살모넬라 감염 조직 배양 세포에서 유전자 발현의 NF-θB 의존성 루시퍼라아제 활성화 및 정량화

요약

여기서, 우리는 NF-θB를 발현하는 세포주에서 활성화된 B 세포(NF-θB)의 핵 인자 카파-라이트 체인 인핸서를 빠르고 쉽게 측정하는 프로토콜을 제시한다:루시퍼라아제 리포터 구성, 세포 용해물 내 발광의 측정을 통해. 추가적으로, 유전자 발현은 살모넬라 티피무리움에 감염된 세포로부터 분리된 RT-qPCR을 통해 결정된다.

초록

dimeric 전사 인자 NF-θB는 다양한 사이토카인 및 케모카인의 발현을 유도함으로써 염증 경로를 포함한 많은 세포 반응 경로를 조절한다. NF-θB는 B 세포 억제제, 알파(IθBα)에서 카파광 폴리펩티드 유전자 인핸서의 억제 단백질 핵 인자에 의해 세포졸에서 세포적으로 발현되고 격리된다. NF-θB의 활성화는 IθBα의 분해를 요구하며, 이는 NF-θB에 핵 국소화 신호를 노출시키고 핵으로의 인신매매를 촉진한다. 일단 핵에서, NF-θB는 그들의 발현을 촉진하기 위해 인터류키핀 6(IL-6) 및 IL-23과 같은 NF-θB 표적 유전자의 운동 영역에 결합한다.

NF-θB의 활성화는 전사 또는 번역과 독립적으로 발생합니다. 따라서, NF-θB의 활성화 상태는 핵에서 특별히 NF-θθ를 정량화하거나, NF-θB 표적 유전자의 발현을 정량화함으로써 측정되어야 한다. 이 프로토콜에서, NF-θB로 안정적으로 형질감염된 세포는 시험관내 조직 배양 기술을 사용하여 NF-θB 활성화를 위해 분석된다. 이 세포는 NF-θB를 활성화하기 위하여 살모넬라 티피무륨에 감염되고, 이는 핵으로 트래픽및 루시퍼라아제라아제의 프로모터 지구에 있는 θB 사이트에 결합하여, 그것의 발현을 유도합니다. 세포는 루시퍼라아제 분석 시스템으로 분석하고 분석한다. 세포에 의해 생성된 루시퍼라아제의 양은 플레이트 리더에 의해 검출되는 발광 신호의 강도와 상관관계가 있습니다. 이 절차에 의해 생성된 발광 신호는 다양한 조건 하에서 NF-θB 활성화를 평가하는 빠르고 매우 민감한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 발현을 나타내는 상대적인 mRNA 수준을 검출하기 위해 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)을 이용한다.

서문

단백질의 핵 인자-θB (NF-θB) 가족은 다양한 생물학적 경로에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 전사 활성제이다. NF-θB의 활성화는 표적 유전자의 전사를 유도하며, 그 중 많은 것이 면역 및 염증 반응, 세포 증식, 스트레스 반응 및 암^진행에중요하다^1,2. NF-θB는 병원체 클리어런스를 위한 초기 염증 결과를 중재하는 데 필수적인 역할을 합니다. NF-θB 활성화에 의해 매개되는 많은 생물학적 과정을 감안할 때, 신호의 중단은 건강과 질병에 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. NF-θB 신호에 있는 기능 돌연변이의 손실은 몇몇 면역 결핍 표현형에서 연관되는 반면, 기능 돌연변이의 이득은 B 세포 림프종 및 유방암을 포함하여 암의 몇몇 모형과 연관됩니다^3. 부가적으로, 많은 병원체는독성 인자^4,5,6,7의발현을 통해 NF-θ의 활성화 상태를 직접 조절하는 것으로 나타났다.

NF-θB의 활성화는 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)으로 알려진 리포폴리사카라이드(LPS), 플래그엘린 및 펩티도글리칸과 같은 세균성 제품을 포함한 많은 가변 자극의 결과인 것으로 알려져 있다. 이러한 PAMPs는 NF-θB의 활성화및 NF-θB 의존성 염증 유전자의 어레이의 후속 발현을 유도하는 톨-유사 수용체(TL) 및 Nod-like 수용체(LRS)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 검출된다^8. PAMPs에 의한 PRR 활성화 이외에, 세균 효과 단백질과 같은 다른 세균성 제품은, NF-θB의 활성화를 유도할 수 있다. 흥미롭게도, 박테리아는 또한 NF-θ 통로를 능동적으로 감쇠시키고 그들의 병원성을 향상시키는 이펙터 단백질을 발현하며, 면역의 필수적인 중재자로서 NF-θB의 중요성을^{강조한다 9.}

NF-θB 이dim을 형성하는 5개의 다른 하위 단위가 있습니다; p50, p52, RelA (p65), RelB 및 cRel. 두 가지 주요 NF-θB 헤테로디머는 p50:RelA 및 p52:RelB 이형제입니다. 활성화된 NF-θB 디이머는 다양한 표적 유전자의 프로모터 및 인핸서 영역에서 σB 부위로 알려진 DNA 부위에 결합한다. 정상적인 동압 조건하에서, NF-θB는 IθB 단백질로 알려진 억제제 단백질의 가족과 상호 작용하여 비활성 상태를 유지합니다. 자극시, IθB는 IθB 키나아제(IKK)에 의해 인산화되어 유비퀴틴화를 표적으로 하고, 이어서 분해할 수 있게 한다. IθB의 분해는 핵 국소화 신호를 밝혀 NF-θB를 활성화한다. NF-θB는 그 후 핵으로 옮겨, 여기서 표적 유전자의 프로모터 영역에서 σB 부위를 결합시키고 전사^10을촉진한다. 따라서, NF-θB의 활성화는 NF-θB 표적 유전자의 mRNA 발현을 상향 조절하며, 이러한 변화는 RT-qPCR^11과같은 RNA 정량화 분석제를 통해 측정될 수 있다.

몇몇 방법은 존재하고 일반적으로 전기 영동 이동성 이동 분석법 (EMSA), 핵 전좌 및 유전자 리포터 분석법을 포함하여 NF-θB 활성화의 측정을 위해 이용됩니다. EMSA는 핵산이 있는 단백질 복합체를 검출하는 데 사용됩니다. 자극된 세포는 전좌된 NF-θ를 포함하는 핵 단백질을 분리하기 위해 분획되고, 이어서 NF-θB 결합 도메인을 포함하는 방사성 표지된 뉴클레오티드로 배양된다. 견본은 젤에 실행되고 ³²P 표지한 핵산의 자기 방사선 촬영에 의해 심상됩니다. NF-θB가 단백질 분획에 존재하는 경우, 뉴클레오티드를 결합시킬 것이며, 이는 겔을 통해 느리게 이동하고 이산 밴드로서 존재할 것이다. 활성 NF-θB(예를 들어, 비자극된 대조군 세포)가 결여된 세포의 핵 분획은 뉴클레오티드가 겔의 끝으로 더 빨리 이동함에 따라 아무밴드도 생성되지 않을 것이다. 이 방법의 주요 단점은 이진 의미에서 크게 정량적이며 NF-θB 결합 용량에서 의미 있는 차이를 적절히 포착하지 못한다는 것입니다. 부가적으로, 이 방법은 NF-θB 표적 유전자^12,13에대해 기능적으로 중요한 염색질 구조를 고려하지 않는다.

이전 방법과 유사하게, 다중 웰 플레이트가 NF-θB 결합 서열을 함유하는 뉴클레오티드로 코팅되는 "비시프트" 분석법이 있다. 단백질의 핵 분획으로 세포의 처리 후, NF-θB는 웰에 결합된 뉴클레오티드에 결합할 것이다. 항-NF-θB 항체가 추가되고, 이는 결합된 NF-θB와 상호 작용하고 NF-θB의 양에 비례하는 색색 신호를 생성하며, 이는 NF-θB 활성화의 정도를 나타낸다. 이 방법은 방사성 표지된 핵산을 필요로 하지 않으며 정량적이라는 점에서 EMSA에 비해 유리하다. 그러나, 이 방법의 주의사항은 NF-θB 표적 유전자^14의염색질 상태를 다시 분화하지 않는다는 것이다.

NF-θB 활성화가 검출될 수 있는 또 다른 방법은 크로마틴 면역침전(ChIP)에 의해, DNA 및 상호 작용 단백질이 포름알데히드와 가교되고 특정 항-NF-θB 항체와 면역침전된다. 특정 뉴클레오티드 단편은 PCR 증폭 또는 직접 높은 처리량 시퀀싱을 통해 정제되고 식별됩니다. 이 방법으로부터 생성된 결과는 표적 유전자와 NF-θB 결합 활성의 반정량적 결과를 제공한다. 그러나, 결과는 각^{단계(15)에서}고정 조건 및 정제 공정에 크게 의존한다.

핵 전좌 검역 실험에서, 세포는 NF-θB 활성화를 유도하기 위하여 자극되고 그 후 고정됩니다. 항-p65 항체는 고정 된 세포에 추가됩니다. 대안적으로, p65 소단위 자체는 녹색 형광녹색(GFP)과 같은 형광 펩티드로 태그될 수 있다. 두 경우 모두, 면역형광은 p65의 국소화영상을 허용하여 세포 분포를 결정할 것이다. 세포질 및 핵 국소화 단백질의 비율을 측정함으로써, 조사자들은 NF-θB의 상대적 활성화 상태를 결정할 수 있다. 이 방법의 단점은 면역형광이 비교적 시간이 많이 걸리고, 고가의 항체가 필요하며, 상대적으로 더 큰 기술적 전문지식이 필요하다는 것이다^16.

리포터 유전자는 관심 있는 유전자의 조절 및 발현 패턴을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 도구입니다. 전형적으로, 리포터 유전자는 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 유전자에 융합된 관심 있는 유전자의 프로모터 서열로부터 구성된다. 효소 활동, 형광 또는 발광 특성을 가진 단백질은 일반적으로 분석 및 정량화될 수 있는 그들의 능력을 위해 선택됩니다. 따라서, 판독(예를 들어, 발광, 형광)은 유전자 발현의 검출을 위한 신호로서 역할을 한다. 이러한 리포터 구조는 상피 세포 또는 대식세포와 같은 상체 세포 유형으로 도입될 수 있다.

본 프로토콜에 기재된 클론된 HeLa 세포주(HeLa 57A)는 면역글로불린 σ-chain 프로모터^{영역(17)의}3개의 θB 컨센서스의 3개의 사본을 포함하는 루시퍼라제 리포터로 안정적으로 형질이 나는 것을 사용한다. 루시퍼라아제의 발현은 세포 자극 다음에 발생하는 NF-θB의 활성화에 의존한다. 자극된 세포는 루시퍼라아제 분석 키트에 제공된 세포 용해 완충제를 사용하여 용이하게 용해된다. 세포 포액의 부분은 루시페린을 포함하는 루시페라아제 분석 버퍼와 혼합됩니다. 루시펠린은 루시퍼라아제의 기질이며 루시퍼라아제의 존재 시 빛의 생성에 필요합니다. 분석 버퍼와 용해액을 결합한 후, 용액은 발광으로 알려진 공정에서 빛을 방출합니다. 루멘으로 생성되는 빛의 양은 용해액에 존재하는 루시퍼라아제의 양에 비례하며 NF-θB 활성화의 척도로서 작용한다. 루멘 판독값은 기준선 NF-θB 활성을 고려하기 위해 비자극표준과 비교하여 해석되며, 신호 자체는 신뢰할 수 있는 측정을 위해 몇 분 동안 안정되어 있다. 또한, HeLa 57A 세포주들은 NF-ΘB-독립적인 β-갈락토시다아제 리포터로 안정적으로 형질감염된다. β-갈락토시다아제 리포터는 구성적으로 발현되고, β-갈락토시다아제 활성은 세포 생존성 또는 세포 수의 변이를 조절하기 위해 측정될 수 있다^17. 루시퍼라제 값은 β-갈락토시다아제 값으로 조정될 수 있고 자극되지 않은 대조군 세포에 비해 배 증가가 보고될 수 있다.

NF-θB는 NF-θB-의존성 표적 유전자의 증가된 발현을 담당하는 전사 인자이기 때문에, NF-θB-의존성 증가유전자 발현을 조절하기 위한 후속 실험은 정량적 역전사 중합체 연쇄 반응( RT-qPCR)을 참조하십시오. RT-qPCR은 유전자 발현의 변화가 여러 계급의 크기에 걸쳐 정량화될 수 있는 매우 민감한 방법이다. 자극 및 제어 세포는 페놀 클로로포름 추출을 통해 RNA를 위해 수확됩니다. 상 분리 후, RNA는 수성 층의 주요 성분으로서 추출된다. RNA는 순수한 펠릿을 생성하기 위해 침전되고 세척됩니다. 이 펠릿은 DNase 치료를 통해 오염 DNA를 재구성하고 추가로 청소합니다. 순수한 RNA는 그 때 상보적인 DNA (cDNA)를 만들기 위하여 역으로 전사됩니다. 이 cDNA는 그 때 특정 mRNA 순서의 풍부가 유전자 발현을 결정하기 위하여 정량화되는 양적 PCR 기술을 통해 분석될 수 있습니다. 이 기술은 번역 제어, 사후 번역 수정, 단백질 풍부 또는 단백질 활성을 설명하지 않습니다. 그러나, 많은 유전자, 특히 프로 염증 과정에 관여하는 유전자는 NF-θB를 통해 조절되고 그들의 mRNA 풍부는 그들의 발현을 나타냅니다.

여기서 제안된 방법은 세포 용해물의 발광 검술을 통해 NF-θB 활성화가 검출될 수 있는 빠르고 간단한 방법을 이용한다. NF-θB 표적 유전자 발현의 RT-qPCR은 특정 유전자의 발현을 정량화하고, NF-θB 활성화의 기능적 활성을 검증하는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 주요 장점은 NF-θB 활성화를 조절하는 다양한 조건의 높은 처리량 스크리닝을 허용하는 단순성과 속도입니다. 이 프로토콜은 NF-θB::luciferase 리포터를 발현하는 다른 세포주에 적합하며, 안정적으로 형질감염된 RAW264.7^{세포(18)에서}입증되었다. 세포 용해에서 발광 신호 생성에 이르기까지 샘플을 처리하는 데 필요한 시간은 최소화되고 약 1 시간의 기간이 소요됩니다. NF-θB의 측정에는 불투명 플레이트, 발광을 측정할 수 있는 플레이트 리더, 스프레드시트 프로그램과 같은 간단한 데이터 분석 소프트웨어와 같은 기본적인 실험실 장비만 필요합니다.

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프로토콜

1. 세포 통과 및 파종

1. 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 독수리 매체(DMEM)의 10 mL를 함유하는 75 cm² 플라스크에서 HeLa 57A 세포를 유지합니다.
2. 흡기 세포 배양 배지및 0.05% 트립신-EDTA 용액의 1 mL로 세척한다. 트립신을 흡인하고 추가로 1 mL로 교체하십시오. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 4-5분 동안 놓고 세포가 플라스크에서 분리되도록 합니다.
3. 9 mL의 세포 배양 배지를 추가하고 플라스크의 바닥을 몇 번 부드럽게 씻어 세포를 빼내고 균일 한 현탁액을 형성합니다.
4. HeLa 57A 세포를 신선한 매체에 1:6 또는 1:8로 희석시키고 씨앗을 새 플라스크에 넣습니다. 통로 세포는 90% confluent 또는 매 3 일마다 및 최소 25% conflue에서 세포를 유지할 때.
5. 세포 자극 하루 전에, HeLa 57A 세포를 시도하고 성장 매체의 10 mL에서 중단. 혈세포계를 사용하여 현탁액의 세포를 카운트하고 성장 매체를 사용하여 50 mL 원엽 튜브에서 2.5 x 10⁵ 세포 /mL의 최종 농도로 세포를 희석시다.
6. 250 μL의 세포 현탁액(~6.25 x 10^{4 세포)을} 48웰 플레이트의 각 웰에 전달한다. 원금 튜브를 주기적으로 캡하고 뒤집어 균일 한 세포 현탁액을 보장합니다. 측면에 있는 플레이트를 부드럽게 탭하여 세포가 우물에 균일하게 분배되도록 합니다.
7. 플레이트를 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C로 옮기고 세포가 하룻밤 사이에 부착및 성장할 수 있도록 합니다.

2. 박테리아의 준비

1. 감염 이틀 전에, 단일 식민지를 생산하기 위해 LB 한천 접시에 살모넬라의 줄무늬 냉동 주식. 플레이트를 37°C로 설정된 인큐베이터로 옮기고 밤새 성장을 허용한다.
2. 감염 하루 전에, 멸균 세균 배양 튜브에 리소제니 국물 (LB)의 3 mL를 추가하고, 매체에 적절한 항생제를 추가하십시오.
3. 멸균 접종 루프를 사용하여 줄무늬 세균 배양에서 단일 콜로니를 선택하고 LB 미디어에 루프를 터치합니다. 접종 후 튜브를 캡하고 루프를 폐기하십시오.
4. 튜브를 37°C, 180 rpm으로 설정된 흔들리는 인큐베이터에 놓고, 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 한다.
5. 감염 당일, 인큐베이터에서 하룻밤 세균 배양을 검색합니다.
6. 적절한 경우 항생제를 포함하는 신선한 LB의 3 mL를 추가하여 하위 배양을위한 튜브를 준비하십시오.
7. 밤새 세균 배양액의 30 μL(1/100 희석)을 갓 제조된 배지로 이송한다. 튜브를 37°C에서 3시간 동안 설정된 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
8. 3 시간 배양 후, 1 mL의 멸균 LB 국물을 플라스틱 큐벳에 옮겨 블랭크로 한다. 900 μL의 LB를 샘플 분석에 사용할 다른 큐벳으로 이송합니다.
9. 세균 계류의 100 μL을 LB 및 파이펫의 900 μL을 함유하는 큐벳에 여러 번 섞어 옮김을 옮김. 각 세균 현탁액에 대해 이 것을 반복합니다.
10. 분광광도계를 켜서 600 nm(OD_600)의파장에서 세균 배양물의 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
11. 분광광도계에 공백을 놓습니다. 방향을 적어 두십시오.
12. 뚜껑을 닫고 분광광도계의 빈 버튼을 눌러 배경 흡수를 가져옵니다.
13. 빈 큐벳을 동일한 방향으로 샘플 큐벳으로 바꾸고 Read를누릅니다.
14. 이러한 샘플의 OD₆₀₀ 값을 기록합니다. 희석 계수를 고려하여 값을 10으로 곱합니다.
15. 박테리아 하위 배양을 신선한 LB로 희석하여 대략 1 x 10⁹ cfu/mL에 해당하는 약 1.0의 흡광도 값을 달성합니다. 이 현탁액을 큐벳에 1:10 희석하고 흡광도를 측정하여 ~ 0.1의 값을 부여합니다.
16. 새로운 튜브에서, 접종으로 사용되는 1 x 10⁸ cfu/mL의 현탁액을 달성하기 위해 희석 된 하위 배양의 적절한 볼륨을 신선한 LB에 추가합니다.
17. 약 10² cfu/mL의 최종 희석이 이루어질 때까지 450 μL의 멸균 PBS(10배 희석)를 함유하는 튜브로 50 μL의 세균 현탁액을 이송하여 접종물의 연속 희석을 준비합니다.
18. 2개의 가장 낮은 희석물(각각 10 및 100 콜로니 형성 단위에 대응하는 10² 및 10^3)의 100 μL을 LB 한천 플레이트에 전달하고 세포 스프레더로 현탁액을 확산하여 단일 콜로니를 얻었다. 이들 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮기고 밤새 인큐베이팅한다.
19. 다음 날 콜로니를 계산하고 초기 접종의 세균 농도를 계산하여 실제 접종 농도를 결정합니다.

3. 세포의 감염

참고 : 이 시점에서, 세포는 약 90 % 합류에 있어야합니다. 48 웰 플레이트에서 HeLa 57A 세포의 경우, 이것은 잘 당 약 1 x 10⁵ 세포입니다. 세포는 10의 감염 (MOI) 또는 10⁶ cfu /well의 복합성에 감염될 것입니다.

1. 각 우물에 대해 사용될 감염 조건에 따라 플레이트 뚜껑에 라벨을 붙이면 각 상태가 삼중으로 수행됩니다.
2. 적절한 웰에 접종10 μL을 추가합니다. 감염되지 않은 제어 웰에 멸균 LB 10 μL을 추가합니다.
3. 감염 시간을 동기화하려면 플레이트를 탁상 원심분리기에 놓고 5분 동안 500 x g으로 회전하여 플레이트가 균형을 이루도록 합니다.
4. 감염된 세포를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터로 1시간 동안 이송한다.
5. 다음 단계에서 사용하기 위해 37°C 수조에 세포 배양 배지의 aliquot를 놓습니다.
6. 감염 후 1 시간, 수조에서 세포 배양 매체를 제거하고 70 % 에탄올로 외관을 닦으하십시오. 생체 안전 성 캐비닛에 조직 배양 판을 전송합니다.
7. 멸균 기술을 사용하여 우물에서 배지를 흡인하고 250 μL의 신선하고 따뜻한 세포 배양 매체로 대체하십시오.
8. 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터로 돌려 보내 4시간 동안 추가로.
9. _CO2 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 매체를 흡인합니다. 루시퍼라제 분석의 경우 4.1단계를 계속합니다. RNA 격리의 경우 5.1단계로 진행한다.

4. 루시퍼라제 분석

1. 웰에 100 μL의 1x 셀 리시스 버퍼를 추가합니다. 버퍼는 시약에 따라 먼저 작동 농도로 희석되어야 할 수도 있습니다.
2. 플레이트를 -80°C 냉동고로 옮기고 효율적인 세포 용해를 보장하기 위해 적어도 30분 동안 배양합니다.
3. 냉동 셀 이 함유 된 플레이트를 벤치에 놓고 제조업체권장 사항에 따라 루시퍼라제 기판 시약을 해동하고 준비하십시오.
4. 루시퍼라제 기판 시약이 실온과 평형되도록 하십시오.
5. 플레이트 판독기를 켜고 해당 판독기 프로그램을 엽니다. 기계가 발광을 측정하도록 설정합니다.
6. 각 시료의 10 μL을 불투명한 96웰 플레이트의 웰로 옮김.
7. 불투명 플레이트의 각 웰에 멀티채널 파이펫을 사용하여 루시퍼라제 분석 시약 50 μL을 추가합니다.
8. 측면의 플레이트를 부드럽게 두드려 우물을 섞고 바닥면이 액체로 덮여 있는지 확인합니다. 접시를 접시 판독기에 놓고 읽기를 시작합니다.
9. 발광 값을 스프레드시트 프로그램에 복사하고 결과를 플로팅합니다.

5. RNA 격리

1. 500 μL의 구니듐 티오차네이트를 각 우물에 추가하고 완전한 분해를 보장하기 위해 여러 번 위아래로 피펫을 추가하십시오.
2. 내용물 표지된 미세원심지 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 RNA 품질을 유지하기 위해 가능한 한 얼음에 샘플을 유지합니다.
3. 탁상 원심분리기를 4°C로 설정하고 이 온도에서 원심분리기를 유지하여 나머지 프로토콜을 유지합니다.
4. 각 샘플 튜브에 100 μL의 클로로폼을 넣고 뚜껑을 단단히 닫고 실온에서 10 분 동안 15 초 동안 흔들어줍니다.
5. 12,000 x g에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기. 이 시간 동안, 새로운 튜브를 라벨링하여 RNA 정제의 다음 단계를 준비하십시오.
6. 상부 수성 상을 이소프로판올 250 μL을 함유하는 새로운 튜브로 옮기고 중간 또는 하부 층을 방해하지 않도록 주의하십시오.
7. 사용하지 않은 제품을 -80°C 냉동고에 보관하여 단백질 분석에 사용할 수도 있습니다. 잔류 수성 층은 또한 RNA가 나중에 필요한 경우에 백업으로 봉사할 수 있습니다.
8. 수성 층과 이소프로판올의 혼합물을 소용돌이시키고 샘플이 실온에서 10 분 동안 앉을 수 있게 합니다.
9. 4 °C에서 10 분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심 분리합니다.
10. 원심분리기에서 튜브를 제거합니다. RNA 침전제는 관의 측과 바닥에 백색 펠릿을 형성합니다. 튜브를 열고 조심스럽게 폐기물 용기에 부어 상류를 제거합니다.
11. 75% 에탄올 및 와류의 500 μL을 첨가하여 RNA 펠릿을 세척하였다.
12. 8,000 x g의 원심분리기4°C에서 5분 동안.
13. 75% 에탄올로 펠릿을 다시 붓고 상류를 제거합니다.
14. 8,000 x g의 원심분리기4°C에서 5분 동안.
15. 소량의 파이펫(예: 10-200 μL 부피)을 사용하여 가능한 한 많은 상판을 흡인하고, 액체를 튜브안으로 다시 밀어 넣거나 파이펫 팁으로 펠릿을 빼내지 않도록 주의하십시오. 펠릿이 빠지면 원심 분리기를 잠시 후 다시 상류를 제거하십시오.
    1. RNA 펠릿을 공기 건조시. 펠릿이 모든 샘플에 대해 보이는 경우 주기적으로 (5분마다) 흰색에서 투명으로 바뀌는지 확인하여 건조하다는 것을 나타냅니다. 펠릿이 선명하게 변하기 시작하면, 20 μL의 초순수, RNase 자유물을 추가하여 RNA를 용해시웁습니다.
    2. 펠릿이 처음에 어떤 샘플에 대해보이지 않았다면, 상급물을 제거한 후 5분 후에 초순수를 추가하기만 하면 됩니다.
16. 용해도를 높이기 위해 파이펫 팁을 통해 용액을 몇 번 전달하고 55-60 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.

6. RNA의 DNase 처리

1. RNA 무결성을 유지하기 위해 달리 언급되지 않는 한 RNA 샘플을 얼음 위에 저장하십시오. 이때, 10x DNase 버퍼는 냉동고에서 제거되어 얼음위에서 해동될 수 있다.
2. 보풀이 없는 천으로 모든 시료 분석 표면을 청소하여 시료 분석을 위한 분광광도계를 준비합니다.
3. 분석 전에 배경 측정을 수행합니다. 이렇게 하려면 센서에 RNA 펠릿을 용해하는 데 사용되는 것과 동일한 초순수 1.5 μL로 로드하십시오. 빈 읽기 버튼을 눌러 배경 판독값을 생성합니다.
4. 보풀 없는 천을 사용하여 기기의 샘플 로딩 표면을 닦아냅니다. 각 샘플 판독 후 이 단계를 반복합니다.
5. 재중단된 RNA의 1.5 μL을 샘플 홀더에 로드하고 샘플 읽기를선택합니다. 모든 샘플을 읽을 때까지 반복합니다.
6. 1.5 mL 의 미세 원심 분리튜브에 샘플당 2.4 μL의 DNase 버퍼와 1 μL의 DNase를 결합하여 DNase 마스터 믹스를 준비합니다. 두 개의 추가 볼륨에 대한 마스터 믹스를 준비합니다.
7. 튜브를 여러 번 가볍게 하여 마스터 믹스를 섞는다. 튜브의 바닥에 내용물 수집튜브를 간략하게 원심분리합니다. RNA 샘플의 20 μL에 마스터믹스 3.4 μL을 추가합니다. 이전과 같이 간략하게 플릭과 원심 분리기를 통해 내용을 혼합합니다.
8. 샘플을 37°C에서 20분 동안 설정된 열 블록으로 옮기십시오.
9. 열 블록에 샘플을 놓은 후 20 분, 작업 대에 배치 튜브 랙에 샘플을 전송합니다.
10. DNase 불활성화 시약의 내용물 등을 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 2.6 μL의 DNase 불활성화 시약을 RNA를 함유하는 튜브로 옮은 다음 튜브를 쓸어 내고 균일한 혼합물을 생성한다.
11. 1분 동안 12,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
12. 조심스럽게 새로운, 라벨 튜브에 상급 피펫.

7. cDNA에 mRNA의 역전사

1. 파이펫팅을 통한 손실을 고려하여 샘플의 양과 2개의 추가량에 따라 마스터 믹스를 준비합니다(표1). 1 μg의 RNA를 사용하고 총 50 μL의 부피에 H₂O를 추가하십시오.

시약	볼륨(μl)	최종 농도
MgCl2 (25mM)	3.5	1.75 mM
역전사 버퍼(10x)	5	1x
dNTP 믹스 (각각 10 μM, 각)	2.5	500 nm
랜덤 헥서머 (100 μM)	1.25	2.5 μM
다중 스크라이브 역 전사체 (50 U / μL)	1	1 U/μL
RNase 억제제 (20 U /μL)	1.25	1.25 U/μL
RNA (1 μg)		20 ng/uL
H2O	최대 50개

표 1: 역전사 마스터 믹스를 위한 성분 및 레시피.

2. 샘플을 단단히 캡하고 뚜껑의 라벨이 나중에 열사이클러의 가열 된 뚜껑에서 제거 될 수 있기 때문에 PCR 튜브를 측면에 레이블로 지정하십시오. 소용돌이로 섞으세요.
3. PCR 튜브를 간단히 원심분리하여 튜브 바닥에 샘플을 수집합니다.
4. PCR 튜브를 열전자전거에 놓고 다음 설정으로 샘플을 실행합니다.
   25°C에서 10분, 30분 동안 48°C, 95°C에서 5분 동안, 10°C에서 유지한다.
5. 새로 합성된 cDNA를 함유하는 튜브를 -20°C 냉동고로 옮기거나 qPCR 분석에 즉시 사용한다.

8. RT-qPCR 분석을 위한 플레이트 준비 및 로딩

1. 시료 분석을 위해 384웰 qPCR 플레이트의 설정을 시작하기 전에 계획하십시오.
2. 얼음에 프라이머와 cDNA를 해동.
3. 파이펫팅을 통한 손실을 고려하여 마스터 믹스(표 2참조)와 약 10%의 추가 를 준비합니다.

시약	볼륨(μl)
10 μM F 프라이머	1
10 μM R 프라이머	1
울트라 퓨어 H2O	4
2x SYBR 그린	10

표 2: qPCR 마스터 믹스를 위한 구성 요소 및 레시피.

4. 마스터 믹스를 소용돌이로 하여 8 μL을 리피터 피펫을 사용하여 384웰 플레이트의 웰에 분배한다. 샘플은 각 프라이머 및 cDNA 샘플 조합에 대해 중복으로 분석됩니다.
5. P10(또는 더 작은) 파이펫을 사용하여 분석할 각 프라이머 세트에 대해 2 μL의 cDNA를 복제하여 복제합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 각 우물 후 팁을 교체하십시오.
6. 접착제 필름을 표면에 조심스럽게 도서하여 플레이트를 밀봉하여 모든 웰이 덮여 있는지 확인합니다. 밀봉 패들 또는 롤러를 사용하여 필름을 눌러 단단히 밀봉합니다.
7. 접시를 원심분리기에 놓고 빈 접시를 카운터밸런스로 놓습니다. 500 x g에서 5 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다.

9. qPCR 분석을 위한 써모사이클러 실행

1. 컴퓨터 및 실시간 PCR 기기의 전원을 공급합니다.
2. RT-qPCR 소프트웨어를 열고 새 실험을선택합니다.
3. 설치 탭에서 실행 매개변수를 설정할 수 있는 실험 속성(실험 속성)을선택합니다.
4. 결과를 저장하는 데 사용되는 파일 이름과 설정을 설정하는 실험 이름을정의합니다.
5. 계측기 선택을위해 해석을 실행할 현재 연결된 계측기를 선택합니다. 비교 CT(ΔΔCt) 실행 방법을 선택합니다.
6. SYBR 그린 시약을 용광성 DNA 염료로 선택하고 램프 속도로 표준으로 선택합니다.
7. 용융 곡선 포함 옆의 상자가 선택되어 있는지 확인합니다.
8. 정의 탭에서 대상(즉, 증폭될 유전자) 및 샘플(즉, 실험 조건)을 할당합니다.
9. 할당 탭을 선택합니다. 384웰 플레이트의 로딩 방식에 해당하므로 적절한 대상 및 샘플로 웰에 레이블을 지정합니다.
10. 실행 메서드를 선택합니다. (표3)에나열된 분석에 매개변수를 사용합니다.

	홀드 스테이지		PCR 스테이지		용융 곡선 단계
	1단계	2단계	1단계	2단계	1단계	2단계	3단계
임시	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
시간	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
데이터 수집				예			예
사이클 수	1x		40x		1x

표 3: 열순환기용 사이클 파라미터.

11. 384웰 플레이트를 열전자전거에 놓고 분석을 시작합니다.

10. 델타 델타 Ct 방법으로 qPCR 결과 분석 (2^-ΔΔCt)

1. 다운스트림 분석을 방해할 수 있는 오류에 대해 qPCR 반응에서 생성된 결과를 분석합니다. 많은 오류는 시스템에 의해 자동으로 플래그가 지정됩니다.
2. 적절하게 구성된 프라이머의 경우 용융 곡선에는 피크가 하나만 있어야 합니다. 추가 분석에서 피크가 두 개 이상인 용융 곡선이 포함된 유정을 제외합니다.
3. Ct 값을 스프레드시트 프로그램으로 내보내 ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터를 분석합니다. 제안된 형식이제공됩니다(표 4). 마지막 열은 컨트롤 샘플을 기준으로 샘플의 접기 식 변경입니다.

	하우스키핑 유전자(GAPDH)			관심 유전자(IL6)
	Ct1	Ct2	Ave Ct	Ct1	Ct2	Ave Ct	ΔCt	Ave ΔCt ctrls	ΔΔCt	2^-(ΔΔCt)	지오마(Geomean)
제어 1	15.33	15.37	15.35	26.81	26.91	26.86	11.51	10.51	1.00	0.50	1.00
제어 2	16.83	16.77	16.80	26.89	26.92	26.91	10.11	10.51	-0.41	1.33
제어 3	17.56	17.53	17.54	27.38	27.56	27.47	9.93	10.51	-0.59	1.50
Sl1344 1	15.50	15.41	15.45	22.15	22.13	22.14	6.69	10.51	-3.83	14.21	13.23
SL1344 2	16.02	15.98	16.00	23.01	22.96	22.98	6.98	10.51	-3.53	11.57
SL1344 3	17.27	17.30	17.28	23.99	23.98	23.98	6.70	10.51	-3.82	14.09
sipA sopB sopE2 1	15.38	15.41	15.39	23.31	23.09	23.20	7.80	10.51	-2.71	6.56	7.29
sipA sopB sopE2 2	16.01	16.05	16.03	23.89	23.92	23.91	7.88	10.51	-2.64	6.23
sipA sopB sopE2 3	16.78	16.78	16.78	24.02	24.06	24.04	7.27	10.51	-3.25	9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1	15.52	15.60	15.56	27.04	27.03	27.03	11.47	10.51	0.96	0.51	0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2	15.56	15.59	15.57	26.37	26.42	26.39	10.82	10.51	0.31	0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3	15.91	15.92	15.91	26.24	26.12	26.18	10.27	10.51	-0.25	1.19

표 4: qPCR 데이터를 분석하기 위한 형식입니다.

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결과

여기서 설명된 분석은 HeLa 세포의 라인으로 안정적으로 형질이 되는 NF-θB 의존성 루시퍼라제 리포터를 사용하여 전사 인자 NF-θB의 활성화에 초점을 맞추고 있다. 활성화된 NF-θB는 단백질 염증성 사이토카인 IL6 및 IL23을포함하는 표적 유전자의 σB 결합 부위를 결합하는 핵으로 전이한다. NF-θB 활성화에 대한 일반적인 개요는 그림 1에설?...

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토론

설명된 프로토콜의 주요 기여는 세포에서 NF-θB 활성화를 검출하는 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 이는 NF-θB 활성화에 영향을 미치는 다중 자극 조건 또는 약물의 높은 처리량 분석을 허용한다는 것입니다. 여기서, 우리는 살모넬라-감염된HeLa 세포에서 NF-θB 활성화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 세포는 NF-θB 활성화에 세균성 감염의 충격을 공부하기 위하여 뿐만 아니라 그밖 병원체를 가...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive film	VWR International	60941-070
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
Ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
Promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate