サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

要約

ここでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物を発現する細胞株における活性化B細胞(NF-κB)の核因子カッパ軽鎖増強剤を迅速かつ容易に測定するプロトコルを提示し、細胞溶解物中の発光の測定を行う。さらに、遺伝子発現は、サルモネラ・チフィムリウムに感染した細胞から単離されたRT-qPCRを介して決定される。

要約

二量体転写因子NF-κBは、種々のサイトカインおよびケモカインの発現を誘導することによって炎症経路を含む多くの細胞応答経路を調節する。NF-κBは、B細胞阻害剤におけるカッパ光ポリペプチド遺伝子増強剤の阻害性タンパク質核因子によって細胞内で構成的に発現され、隔離される、α(IκBα)である。NF-κBの活性化は、IκBαの分解を必要とし、その後、NF-κB上で核局在化信号を露出させ、核へのその入稿を促進する。いったん核内に入ると、NF−κBはインターロイキン6(IL-6)およびIL-23などのNF−κB標的遺伝子のプロモーター領域に結合し、それらの発現を促進する。

NF-κBの活性化は、転写または翻訳とは独立して起こる。したがって、NF-κBの活性化状態は、核内で特異的にNF-κBを定量するか、またはNF-κB標的遺伝子の発現を定量することによって測定されなければならない。このプロトコルでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞は、in vitro組織培養技術を用いてNF−κB活性化のためにアッセイされる。これらの細胞はサルモネラ・チフィムリウムに感染してNF-κBを活性化し、核に入り込み、ルシフェラーゼのプロモーター領域のκB部位に結合し、その発現を誘導する。細胞はルシフェラーゼアッセイシステムでリゼし、分析される。細胞によって産生されるルシフェラーゼの量は、プレートリーダーによって検出される発光信号の強度と相関する。この手順によって生成される発光信号は、様々な条件下でNF-κB活性化を評価するための迅速かつ高感度な方法を提供します。このプロトコルはまた、遺伝子発現を示す相対mRNAレベルを検出するために定量的逆転写PCR(RT-qPCR)を利用する。

概要

タンパク質の核因子-κB(NF-κB)ファミリーは、様々な生物学的経路における遺伝子発現を調節する重要な転写活性化剤である。NF-κBの活性化は、標的遺伝子の転写を誘導し、その多くは免疫および炎症反応、細胞増殖、ストレス応答および癌進行^に重要^である。NF-κBは、病原体クリアランスのための早期炎症結果を媒取する上で不可欠な役割を果たす。NF-κB活性化によって媒介される多くの生物学的プロセスを考えると、そのシグナル伝達の中断は健康および病気に重大な影響を及ぼす可能性がある。NF-κBシグナル伝達における機能変異の喪失は、いくつかの免疫欠乏表現型に関連しているが、機能変異の獲得は、B細胞リンパ腫および乳癌³を含むいくつかのタイプの癌と関連している。さらに、多くの病原体は、毒性因子^{4、5、6、7}の発現を介してNF−κBの活性化状態を直接調節することが示されている。

NF-κBの活性化は、リポ多糖(LPS)、フラグエリンおよびペプチドグリカン(PamPs)として知られている細菌産物を含む多くの可変刺激の結果であることが知られている。これらのPAMPは、NF-κBの活性化およびNF-κB依存性炎症遺伝子⁸の配列のその後の発現につながるトール様受容体(TR)およびノッド様受容体(NR)などのパターン認識受容体(PRR)によって検出される。PamPsによるPRR活性化に加えて、細菌エフェクタータンパク質などの他の細菌産物は、NF−κBの活性化を誘導し得る。興味深いことに、細菌はまた、NF−κB経路を積極的に減衰し、その病原性を増強するエフェクタータンパク質を発現し、免疫の必須メディエーターとしてNF-κBの重要性を強調^する9。

NF-κBダイマーを形成する5つの異なるサブユニットがあります。p50, p52, RelA (p65), RelB および cRel.2つの主要なNF-κBヘテロダイマーはp50:RelAおよびp52:RelBダイマーである。活性化されたNF-κBダイマーは、κB部位として知られるDNA部位に、種々の標的遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域において結合する。正常な恒常性条件下では、NF-κBはIκBタンパク質として知られている阻害剤タンパク質のファミリーと相互作用し、不活性なままである。刺激の際、IκBはIκBキナーゼ(IKK)によってリン酸化され、ユビキチン化の標的となり、その後の分解を可能にする。IκBの分解は、核局在化信号を明らかにすることによりNF−κBを活性化する。NF-κBは次いで核に転移し、そこで標的遺伝子のプロモーター領域におけるκB部位を結合し、転写^10を促進する。従って、NF-κBの活性化は、NF−κB標的遺伝子のmRNA発現をアップレギュレートし、そしてこの変化はRT-qPCR11などのRNA定量アッセイを通じて測定することができる。

電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、核転座、遺伝子レポーターアッセイなど、NF-κB活性化の測定には、いくつかの方法が存在し、一般的に使用されています。EMSAは、核酸を含むタンパク質複合体を検出するために使用されます。刺激された細胞は、転移したNF-κBを含む核タンパク質を単離するために分画され、その後、NF−κB結合ドメインを含む放射性標識ヌクレオチドでインキュベートされる。サンプルはゲル上で実行され^、32P標識核酸の自己放射線撮影によって画像化される。NF-κBがタンパク質画分中に存在する場合、ヌクレオチドは結合し、これはゲルを通してゆっくりと移行し、離散バンドとして存在する。活性化NF-κBを欠く細胞の核分率(例えば、非刺激制御細胞)は、ヌクレオチドがゲルの末端まで速く移行するにつれてバンドを産生しない。この方法の主な欠点は、バイナリーセンス(すなわち、オンまたはオフ)で大部分が定量的であり、NF-κB結合容量の有意な差異を適切に捕捉しないことです。さらに、この方法は、NF−κB標的遺伝子^12、13に対して機能的に重要なクロマチン構造を考慮しない。

前の方法と同様に、マルチウェルプレートがNF−κB結合配列を含むヌクレオチドで被覆される「非シフト」アッセイがある。タンパク質の核画分を有する細胞の治療に続いて、NF−κBはウェルに結合したヌクレオチドに結合する。次いで、抗NF-κB抗体が添加され、結合したNF-κBと相互作用し、NF-κBの量に比例した比色シグナルを生成し、NF−κB活性化の程度を示す。この方法は、放射線標識核酸を必要とせず定量的であるという問題でEMSAよりも有利であり、比較して。しかしながら、この方法の注意点は、再びNF−κB標的遺伝子¹⁴のクロマチン状態を区別しないことである。

NF-κB活性化が検出され得る別の方法は、クロマチン免疫沈降(ChIP)によるものであり、それによってDNAおよび相互作用タンパク質はホルムアルデヒドと架橋され、特異的な抗NF−κB抗体と免疫沈殿される。その後、特定のヌクレオチド断片を精製し、PCR増幅または直接高スループットシーケンシングを介して同定される。この方法から生成された結果は、標的遺伝子とのNF−κB結合活性の半定量的結果を提供する。しかしながら、結果は各ステップ¹⁵における固定条件および精製プロセスに大きく依存する。

核転座アッセイでは、細胞が刺激されNF-κB活性化を誘導し、次いで固定される。抗p65抗体は固定細胞に添加される。あるいは、p65サブユニット自体は、緑色蛍光緑色(GFP)などの蛍光ペプチドでタグ付けすることができる。いずれの場合も、免疫蛍光は、p65の局在化のイメージングを可能にし、細胞分布を決定する。細胞質および核局在タンパク質の割合を測定することにより、研究者はNF−κBの相対的活性化状態を決定することができる。この方法の欠点は、免疫蛍光が比較的時間がかかり、高価な抗体を必要とし、比較的大きな技術的専門知識^を必要とすることである。

レポーター遺伝子は、目的の遺伝子の調節パターンおよび発現パターンを研究するために一般的に使用されるツールです。典型的には、レポーター遺伝子は、容易に検出可能なタンパク質をコードする遺伝子に融合された目的遺伝子のプロモーター配列から構築される。酵素活性、蛍光、または発光特性を有するタンパク質は、一般的にアッセイおよび定量化する能力のために選択される。したがって、読み出し(例えば、発光、蛍光)は、遺伝子発現の検出のためのシグナルとして機能する。これらのレポーター構築物は、上皮細胞またはマクロファージなどの異なる細胞型に導入することができる。

プロトコルに記載されているのは、免疫グロブリンκ鎖プロモーター領域¹⁷のκBコンセンサスの3つのコピーを含むルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトされたクローンHeLa細胞株(HeLa 57A)の使用である。ルシフェラーゼの発現は、細胞刺激の後に生じるNF-κBの活性化に依存する。刺激された細胞は、ルシフェラーゼアッセイキットに設けられた細胞リシス緩衝液を用いて容易にリンパがされる。次いで、細胞リサートの一部をルシフェリンを含むルシフェラーゼアッセイバッファーと混合する。ルシフェリンはルシフェラーゼの基質であり、ルシフェラーゼの存在下で光を生成するために必要とされる。アッセイバッファーと溶解物を組み合わせた後、溶液は発光と呼ばれるプロセスで光を放出する。生成される光の量は、ルーメンで与えられ、溶解物中に存在するルシフェラーゼの量に比例し、NF−κB活性化の尺度として機能する。ルーメンの読み取り値は、ベースラインNF-κB活性を考慮して非刺激標準と比較して解釈され、信号自体は信頼性の高い測定を可能にするために数分間安定しています。さらに、HeLa 57A細胞株は、NF-κB非依存型βガラクトシダーゼレポーターで安定にトランスフェクトされる。β-ガラクトシダーゼレポーターは構成的に発現され、β-ガラクトシダーゼ活性は、細胞生存率または細胞数¹⁷の変動を制御するために測定することができる。ルシフェラーゼ値は、β-ガラクトシダーゼ値に調整し、刺激されない対照細胞のフォールド増加として報告することができる。

NF-κBはNF-κB依存性標的遺伝子の発現増加を担う転写因子であるため、NF-κB依存性増加遺伝子発現を制御するフォローアップ実験は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)。RT-qPCRは、遺伝子発現の変化を数桁にわたって定量することができる高感度な方法です。刺激および対照細胞は、フェノールクロロホルム抽出を介してRNAのために収穫される。相分離の後、RNAは水層の主要成分として抽出される。その後、RNAを沈殿させて洗浄し、純粋なペレットを作製する。このペレットは、DNase処理を介して再構成され、さらに汚染物質DNAを洗浄します。次に、純粋な RNA を逆転写して相補的な DNA (cDNA) を作成します。このcDNAは、特定のmRNA配列の豊富さを定量化して遺伝子発現を決定する定量的PCR技術を通じて分析することができる。この技術は、翻訳制御、翻訳後修飾、タンパク質の存在量、またはタンパク質活性を解明しません。しかしながら、多くの遺伝子、特に炎症前プロセスに関与する遺伝子は、NF-κBを介して調節され、そのmRNAの存在量は、その発現を示す。

ここで提案される方法は、NF-κB活性化が細胞溶解物の発光アッセイを介して検出され得る迅速かつ簡単な方法を利用する。NF-κB標的遺伝子発現のRT-qPCRは、特定の遺伝子の発現を定量化し、NF−κB活性化の機能活性を検証するために使用することができる。このようなシステムの主な利点は、NF-κB活性化を調節する条件の範囲の高スループットスクリーニングを可能にする、そのシンプルさと速度です。このプロトコルは、NF−κB::ルシフェラーゼレポーターを発現する他の細胞株に適しており、かつ安定にトランスフェクトされたRAW264.7細胞¹⁸において実証されている。細胞溶解から発光信号の生成まで、サンプルの処理に要する時間は最小限で、約1時間のスパンを要します。NF-κBの測定には、不透明プレートなどの基本的な実験装置、発光を測定できるプレートリーダー、スプレッドシートプログラムなどの単純なデータ解析ソフトウェアのみが必要です。

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プロトコル

1. 細胞パッシングとシード

1. ^5%CO2インキュベーターで37°Cで5%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を補充したダルベッコの修飾イーグルの媒体(DMEM)の10 mLを含む75cm₂フラスコでHeLa 57A細胞を維持します。
2. 吸引細胞培養媒体を1mLのトリプシンEDTA溶液で洗浄した。吸引トリプシンを追加の1 mLで交換します。37°Cのインキュベーターに4~5分間入れ、細胞がフラスコから剥離できるようにします。
3. 9 mLの細胞培養液を加え、フラスコの底部を数回軽く洗い流して細胞を剥離し、均質な懸濁液を形成する。
4. 新鮮な媒体で1:6または1:8細胞を希釈し、新しいフラスコに種子。通路細胞は、90%のコンフルエントまたは3日ごとに、少なくとも25%のコンフルエントで細胞を維持する場合。
5. 細胞刺激の1日前に、HeLa 57A細胞をトリプシン化し、成長媒性の10mLで中断する。ヘモサイトメーターを使用して懸濁液中の細胞をカウントし、成長媒体を使用して、細胞を50 mL円錐管内の2.5 x 10⁵細胞/mLの最終濃度に希釈します。
6. 250 μLの細胞懸濁液(〜6.25 x 10⁴細胞)を48ウェルプレートの各ウェルに移します。定期的にキャップし、同種の細胞懸濁液を確保するために円錐管をめくります。プレートを側面にそっとタップして、細胞が井戸内で均一に分布していることを確認します。
7. プレートを_5%CO2インキュベーターで37°Cに移し、細胞が一晩付着して成長できるようにします。

2. 細菌の調製

1. 感染の2日前に、サルモネラ菌の凍結ストックをLB寒天プレートに付け、単一のコロニーを作り出した。プレートを37°Cに設定したインキュベーターに移し、一晩の成長を可能にします。
2. 感染の1日前に、3mLのリソジェニースープ(LB)を滅菌細菌培養管に加えて、適切な抗生物質をメディアに加える。
3. 無菌接種ループを使用して、ストリーク細菌培養物から単一のコロニーを選択し、LBメディアにループに触れます。接種後にチューブをキャップし、ループを破棄します。
4. 37°、180rpmに設定された揺れのインキュベーターにチューブを置き、一晩成長させます。
5. 感染当日に、インキュベーターから一晩細菌培養物を取り出す。
6. 必要に応じて抗生物質を含む新鮮なLBを3mL加えてサブカルチャー用チューブを準備します。
7. 一晩の細菌培養物の30μL(100希釈の1)を、新たに調製した媒体に移す。37°Cに設定した揺れのインキュベーターにチューブを3時間置きます。
8. 3時間インキュベーション後、1mLの滅菌LBスープをプラスチックキュベットに移し、ブランクとして機能します。サンプル分析に使用する他のキュベットに900 μLのLBを転送します。
9. 100μLの細菌サブカルチャーを、900°LのLBとピペットを含むキュベットに移し、数回混合します。細菌の懸濁液ごとにこれを繰り返します。
10. 分光光光度計をオンにして、600 nm(OD₆₀₀₎の波長で細菌培養物の光学密度(OD)を測定します。
11. 分光光度計にブランクを置きます。このようなことを示す上部にマークがあるはずなので、向きに注意してください。
12. 蓋を閉じ、分光光度計の空白ボタンを押して背景吸光度を得ます。
13. 空白のキュベットを同じ方向のサンプルキュベットに置き換え、Readキーを押します。
14. これらのサンプルの OD₆₀₀値を記録します。希釈係数を考慮して、値に 10 を掛けます。
15. 細菌サブカルチャーを新鮮なLBで希釈し、約1.0の吸光度値を達成し、これはおよそ1 x 10⁹ cfu/mLに相当します。この懸濁液1:10をキュベットで希釈し、吸光度を測定します( ~0.1の値を指定する必要があります)。
16. 新しいチューブに、希釈されたサブカルチャーの適切な量を新鮮なLBに加えて、1 x 10⁸ cfu/mLのサスペンションを達成し、接種体として使用します。
17. 約102cfu/mLの最終希釈が行われるまで、450μLの滅菌PBS(10倍希釈)を含むチューブに50μLの細菌懸濁液を移すことによって、接種液のシリアル希釈を準備します。
18. 2つの最も低い希釈液の100μL(それぞれ10および100コロニー形成単位に対応する¹⁰²および¹⁰³⁾をLB寒天プレートに移し、細胞拡散機で懸濁液を広げ、単一コロニーを得た。これらのプレートを37°Cのインキュベーターに移し、一晩インキュベートします。
19. 翌日はコロニーを数え、最初の接種の細菌濃度を計算して実際の接種濃度を決定する。

3. 細胞の感染

注: この時点で、セルは約 90% のコンフルエンシーである必要があります。48ウェルプレート中のHeLa 57A細胞の場合、これはウェル当たり約1 x 10⁵細胞です。細胞は10の感染(MOI)の多重度、または10⁶ cfu/wellに感染します。

1. 各井戸に使用される感染状態に応じてプレートのふたにラベルを付け、各状態を三重にします。
2. 適切な井戸に10°Lの接種を加えます。感染していないコントロールウェルに滅菌LBを10°L加えます。
3. 感染時刻を同期するには、プレートを卓上遠心分離機に置き、5分間500 x gで回転させ、プレートのバランスが取れていることを確認します。
4. 感染した細胞を37°Cで_5%CO2インキュベーターに1時間転写する。
5. 次のステップで使用するために、37°水浴に細胞培養媒体のアリコートを置きます。
6. 感染から1時間後に、水浴から細胞培養媒体を取り出し、70%エタノールで外装を拭きます。組織培養プレートをバイオセーフティキャビネットに移す。
7. 無菌技術を使用して、井戸から媒体を吸引し、新鮮で温かい細胞培養媒体の250 μLに置き換えます。
8. プレートを37°Cで_5%CO2インキュベーターに戻し、さらに4時間を加算します。
9. CO2インキュベーターからプレートを取り出し、井戸から媒体を吸引します。ルシフェラーゼ分析については、ステップ4.1に進みます。RNA 分離については、ステップ 5.1 に進みます。

4. ルシフェラーゼ分析

1. 井戸に1x細胞リシスバッファーの100 μLを追加します。バッファーは、試薬に応じて、最初に作動濃度に希釈する必要があります。
2. プレートを-80°Cの冷凍庫に移し、少なくとも30分間インキュベートして、効率的な細胞リシスを確保します。
3. 凍結セルリサートを含むプレートをベンチに置き、製造業者の推奨事項に従ってルシフェラーゼ基質試薬を解凍し、調製します。
4. ルシフェラーゼ基板試薬が室温に平衡化できるようにします。
5. プレートリーダーの電源を入れ、対応するリーダープログラムを開きます。発光を測定するように機械を設定します。
6. 各サンプルの10°Lを不透明な96ウェルプレートのウェルに移します。
7. 不透明プレートの各ウェルにマルチチャネルピペットを使用して、ルシフェラーゼアッセイ試薬の50°Lを追加します。
8. 側面のプレートを軽くタップして井戸を混ぜ、底面が液体で覆われていることを確認します。プレートリーダーにプレートを入れ、読み取りを開始します。
9. 発光値をスプレッドシート プログラムにコピーし、結果をプロットします。

5. RNAアイソレーション

1. 各ウェルに500μLのグアニジウムチオシアン酸塩を加え、ピペットを数回上下に加え、完全なリシスを確保します。
2. 内容物を標識されたマイクロ遠心管に移します。RNA品質を維持するために、可能な限り氷上のサンプルを維持します。
3. 卓上遠心分離機を4°Cに設定し、この温度で遠心分離機を維持し、プロトコルの残りの部分を維持します。
4. 各サンプルチューブに100μLのクロロホルムを加え、しっかりとキャップし、室温で15sのインキュベートを10分間振ります。
5. 遠心分離機は12,000 x gで4°Cで15分間。この間、新しいチューブを標識してRNA精製の次のステップに備えます。
6. イソプロパノールの250°Lを含む新しいチューブに上部水相を移し、中層または下層を乱さないように注意してください。
7. 未使用の製品は-80°Cの冷凍庫に保管し、タンパク質分析にも使用できます。残留水層は、RNAが後で必要になる場合にバックアップとしても機能する。
8. 水層とイソプロパノールの混合物をボルテックスし、サンプルが10分間室温で座ることを可能にする。
9. 4 °Cで10分間、12,000 x gでサンプルを遠心分離します。
10. 遠心分離機からチューブを取り外します。RNA沈殿物は、チューブの側面および底部に白いペレットを形成する。チューブを開き、廃棄物容器に注ぎ出して慎重に上清を取り除きます。
11. 75%エタノールと渦の500°Lを加えてRNAペレットを洗浄します。
12. 遠心分離機は8,000 x gで、4°Cで5分間。
13. 注ぎ出して上清を取り除き、75%エタノールでペレットを再び洗います。
14. 遠心分離機は8,000 x gで、4°Cで5分間。
15. 小容量ピペット(例えば、10〜200°L容積)を使用して、可能な限り多くの上清を吸引し、液体をチューブに押し戻したり、ピペット先端でペレットを外さないように注意する。ペレットが外れた場合は、遠心分離機を短時間、そして再び上清を取り除こうとします。
    1. RNAペレットを空気乾燥します。サンプルに対してペレットが見える場合は、定期的に(5分ごとに)白からクリアに変化するかどうかを確認し、乾燥していることを示します。ペレットが透明に変わり始めたら、20μLの超純度、RNaseフリーウォーターを加えてRNAを溶解します。
    2. ペレットがサンプルに対して最初に見えなかった場合は、上清を除去してから5分間超純水を加えるだけです。
16. 溶解度を高めるには、ピペットチップを通して溶液を数回渡し、55〜60°Cで10分間インキュベートします。

6. RNAのDNase処理

1. RNA の完全性を維持するには、特に記載がない限り、RNA サンプルを氷上に保存します。このとき、10x DNaseバッファーを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍することができます。
2. すべてのサンプル分析サーフェスをリントフリークロスで洗浄して、サンプル分析用の分光光度計を準備します。
3. 分析の前にバックグラウンド測定を行います。これを行うには、RNAペレットを溶解するために使用される同じ超純水の1.5°Lでセンサーをロードします。[空白の読み取り] ボタンを押して、バックグラウンドの読み取り値を生成します。
4. リントフリークロスを使用して、計測器のサンプルローディングサーフェスを拭きます。各サンプルの読み取りの後にこの手順を繰り返します。
5. 再懸濁RNAの1.5°Lをサンプルホルダーにロードし、[サンプルの読み取り]を選択します。すべてのサンプルが読み取られるまで繰り返します。
6. 1.5 mLマイクロ遠心管に、10x DNaseバッファーの2.4 μLと1μLのDNaseを1サンプルに組み合わせてDNaseマスターミックスを準備します。2 つの余分なボリュームのマスター ミックスを準備します。
7. チューブを数回フリックしてマスターミックスを混ぜます。チューブの底部の内容物を収集するために、チューブを短時間遠心分離します。3.4 μLのマスターミックスを20°LのRNAサンプルに加えます。前と同様に、フリックと遠心分離機で内容を混ぜ合わせます。
8. サンプルを37°Cに設定したヒートブロックに20分間移し、DNase不活性化試薬を冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。
9. ヒートブロックにサンプルを配置した後、20分、作業台に置かれたチューブラックにサンプルを移します。
10. DNase不活性化試薬の内容物を穏やかにボルテックスする。2.6 μLのDNase不活性化試薬をRNAを含むチューブに移し、チューブをフリックして均質な混合物を作成します。
11. 1分間12,000 x gでサンプルを遠心分離します。
12. 慎重に新しいラベル付きチューブに上清をピペット。

7. mRNAからcDNAへの逆転写

1. ピペットによる損失を考慮して、サンプルの量に加えて2つの余分なサンプルに応じてマスターミックスを準備します(表1)。1μgのRNAを使用し、合計50°Lの体積に_H2Oを加えます。

試薬	体積(°L)	最終濃度
MgCl2 (25mM)	3.5	1.75 mM
逆転写バッファー (10x)	5	1x
dNTP ミックス(それぞれ 10 μM)	2.5	500 nm
ランダムヘキサマー(100μM)	1.25	2.5 μM
マルチクライブ逆転写酵素 (50 U/μL)	1	1 U/μL
RNase阻害剤(20 U/μL)	1.25	1.25 U/μL
RNA (1 μg)		20 ng/uL
H2O	トップ最大50

表 1: 逆転写マスターミックスのコンポーネントとレシピ

2. サンプルをしっかりとキャップし、蓋のラベルが後でサーモサイカーの加熱された蓋から取り外され得るとして、側面のPCRチューブにラベルを付けます。渦で混ぜる。
3. PCRチューブを短時間遠心分離し、チューブの底部にサンプルを収集します。
4. PCRチューブをサーモサイカーに入れ、次の設定でサンプルを実行します。
   25 °C 10分、48 °C 30 分、95 °C 5 分、10 °C で保持します。
5. 新たに合成したcDNAを含むチューブを-20°Cの冷凍庫に移すか、qPCR分析ですぐに使用してください。

8. RT-qPCR解析用プレートの準備とローディング

1. 開始する前に、サンプル分析用の 384 ウェル qPCR プレートのセットアップを計画します。
2. 氷の上にプライマーとcDNAを解凍します。
3. マスター ミックスを準備し (表 2を参照)、さらに約 10% 余分にして、ピペットによる損失を考慮します。

試薬	体積(°L)
10 μM F プライマー	1
10 μM R プライマー	1
ウルトラピュア H2O	4
2x SYBR グリーン	10

表 2: qPCR マスターミックスのコンポーネントとレシピ

4. マスターミックスをボルテックスは、リピーターピペットを使用して384ウェルプレートのウェルに8°Lを分配します。サンプルは、プライマーとcDNAサンプルの組み合わせごとに重複して分析されます。
5. P10(またはそれ以下)ピペットを使用して、分析するプライマーセットごとにウェルを複製するためにcDNAの2 μLを転送します。クロス汚染を避けるために、各ウェルの後にチップを交換してください。
6. 表面に粘着フィルムを慎重に塗布してプレートを密封し、すべての井戸が覆われていることを確認します。シールパドルまたはローラーを使用してフィルムを押し、しっかりと密封します。
7. プレートを対心分離機に置き、空のプレートをカウンターバランスとして配置します。プレートを500 x gで5分間遠心分離します。

9. qPCR解析用サーモサイカーの実行

1. コンピュータとリアルタイムPCR機器の電源を入れ子にします。
2. RT-qPCR ソフトウェアを開き、[新しい実験の選択] を選択します。
3. [設定] タブで、[実験のプロパティ]を選択します。
4. [実験名]を定義して、結果の格納に使用するファイル名と設定を設定します。
5. [計測器の選択] で、解析を実行する現在接続されている計測器を選択します。比較 CT (ΔΔCt)実行方法を選択します。
6. 使用する蛍光DNA色素としてSYBRグリーン試薬を選択し、ランプ速度として標準を選択します。
7. [メルト カーブを含める]の横にあるチェックボックスがオンになっていることを確認します。
8. [定義]タブで、ターゲット(すなわち、増幅される遺伝子)とサンプル(すなわち、実験条件)を割り当てます。
9. [割り当て]タブを選択します。
10. [実行方法] を選択します。に示す分析のパラメータを使用します (表 3)。

	ホールドステージ		PCR ステージ		メルトカーブステージ
	ステップ 1	ステップ 2	ステップ 1	ステップ 2	ステップ 1	ステップ 2	ステップ 3
温度	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
時間	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
データ収集				はい			はい
サイクル数	1x		40×		1x

表3:サーモサイカーのサイクルパラメータ

11. サーモサイカーに384ウェルプレートを入れ、解析を開始します。

10. デルタCt法によるqPCR結果の分析(2^-ΔΔCt)

1. qPCR 反応から生成された結果を分析して、下流分析を妨げる可能性のあるエラーがないかどうかを確認します。多くのエラーは、システムによって自動的にフラグが付けられます。
2. 適切に構築されたプライマーの場合、メルトカーブはピークを1つだけ持つ必要があります。複数のピークを持つ溶融曲線を含むウェルを、さらなる解析から除外します。
3. Ct 値をスプレッドシート プログラムにエクスポートし、ΔΔCt メソッドを使用してデータを分析します。推奨される形式が提供されています (表 4)。最後の列は、コントロール サンプルに対するサンプルの折りたたみ式の変更です。

	ハウスキーピング遺伝子 (GAPDH)			関心のある遺伝子 (IL6)
	Ct1	Ct2	アヴェ・Ct	Ct1	Ct2	アヴェ・Ct	ΔCt	Ave ΔCt Ctrls	ΔΔCt	2^-(ΔΔCt)	ジオム
コントロール 1	15.33	15.37	15.35	26.81	26.91	26.86	11.51	10.51	1.00	0.50	1.00
コントロール 2	16.83	16.77	16.80	26.89	26.92	26.91	10.11	10.51	-0.41	1.33
コントロール 3	17.56	17.53	17.54	27.38	27.56	27.47	9.93	10.51	-0.59	1.50
Sl1344 1	15.50	15.41	15.45	22.15	22.13	22.14	6.69	10.51	-3.83	14.21	13.23
SL1344 2	16.02	15.98	16.00	23.01	22.96	22.98	6.98	10.51	-3.53	11.57
SL1344 3	17.27	17.30	17.28	23.99	23.98	23.98	6.70	10.51	-3.82	14.09
sipA ソップB ソプ2 1	15.38	15.41	15.39	23.31	23.09	23.20	7.80	10.51	-2.71	6.56	7.29
sipA ソップB ソプ2 2	16.01	16.05	16.03	23.89	23.92	23.91	7.88	10.51	-2.64	6.23
sipA ソップB ソプ2 3	16.78	16.78	16.78	24.02	24.06	24.04	7.27	10.51	-3.25	9.49
sipA sopB sopE2 ソプ1	15.52	15.60	15.56	27.04	27.03	27.03	11.47	10.51	0.96	0.51	0.79
sipA sopB sopE2 ソプ2	15.56	15.59	15.57	26.37	26.42	26.39	10.82	10.51	0.31	0.81
sipA ソップB ソプ2 ソプ3	15.91	15.92	15.91	26.24	26.12	26.18	10.27	10.51	-0.25	1.19

表 4: qPCR データを分析するための形式。

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結果

ここで説明するアッセイは、HeLa細胞のラインに安定にトランスフェクトされるNF-κB依存性ルシフェラーゼレポーターを用いた転写因子NF-κBの活性化に焦点を当てている。活性化されたNF-κBは、炎症性サイトカインIL6およびIL23を含む標的遺伝子のκB結合部位に結合する核に転移する。NF-κB 活性化の概要を図 1に示します。この研究?...

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ディスカッション

記載されているプロトコルの主な貢献は、細胞内のNF-κB活性化を検出する迅速かつ容易な方法を提供し、NF-κB活性化に影響を与える複数の刺激条件または薬物の高スループット分析を可能にすることです。ここでは、サルモネラ菌感染HeLa細胞におけるNF-κB活性化のためのプロトコルについて説明する。これらの細胞は、他の病原体との感染に使用して、NF-κB活性化に対する細菌感染の...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive film	VWR International	60941-070
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
Ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
Promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate