרא ריק ' כדי ליצור קריאת רקע.
  4. השתמשו במטלית המוך למחיקת משטח ההעמסה של הכלי. חזור על שלב זה לאחר כל קריאה לדוגמה.
  5. טען 1.5 μL של השעיית RNA מחדש למחזיק הדגימה ובחר באפשרות ' קריאה לדוגמה'. חזור על הפעולה עד לקריאת כל הדגימות.
  6. הכנת DNase לערבב הורים על ידי שילוב 2.4 μL של מאגר 10x DNase ו-1 μL של DNase, לכל מדגם, בשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. הכן את המיקס הראשי עבור שני כרכים נוספים.
  7. מערבבים את המיקס הראשי על ידי הצליף הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה בקצרה את השפופרת כדי לאסוף את התוכן בתחתית השפופרת. הוסף 3.4 μL של מאסטר לערבב עד 20 μL של המדגם RNA. ערבב תוכן על ידי מצליף וצנטריפוגה בקצרה, כמו בעבר.
  8. העבירו את הדגימות לבלוק חום שנקבע ב-37 ° c עבור 20 דקות. הסר את מגיב DNase להקפאה מהמקפיא והפשרה בטמפרטורת החדר.
  9. 20 דקות לאחר הצבת דגימות על בלוק החום, להעביר את הדגימות למדף צינור ממוקם על ספסל העבודה.
  10. מערבולת בעדינות את התוכן של הפעלת DNase מגיב. העברת 2.6 μL של DNase הפעלה מגיב לצינורות המכילים RNA ולאחר מכן קפיצי את הצינורות כדי ליצור תערובת הומוגנית.
  11. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x g עבור 1 דקות.
  12. מנקז בזהירות את הסופרנט. לצינור חדש שמסומן בתווית

7. שעתוק הפוכה של mRNA כדי cDNA

  1. הכן תמהיל מאסטר בהתאם לכמות הדגימות ועוד שתיים נוספות לחשבון עבור אובדן באמצעות ליטוף (שולחן 1). השתמש 1 μg של RNA ולהוסיף H2O כדי נפח של 50 μl סך הכל.
ריאגנטאמצעי אחסון (μL)ריכוז סופי
מאשר2 (25mm)3.51.75 ממ '
תעתיק הפוך מאגר (10x)מיכל 51x
שילוב dNTP (10 μM, כל אחד)2.5500 ננומטר
ה, מיון אקראי (100 μM)1.252.5 μM
מולטיסופר לאחור הטרנסקריפטאז (50 U/μL)11 U/μL
מעכב RNase (20 U/μL)1.251.25 U/μL
RNA (1 μg)20 ng/uL
H2Oלמעלה עד 50

שולחן 1: רכיבים ומתכון עבור שעתוק הפוכה לערבב הורים.

  1. כיסוי הדגימות הדוק ולסמן את צינורות ה-PCR בצד כמו תוויות על המכסה ניתן להסיר את המכסה המחומם של הציקלוניים מאוחר יותר. מערבבים על ידי הורטקנג.
  2. צנטריפוגה בקצרה את צינורות ה-PCR כדי לאסוף דגימות לתחתית הצינור.
  3. הניחו את צינורות ה-PCR בתוך הציקלטרנר והציבו את הדגימות תחת ההגדרות הבאות:
    25 ° c עבור 10 דקות, 48 ° c עבור 30 דקות, 95 ° c עבור 5 דקות, ולאחר מכן להחזיק 10 ° c.
  4. העברת צינורות המכילים cDNA החדש מסונתז ל-20 ° c מקפיא או להשתמש מיד בניתוח qPCR.

8. הכנת הלוח עבור ניתוח RT-qPCR

  1. לפני תחילת, לתכנן את הכיוונון של הלוח 384-היטב qPCR לניתוח לדוגמה.
  2. להפשיר את התחל. ולעשות דנ א על קרח
  3. הכינו תמהיל ראשי (ראו טבלה 2), ועוד כ-10% תוספת לחשבון על אובדן באמצעות ליטוף.
ריאגנטאמצעי אחסון (μL)
10 פריימר מיקרומטר1
10 פריימר מיקרומטר R1
מדחס24
2x SYBR ירוק10

שולחן 2: רכיבים ומתכון עבור מיקס מאסטר qPCR.

  1. מערבולת הורים לערבב לוותר 8 μL לתוך הבארות של 384-צלחת הבאר באמצעות משחזר פיפטה. דגימות ינותחו בשכפול עבור כל פריימר ו-cDNA לדוגמה שילוב.
  2. באמצעות P10 (או קטן יותר) הפיפטה, להעביר 2 μL של cDNA כדי לשכפל בארות עבור כל פריימר להגדיר להיות מנותח. החלף עצות לאחר כל טוב כדי למנוע זיהום צולב.
  3. לאטום את הצלחת על ידי החלת בזהירות את הסרט דבק על פני השטח, להבטיח כי כל הבארות מכוסים. לחצו על הסרט באמצעות מחבט איטום או רולר לאטום בחוזקה.
  4. מניחים את הצלחת בצנטריפוגה, עם צלחת ריקה כמשקל. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x g עבור 5 דקות.

9. הפעלת הציקלאני התרמי לניתוח qPCR

  1. הפעלה של המחשב ומכשיר ה-PCR בזמן אמת.
  2. פתח את התוכנה RT-qPCR ובחר ניסוי חדש.
  3. תחת הכרטיסיה התקנה , בחר באפשרות מאפייני ניסוי, שבהם ניתן להגדיר את הפרמטרים עבור ההפעלה.
  4. הגדר את שם הניסוי, שיקבע את שם הקובץ וההגדרות שישמשו לאחסון תוצאות.
  5. עבור הכלי בחירה, בחר את הכלי המחובר כעת שמפעיל את הניתוח. בחר שיטת הפעלה של CT (ΔΔCt) השוואתית .
  6. בחר Sybr גרין ריאגנטים כמו לצבוע DNA פלורסנט לשמש רגיל כמו מהירות השיפוע.
  7. ודא שהתיבה שליד כלול עקומת התפוגגות מסומנת.
  8. תחת הכרטיסייה הגדרה , להקצות יעדים (כלומר, גנים להיות מוגבר), ודגימות (כלומר, תנאים ניסיוניים).
  9. בחר את הכרטיסיה הקצאה . סמן את הבארות עם המטרות והדגימות המתאימות, כאשר הן מתאימות לערכת ההעמסה של הצלחת 384-היטב.
  10. בחר שיטת הפעלה. השתמש בפרמטרים לניתוח המפורט ב (טבלה 3).
החזק במההשלב הPCRממיסים את השלב העקום
. צעד ראשון. צעד 2. צעד ראשון. צעד 2. צעד ראשון. צעד 2. צעד שלישי
Temp50 ° c95 ° c95 ° c60 ° c95 ° c60 ° c95 ° c
זמן2:0010:000:151:000:151:000:15
איסוף נתוניםכןכן
מספר מחזורים1x40x1x

שולחן 3: הפרמטרים של מחזור התרמוטרטרנר.

  1. מניחים את הצלחת 384-באר בציקלוניר ומתחילים בניתוח.

10. אנליזה של תוצאות qPCR עם שיטת דלתא-דלתא Ct (2-ΔΔCt)

  1. ניתוח תוצאות שנוצרו מתגובת qPCR לשגיאות שעלולות להפריע לניתוח במורד הזרם. שגיאות רבות יסומנו באופן אוטומטי על-ידי המערכת.
  2. כדי לבנות את התחל באופן תקין, עקומות להמיס צריך להיות רק פסגה אחת. הוצא את כל הבארות המכילות עקומת התפוגגות עם יותר מפסגה אחת מניתוח נוסף.
  3. יצא את ערכי ה-Ct לתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לנתח את הנתונים באמצעות השיטה ΔΔCt. תבנית מוצעת מסופקת (טבלה 4). העמודה האחרונה היא שינוי ביטוי הקיפול של המדגם, ביחס לדגימות הפקדים.
גן משק בית (גנד)גן העניין (IL6)
Ct1Ct2Ave CtCt1Ct2Ave CtΔCtAve ΔCt ctrlsΔΔCt2 ^-(ΔΔCt)פונקציה geomean
שליטה 115.3315.3715.3526.8126.9126.8611.5110.511.000.501.00
שליטה 216.8316.7716.8026.8926.9226.9110.1110.51-0.411.33
שליטה 317.5617.5317.5427.3827.5627.479.9310.51-0.591.50
Sl1344 115.5015.4115.4522.1522.1322.146.6910.51-3.8314.2113.23
SL1344 216.0215.9816.0023.0122.9622.986.9810.51-3.5311.57
SL1344 317.2717.3017.2823.9923.9823.986.7010.51-3.8214.09
Sipa sopB sopE2 115.3815.4115.3923.3123.0923.207.8010.51-2.716.567.29
Sipa sopB sopE2 216.0116.0516.0323.8923.9223.917.8810.51-2.646.23
Sipa sopB sopE2 316.7816.7816.7824.0224.0624.047.2710.51-3.259.49
מsopE2 שינה15.5215.6015.5627.0427.0327.0311.4710.510.960.510.79
מsopE2 שינה 215.5615.5915.5726.3726.4226.3910.8210.510.310.81
Sipa SopE2 sopE 315.9115.9215.9126.2426.1226.1810.2710.51-0.251.19

טבלה 4: תבנית לניתוח נתוני qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיקול המתואר כאן מתמקד הפעלה של שעתוק הגורם NF-κB באמצעות הכתב NF-κB תלוי לוציפראז כי הוא באופן מאוד מנוכר לתוך קו של תאי הלה. הופעל NF-κB מאתרת את הגרעין שבו הוא מאגד אתרי האיגוד κB של גנים היעד, כולל ציטוקינים אנטי דלקתיות IL6 ו IL23. סקירה כללית של ההפעלה NF-κB מתוארת

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

התרומה העיקרית של הפרוטוקול המתואר היא כי היא מספקת שיטה מהירה וקלה לזהות הפעלה NF-κB בתאים, אשר מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מצבים גירוי מרובים או תרופות המשפיעים על הפעלת NF-κB. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור הפעלה NF-κB בתאי הלה נגועים בסלמונלה. תאים אלה יכולים לשמש זיהום עם פתוגנים אחרים, כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

מחקר במעבדת קאסטרה-Gounder נתמך על ידי מענקים מתוך הניסיוע של NIH תחת מספר הפרס R21AI122092 ומתוך האגודה האמריקנית לסוכרת תחת מספר הפרס 1-18-JDF-035.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive filmVWR International60941-070
ChloroformFisher BioreagentsC298-500
DMEMThermo Fisher11665092
DNAse treatment kitQiagen79254
dNTPsPromegaU1511
EthanolFisher BioreagentsBP2818100molecular grade
FBSSigma-AldrichF0926
HeLa 57A cellsRef # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814
IsopropanolFisher BioreagentsBP26181
KanamycinFisher BioreagentsBP906-5
LB agarFisher BioreagentsBP1425-500
Lysogeny brothFisher BioreagentsBP1426-500
MgCl2Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000Thermo Scientificspectrophotometer
Promega luciferase assay systemPromegaE1501Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random HexamersThermo ScientificSO142
Real-time GAPDH forward primer5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse TranscriptaseApplied Biosystems4308228
RNAse inhibitorThermo ScientificEO0381
RT bufferPromegaA3561
SL1344Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039Ref # 18
SYBR greenApplied Biosystems43091552x mastermix
Tri-reagentMolecular Research CenterTR 118guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTAThermo Fisher253000540.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure waterFisher BioreagentsBP248450
Well plate for PCRVWR International89218-294384-well plate

References

  1. Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
  2. Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
  3. Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651(2009).
  4. Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
  5. Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
  6. Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708(2009).
  7. Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
  8. Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
  9. Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
  10. Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
  11. Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
  12. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  13. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
  14. Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21(2001).
  15. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
  16. Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
  17. Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
  18. Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
  19. Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
  20. Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
  21. Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70(2011).
  22. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  23. Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
  24. Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155NF BRT qpcr

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved