استخدام غشاء Chorioallantoic الدجاج في نموذج Vivo لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية

Summary

نقدم نموذج غشاء chorioallantoic الدجاج كبديل، قابل للزرع، في نموذج الجسم الحي لتطعيم خطوط خلايا سرطان النساء والمسالك البولية والأورام المشتقة من المريض.

Abstract

نماذج الماوس هي الاختبارات القياسية في دراسات السرطان في الجسم الحي. ومع ذلك، أدت التكلفة والوقت والاعتبارات الأخلاقية إلى دعوات لبديل في نماذج السرطان في الجسم الحي. يوفر نموذج غشاء الدجاج (CAM) بديلًا سريعًا وغير مكلف يسمح بالتصور المباشر لتطور الورم ومناسب للتصوير في الجسم الحي. على هذا النحو، سعينا لتطوير بروتوكول الأمثل لتطعيم الأورام النسائية والمسالك البولية في هذا النموذج، الذي نقدم هنا. ما يقرب من 7 أيام بعد الإخصاب ، يتم نقل خلية الهواء إلى الجانب الوعائي من البيض ، حيث يتم إنشاء فتحة في القشرة. ثم يمكن أن الأورام من المورين وخطوط الخلايا البشرية والأنسجة الأولية أن تتطعيم. وعادة ما تزرع هذه في خليط من مصفوفة خارج الخلية والمتوسطة لتجنب التشتت الخلوي وتوفير الدعم الغذائي حتى الخلايا تجنيد إمدادات الأوعية الدموية. قد تنمو الأورام بعد ذلك لمدة تصل إلى 14 يومًا إضافيًا قبل تفقيس البيض. من خلال زرع الخلايا المنقولة بشكل ثابت مع لوسيفيراز اليراعة ، يمكن استخدام التصوير الحيوي للكشف الحساس عن نمو الورم على الغشاء والخلايا السرطانية المنتشرة في جميع أنحاء الجنين. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الورم والغزو والانبثاث والفعالية العلاجية. نموذج CAM الدجاج يتطلب وقتا أقل بكثير والموارد المالية بالمقارنة مع نماذج المورين التقليدية. نظرًا لأن البويضات لا تُحصى المناعة وتتسم بالمناعة، فمن المحتمل أن يتم زرع الأنسجة من أي كائن حي دون الحيوانات المعدلة وراثياً المكلفة (مثل الفئران) اللازمة لزرع الأنسجة البشرية. ومع ذلك، فإن العديد من مزايا هذا النموذج يمكن أن تكون أيضا القيود، بما في ذلك وقت توليد الورم القصير وحالة مناعة/مناعة متسامحة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن جميع أنواع الأورام المعروضة هنا في engraft نموذج غشاء chorioallantoic الدجاج، يفعلون ذلك مع درجات متفاوتة من نمو الورم.

Introduction

وقد عملت الفئران ككائن تقليدي نموذجي لدراسة الأمراض البشرية، بما في ذلك الأورام الخبيثة. كما الثدييات، فإنها تشترك في العديد من أوجه التشابه مع البشر. وقد سمحت درجة عالية من التشابه الجيني التلاعب المعدلة وراثيا من جينوم الماوس لتوفير نظرة هائلة في السيطرة الجينية للأمراض البشرية¹. وقد أدت الخبرة الواسعة في التعامل مع الفئران وتجريبها في كونها النموذج المفضل للبحوث الطبية الحيوية. ومع ذلك ، بالإضافة إلى المخاوف الأخلاقية والعلمية بشأن نماذج المورين ، فإنها يمكن أن تكون مكلفة للغاية وتستغرق وقتًا طويلاً^2،3. يمكن أن يستغرق تطور الأورام أسابيع أو حتى أشهر. السكن في مؤسسة نموذجية وحدها يمكن أن تعمل في مئات إلى آلاف الدولارات في حين أن الأورام تتطور. سرطان المبيض هو مثال على هذا العيب لأن نموه في نماذج مورين يمكن أن يستغرق أشهرا بسهولة. التأخير في التقدم البحثي يحتمل أن تؤثر على مرضى سرطان المبيض منخفضة باستمرار 5 سنوات معدل البقاء على قيد الحياة من 47٪ فقط (أي زيادة في البقاء على قيد الحياة فقط 10٪ على مدى 30 عاما)⁴. وبالمثل، تشكل سرطانات المسالك البولية (سرطانات الكلى والبروستاتا والمثانة) 19% من جميع حالات السرطان في الولايات المتحدة و11% من الوفيات المرتبطة بالسرطان^4. وهكذا، فإن رواية في الجسم الحي لنهج لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية يمكن أن توفر مختبر الكثير من الوقت، والعمل، والمال، حتى لو تم تطبيق هذا النموذج فقط على تجارب الفحص الأولي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تسارع نتائج البحوث الناتج عن ذلك بشكل كبير على 177,000 شخص يتم تشخيصهم بهذه السرطانات سنويًا.

نموذج كام الدجاج يقدم العديد من المزايا التي تعالج القضايا المذكورة أعلاه. نموذج شعبي لدراسة تولد الأوعية^5،6، غزو الخلايا السرطانية^7،8، والانبثاث^7،9، وقد تم بالفعل استخدام نموذج الفرخ الجنين CAM لدراسة العديد من أشكال السرطان ، بما في ذلك الورم الدبقي^10،11،12، سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة^13،14، سرطان الدم^15،16، سرطان البنكرياس¹⁷، و سرطان القولون والمستقيم¹⁸. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء نماذج CAM للورم الأرومي العصبي¹⁹، سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت²⁰، سرطان الجلد²¹، والفيساركوما القطط²². وقد قدمت الدراسات السابقة أيضا تطعيم سرطان المثانة²³ وخطوط خلايا سرطان البروستاتا²⁴، ولكن مع تفاصيل بروتوكول محدودة. ليس فقط البيض أرخص بكثير من الفئران ، ولكنها تنتج أيضا نتائج قابلة للاستنساخ للغاية^25،26. أنها تظهر تطور الأوعية الدموية السريع، ويمكن أن يحدث تطعيم الورم في أسرع بضعة أيام وتصور طوليا من خلال النافذة المفتوحة. مع الإطار الزمني 21 يوما بين تخصيب البويضة والفقس، يمكن الانتهاء من التجارب في غضون أسابيع قليلة. وعلاوة على ذلك، فإن انخفاض التكلفة، ومحدودية الاحتياجات السكنية، وصغر الحجم يسمحان بسهولة بإجراء تجارب واسعة النطاق من شأنها أن تكون مانعة لدراسات الفئران.

لذلك ، سعينا إلى تحسين نموذج CAM لتطعيم سرطانات أمراض النساء والمسالك البولية. نظرًا لحالة نقص المناعة لجنين الدجاج المبكر²⁷، يمكن زرع كل من الخلايا الماوسية والبشرية بسهولة. على هذا النحو، نجحنا في تطعيم سرطانالمبيض والكلى والبروستاتا والمثانة. لكل من هذه الأنواع من الأورام, CAM يقبل بسهولة المورين المنشأة و / أو خطوط خلايا الورم البشري. الأهم من ذلك، يمكن أن الأنسجة الورم البشري الأولية حصادها حديثا أيضا إينجرافمنالمن الخلايا المهضمة أو قطع من الأنسجة الصلبة مع معدلات عالية من النجاح. كل من هذه الأنواع السرطان ومصادر الخلايا يتطلب التحسين، والتي نشارك هنا.

Protocol

تم استعراض جميع التجارب المعروضة هنا والموافقة عليها من قبل اللجان الأخلاقية المناسبة في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA). تمت الموافقة على استخدام الأورام البشرية الأولية غير المحددة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كاليفورنيا (أرقام البروتوكول 17-000037 و 17-001169 و 11-001363). في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجليس، لا يلزم مراجعة لجنة بحوث الحيوان للتجارب باستخدام أجنة الدجاج. مطلوب موافقة البروتوكول فقط عندما سيتم تفقيس البيض. ومع ذلك، تم استخدام أفضل الممارسات، مثل إرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات، للتعامل مع أجنة الدجاج بشكل أخلاقي وتجنب الألم قدر الإمكان. ويُحث الباحثون على التحقق من متطلبات الرقابة في مؤسستهم قبل الشروع في إجراء دراسات باستخدام نماذج CAM.

1. إعداد البيض

1. قبل استلام البيض، قم بتجميع ومعادلة حاضنة البيض إلى 37.8 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) مع رطوبة 60-70٪ بناءعلى تعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: لتقليل مخاطر التلوث، يمكن استخدام المياه المعتمة للتحكم في الرطوبة.
2. عند تلقي المخصبة، رود آيلاند بيض الدجاج الأحمر من مورد البيض مختبر الصف المعتمدة، والجافة مسح سطح الأصداف مع مناشف ورقية. يمكن استخدام منشفة ورقية مبللة بخفة لإزالة المواد المنضمة. تجف على الفور.
   ملاحظة: يمكن للتبلل القشرة بسائل أقل من 43.3 درجة مئوية إدخال البكتيريا إلى البيضة. إذا اختار المرء غسل أو تطهير البيض ، يجب أن تكون درجة حرارة السائل بين 43.3-48.9 درجة مئوية. ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يغلي البيض. يجب أن يتم اختيار المطهر على أساس الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب القلق.
3. استخدم قلم رصاص أو علامة لتسمية التاريخ على البيضة. ويعتبر هذا يوم التنمية 0.
4. وضع البيض في حاضنة البيض واحتضان لمدة 7 أيام على الأقل مع التناوب للسماح تطوير CAM. ويمكن استخدام دوار أوتوماتيكي، أو قد يكون استدارة البيض 180° 2-3x يوميا.

2. فتح البيض

ملاحظة: يجب أن يتم فتح البيض عندما تكون CAM قد تطورت بالكامل. هذا هو عادة في يوم التنمية 7 أو 8.

1. تطهير مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مع الإيثانول 70٪. وبالمثل تطهير ووضع في مجلس الوزراء biosafety رف البيض، شمعة البيض، علامة، لاسلكي أداة دوارة مع حجر طحن كربيد السيليكون وعجلة القطع الدائرية، 18 G إبرة، وحدة تحكم pipet مع ربع بوصة فراغ الأنابيب، التعبئة الشريط، مكتب مقص، مقص منحني، سيمكين (أو ما شابه ذلك) ملقط، كرات القطن، و 6 × 7 سم خلع الملابس فيلم شفافة. كلما كان ذلك ممكنا، استخدم أدوات معقمة أو يمكن التخلص منها أو الأوتوكلاف.
2. إيقاف مدور البيض. ضع ما يقرب من 1-3 بيضات في خزانة السلامة البيولوجية على رف البيض. بينما في الظلام، ضع شمعة البيض ضد قشر البيض لتحديد خلية الهواء. وضع علامة على موقع الخلية الهوائية.
   ملاحظة: شدة الإضاءة من شمعة البيض أمر بالغ الأهمية لتصور المناطق الداخلية للبيضة. إذا كان من الصعب رؤية خلية الهواء أو الأوعية الدموية باستمرار ، فحاول استبدال بطاريات شمعة البيض.
3. حرك شمعة البيض فوق القشرة للعثور على شبكة أوعية دموية كبيرة. تدوير البيض إذا لزم الأمر. وvasculature المثالي سوف تكون متفرعة بالقرب من منتصف البيض. استخدام علامة لرسم أكثر من الأوعية الدموية لاستخدامها في زرع.
4. بدوره على ضوء في غطاء محرك السيارة. باستخدام أداة دوارة لاسلكية مزودة بحجر طحن كربيد السيليكون ، قم بحفر ثقب صغير في القشرة مباشرة فوق وسط الخلية الهوائية. حفر حتى تتم إزالة معظم قذيفة، ولكن الأبيض، والغشاء الداخلي سليمة.
   ملاحظة: الحفر فوق الخلية الهوائية قبل استهداف الأوعية الدموية يسمح تحديد سمك أن قشر البيض خاصة على خلية الهواء بدلا من أكثر من كام والأوعية الدموية. إذا تعطلت CAM أو vasculature ، فإن البويضة غير صالحة للزراعة.
5. حفر وفتح حفرة صغيرة أخرى حيث سيتم فتح نافذة الأوعية الدموية كما تم القيام به لخلية الهواء (الخطوة 2.4).
6. باستخدام إبرة 18 G، وثقب بلطف من خلال الغشاء الأبيض، والداخلية على خلية الهواء والأوعية الدموية. إذا لم تتمكن من اختراق قذيفة، ثم حفر بعناية أكثر من ذلك بقليل. تأكد من أن الغشاء الأبيض الداخلي (ولكن ليس CAM) قد تعطل في جميع أنحاء المنطقة المحفورة. إزالة قطعة الغشاء ليست ضرورية.
   ملاحظة: إذا تم تعطيل CAM أو vasculature خلال هذه الخطوة، تجاهل البيض. الضرر واضح إذا كان هناك تسرب الدم أو الزلال من ثقب حفر.
7. أطفئ ضوء غطاء محرك السيارة. باستخدام شمعة البيض ، تحقق من أن الخلية الهوائية تم نقلها من نهاية البيضإلى المنطقة فوق الأوعية الدموية. إذا لزم الأمر، ضع أنابيب فراغ إدراجها في وحدة تحكم الأنابيب حول ثقب فوق خلية الهواء الأصلي وتطبيق بلطف شفط في رشقات نارية قصيرة لتحريك خلية الهواء.
8. استخدام علامة لتحديد الموقع الجديد للخلية الهوائية حوالي 0.5 سم داخل حدود الهواء CAM. ألصق قطعة من شريط التعبئة فقط فوق خلية الهواء الجديدة. إذا لزم الأمر، استخدم مقص مكتب قياسي لتقليم الشريط إلى حجم مناسب.
   ملاحظة: الشريط يمكن أن تعطل تدفق الهواء من خلال قذيفة وينبغي أن لا تكون أكبر من اللازم لتغطية كاملة خلية الهواء.
9. إعادة البيض إلى الحاضنة لتسخين دون دوران مع خلية الهواء الجديدة التي تواجه لأعلى. كرر الخطوات 2.2-2.9 لفتح البيض المتبقي.
   ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. إذا لم تكن متأكدة من نوعية تطوير CAM ، يجب أن يستمر عدد صغير من البيض من خلال الخطوة 2.16 قبل فتح البيض المتبقي.
10. ضع ما يقرب من 1-3 بيضات مع خلايا هوائية منتُقلت إلى رف البيض في خزانة السلامة البيولوجية.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب إدخال التلوث في البيضة المفتوحة. لذلك ، دائما البيض فتح داخل خزانة السلامة البيولوجية ، واستخدام الأدوات والمعدات المعقمة كلما كان ذلك ممكنا.
11. باستخدام أداة دوارة لاسلكية مزودة بعجلة قطع دائرية، اقطع خطًا صغيرًا فوق حدود الخلية الهوائية المرسومة في الخطوة 2.8. تأكد من أن هذا هو ما يقرب من 0.5 سم داخل الحدود الفعلية الهواء CAM لتجنب تعطيل CAM أو vasculature. قطع تماما من خلال قذيفة ولكن يجب الحرص على عدم اختراق عميق بما فيه الكفاية لتعطيل كام أو الأوعية الدموية.
12. باستخدام مقص منحني، وقطع حول خلية الهواء المتبقية لإنشاء نافذة في قذيفة.
    ملاحظة: إذا كان الدم أو الغشاء موجودًا على القشرة التي تمت إزالتها ، فإن البويضة غير مناسبة للزرع. إذا لم يتم فتح نسبة عالية من البيض بشكل نظيف ، ففكر في الانتظار لمدة يوم إضافي واحد على الأقل لفتح البيض المتبقي للسماح بتكوين CAM بشكل أفضل. إذا لم يتم ثقب قذائف البيض المتبقية ، يجب استئناف دوران البيض داخل الحاضنة.
13. التحقق من صلاحية الجنين. سوف تظهر الأجنة القابلة للحياة الأوعية الدموية واسعة النطاق، الزلال واضحة، حركة الجنين، أو ضربات القلب مرئية.
14. باستخدام ملقط Semken، سحب قطع صغيرة من القطن من كرة القطن العقيمة. لطخة بلطف سطح CAM لإزالة الغبار قذيفة والحطام.
    ملاحظة: يجب أن يتم إزالة الحطام في نفس اليوم الذي يتم فيه فتح البيض.
15. تغطية فتحة قذيفة مع قطعة ربع من 6 × 7 سم شفافة فيلم خلع الملابس.
16. أعد البيض إلى الحاضنة. تأكد من أن البيض يجلس بشكل آمن مع فتح نافذة تواجه حتى وCAM لا تلمس خلع الملابس فيلم شفافة. استخدام قطعة من رف البيض، حافة دوار البيض، أو عنصر آخر مناسب لدعم أي البيض التي تبقي المتداول.
17. كرر الخطوات 2.10-2.16 لجميع البيض المتبقي لفتح.
    ملاحظة: لا يحتاج فتح البويضات إلى الانتهاء في نفس يوم الزرع. الانتظار على الأقل 1 يوم يمكن أن تساعد في القضاء على البيض الذي تعرض للخطر من خلال فتح قذيفة.

3. إعداد تعليق الخلايا السرطانية للزرع (الخيار 1)

ملاحظة: هذا هو أن تكتمل قبل الزرع، والتي ينبغي أن تتم بشكل مثالي بين الأيام 7 و 10. يرجى الاطلاع على الملاحظات في بداية الخطوة 5 أو 6 للحصول على مزيد من المعلومات حول تاريخ الزرع. وقد استخدم هذا النهج لجميع خطوط الخلايا وهضم ورم سرطان الكلى المستزرع.

1. إذابة حل مصفوفة خارج الخلية على الجليد.
2. باستخدام الهضم الميكانيكي و / أو الأنزيمي ، والحصول على تعليق خلية واحدة باستخدام طريقة مناسبة لنوع الخلية التي يجري زرعها.
3. إعادة تعليق العدد الإجمالي للخلايا التي سيتم زرعها في وسط مناسب للزرع. يزرع من 1-2 × 10⁶ خلايا لكل بيضة نموذجية.
   ملاحظة: المتوسط المستخدم في زرع خطوط الخلية هو عادة الوسط الكامل المستخدم لغرس الخلايا، التي تحتوي على FBS أو استبدال المصل. زرع هضم الورم يستخدم عادة وسيلة كاملة تستخدم لخطوط الخلايا الزراعة من نفس النوع من السرطان. ومع ذلك، يمكن إجراء تعديلات على الصياغة المتوسطة إذا لزم الأمر تجريبياً. وينبغي تحديد الآثار على تطور الورم ونموه من الناحية التجريبية.
4. بيليه الخلايا باستخدام سرعة الطرد المركزي والوقت المناسب للخلايا المستخدمة. السرعات النموذجية هي 250-300 × ز، والأوقات هي 5-10 دقيقة.
5. إزالة supernatant من الخلايا بيليه عن طريق الأنابيب. إعادة تعليق ميكانيكيا الخلايا في الوسط المتبقي ة عن طريق الخفقان أو الأنابيب. ضععلىالثلجليبرد. قياس حجم الخلايا والمتوسطة باستخدام أنبوب الحجم المناسب.
6. حساب أحجام الزرع بحيث يتم زرع 1-2 × 10⁶ خلايا في حجم 20-100 ميكرولتر لكل بيضة مع تركيز مصفوفة خارج الخلية النهائية من 2.7-4 ملغم / مل من البروتين. إضافة المتوسطة، أي عوامل النمو المطلوب أو المواد المضافة، ومصفوفة خارج الخلية الحل وفقا لهذا الحساب. الحفاظ على الجليد حتى على استعداد لزرع.
   ملاحظة: بالنسبة للحسابات في الخطوتين 3.3 و3.6، يجب دمج حجم إضافي لا يقل عن نصف غرسة البويضة لضمان وجود حجم مناسب لجميع البويضات في المجموعة. لزرع خطوط خلايا سرطان المبيض (أي SKOV3 و ID8) ، تم زرع 10⁶ خلايا لكل بويضة. لزرع خط خلايا الخلايا الكلوية RENCA، والخلايا المستزرعة المستمدة من سرطان الخلايا الكلوية البشرية المهضومة، وخطوط خلايا سرطان البروستاتا (أي CWR، C4-2، وMyC-CaP)، وخطوط خلايا سرطان المثانة (أي HT-1376 و T24)، تم زرع 2 × 10⁶ خلايا.

4. إعداد قطع الورم للزرع (الخيار 2)

ملاحظة: هذا هو أن تكتمل قبل زرع، والتي ينبغي أن تتم بشكل مثالي بين الأيام 7 و 10. يرجى الاطلاع على الملاحظات في بداية الخطوة 5 أو 6 للحصول على مزيد من المعلومات حول تاريخ الزرع. تم زرع سرطانالمبيض والمثانة الأولية كقطع ورم.

1. إذابة حل مصفوفة خارج الخلية على الجليد. تمييع إلى تركيز البروتين النهائي من 2.7-4 ملغ / مل في وسيلة مناسبة تحتوي على أي عوامل النمو المطلوبة أو المواد المضافة. الحفاظ على الجليد.
   ملاحظة: زرع قطع الورم يستخدم عادة المتوسطة كاملة تستخدم لخطوط الخلايا الزراعة من نفس النوع من السرطان. ومع ذلك، يمكن إجراء تعديلات على الصياغة المتوسطة إذا لزم الأمر تجريبياً. وينبغي تحديد الآثار على تطعيم الورم والنمو تجريبيا.
2. باستخدام مشرط أو مقص، قطع المكوس من الورم الطازج. أحجام مثالية تتراوح بين 2-5 ملم على كل جانب. إبقاء الأنسجة مغمورة في الوسط حتى تصبح جاهزة للزرع.

5. زرع باستخدام حلقة غير لاصقة (الخيار 1)

ملاحظة: قد يتم زرع الخلايا بداية من يوم التطوير 7 إذا تم تطوير CAM بالكامل. يمكن أن يحدث الزرع في أي وقت قبل الفقس الذي يسمح بوقت كاف لتطوير الورم والتجربة المرجوة ، ولكن لاحظ أن الخلايا المناعية للجنين تبدأ في أن تكون موجودة حوالي اليوم 10 بعد الإخصاب^27. معدل نمو الورم يختلف اختلافا كبيرا حسب نوع الخلية ويحتاج إلى تحديد تجريبي لنوع الخلية من الفائدة. تم زرع سرطان المبيض وخلايا سرطان البروستاتا باستخدام طريقة الحلقة غير اللاصقة. لاحظ أنه عند عدم توفر حلقة غير لاصقة، قد يتم قطع طرف أنبوب إلى حجم مماثل واستخدامه.

1. استخدام الإيثانول 70٪ لتطهير مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وجميع الأدوات المطلوبة: رف البيض، ملقط القزحية المنحنية، حلقات nonstick (1/4 بوصة القطر الداخلي)، قضيب اثارة الزجاج، الأنابيب حجم المناسبة ونصائح، 6 × 7 سم شفافة فيلم خلع الملابس، مقص مكتب، وعلامة أو قلم رصاص. كلما كان ذلك ممكنا، ينبغي استخدام أدوات معقمة أو قابلة للتصرف أو الأوتوكلاف.
2. ضع البيض ليتم زرعه على رف البيض في خزانة السلامة البيولوجية. حدد عددًا يمكن التحكم فيه من البيض. ما يصل إلى ستة هو نموذجي. تجنب السماح للبيض لتبرد بشكل كبير أثناء العمل معهم.
3. إزالة شفافة خلع الملابس فيلم من قذيفة عن طريق المتداول حواف نحو النافذة المفتوحة لتجنب سحب بعيدا قطعة من قذيفة. تأكد من أن البيض قابل للحياة وصحي. البيض المثالي سيكون له وعاء كبير في وسط المنطقة المفتوحة مع السفن الصغيرة المتفرعة منه.
4. باستخدام ملقط قزحية منحنية، ضع حلقة معقمة وغير لاصقة على CAM فوق السفينة، من الناحية المثالية على نقطة فرع. استخدام قضيب اثارة الزجاج المعقم لكشط بلطف CAM.
5. Pipet تعليق الخلية من الخطوة 3.6 في وسط حلقة nonstick. بدلا من ذلك، استخدم ملقط لوضع قطعة ورم من الخطوة 4.2 في مركز الحلقة nonstick وتغطية مع 20-50 ميكرولتر من حل مصفوفة خارج الخلية ولدت في الخطوة 4.1.
6. ختم الافتتاح مع قطعة ربع من 6 × 7 سم شفافة فيلم خلع الملابس. قم بتسمية البيض مع تعيين الغرسة المناسبة.
   ملاحظة: ترقيم البيض داخل مجموعة يسهل الملاحظات الطولية.
7. أعد البيضة إلى الحاضنة. تأكد من أن فتحة القشرة تستقيم وأن البيضة آمنة.
   ملاحظة: يمكن إرجاع البيض إلى حاضنة البيض دون دوران. بدلاً من ذلك، يمكن الحصول على قدرة عالية على البقاء بعد الزرع باستخدام حاضنة خلايا 37-38 درجة مئوية مع تنشيط ثاني أكسيد الكربون₂ ومقياس الرطوبة لمراقبة الرطوبة، والتي يجب أن تكون 50٪ -80٪.

6. زرع دون حلقة غير لاصقة (الخيار 2)

ملاحظة: قد يتم زرع الخلايا بداية من يوم التطوير 7 إذا تم تطوير CAM بالكامل. يمكن أن يحدث الزرع في أي وقت قبل الفقس الذي يسمح بوقت كاف لتطوير الورم والتجربة المرجوة ، ولكن لاحظ أن الخلايا المناعية للجنين تبدأ في أن تكون موجودة حوالي اليوم 10 بعد الإخصاب^27. وقد استخدمت هذه الطريقة لزرع خلايا سرطان الخلايا الكلوية وخلايا سرطان المثانة.

1. استخدام الإيثانول 70٪ لتطهير مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وجميع الأدوات المطلوبة: الأنابيب حجم المناسبة ونصائح، معقمة 10 سم أطباق زراعة الأنسجة، رف البيض، 6 × 7 سم شفافة خلع الملابس الفيلم، مقص مكتب، وعلامة.
2. استخلص حجم تلقيح تعليق الخلية المتولد في الخطوة 3.6 في طرف أنبوب الحجم المناسب (200 ميكرولتر هو نموذجي). أثناء الاحتفاظ بالجزء العلوي من الطرف، قم بإخراج طرف الأنابيب بعناية ووضعه أفقيًا في طبق زراعة أنسجة معقم بطول 10 سم.
3. كرر الخطوة 6.2 لجميع العينات داخل مجموعة مع طبق واحد لكل مجموعة.
4. ضع نصائح في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة للسماح للمصفوفة خارج الخلية ببلمرة جزئية.
5. بعد 15 دقيقة من الحضانة، ابدأ بالتحقق من البلمرة. تتسرب كمية صغيرة من السائل عادة من الطرف عند وضعها على الطبق. يمكن استخدام بلمرة هذا السائل لتقدير مدى بلمرة السائل داخل الطرف.
6. ضع البيض ليتم زرعه على رف البيض في خزانة السلامة البيولوجية. حدد عددًا يمكن التحكم فيه من البيض. ما يصل إلى ستة هو نموذجي. تجنب السماح للبيض لتبرد بشكل كبير أثناء العمل معهم.
7. قم بإزالة خلع الملابس الشفافة من القشرة عن طريق لف الحواف نحو النافذة المفتوحة. هذا يتجنب سحب قطع من قذيفة.
8. تأكد من أن البيض قابل للحياة وصحي. البيض المثالي سيكون له وعاء كبير في وسط المنطقة المفتوحة مع السفن الصغيرة المتفرعة منه.
9. ضع طرف ًا واحدًا على أنبوب بحجم مناسب. الاكتئاب المكبس لفرض تعليق الخلية المبلمرة جزئيا على CAM على سفينة كبيرة ومتطورة، من الناحية المثالية على نقطة فرع.
10. ختم الافتتاح مع قطعة ربع من 6 × 7 سم شفافة فيلم خلع الملابس.
11. قم بتسمية البويضة مع تعيين الغرسة المناسبة.
    ملاحظة: ترقيم البيض داخل مجموعة يسهل الملاحظات الطولية.
12. أعد البيضة إلى الحاضنة. تأكد من أن فتحة القشرة تستقيم وأن البيضة آمنة.
    ملاحظة: يمكن إرجاع البيض إلى حاضنة بيض مخصصة دون دوران. بدلاً من ذلك، يمكن الحصول على قدرة عالية على البقاء بعد الزرع باستخدام حاضنة خلايا 37-38 درجة مئوية مع تنشيط ثاني أكسيد الكربون₂ ومقياس الرطوبة لمراقبة الرطوبة، والتي يجب أن تكون 50٪ -80٪.

7. تصوير الإضاءة الحيوية من الأورام لوسيفيراز اليراعة

ملاحظة: إذا تم نقل الخلايا المزروعة بشكل ثابت مع الجين ترميز لوسيفراز اليراعة أو غيرها من عوامل التصوير، ثم يمكن تصور الأورام الناتجة باستخدام التصوير الإنارة الحيوية. لا ينصح التصوير الفلوري على البيض سليمة بسبب خلفية عالية من قشر البيض. هذا هو تحليل نقطة النهاية ، حيث أن فتح القشرة يقلل بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة. قد يتم التصوير بالأورام في أي وقت يناسب الاحتياجات التجريبية وسرعة نمو الورم. ومع ذلك ، في المتوسط ، يفقس البيض بعد 21 يومًا من التخصيب. لذلك، يوم التطوير 18 هو نقطة نهاية مناسبة لتجنب الفقس غير المرغوب فيها.

1. إذا لزم الأمر، نقل البيض إلى مرفق التصوير. شريط البيض على أطباق زراعة الأنسجة 10 سم. أعدها إلى حاضنة بيض 37.8 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) مع إزالة آلية الدوران أو إلغاء تنشيطها. الرطوبة ليست حاسمة للنقل والتصوير.
2. باستخدام ملقط قزحية منحنية، دفع بلطف CAM بعيدا عن قذيفة حتى CAM هو دافق مع الألبومين والجنين. باستخدام الصمامات عينة واسعة الرؤوس، وكسر بعيدا قطعة من قذيفة لتوسيع فتحة قذيفة بشكل كاف لتصور الورم.
3. حقن ما لا يقل عن 50 ميكرولتر من 30 ملغ / مل د لوسيفيرين في الزلال البيض. ويمكن أيضا أن يكون حجم مماثل من D-luciferin pipetted في حلقة nonstick أو على سطح CAM في المنطقة التي تحتوي على الخلايا المزروعة. وهذا يضمن الإضاءة الحيوية المثلى في غياب إمدادات الأوعية الدموية المثالية. الاحتضان لمدة 8 دقيقة.
4. حقن 20-50 ميكرولتر من الايزوفل في الزلال من البيض لحقن البيض. احتضان لمدة 2 دقيقة إضافية. بدلا من ذلك، يمكن وضع البيض في غرفة التعريفي التي تحتوي على 2-2.5٪ isoflurane المتبخرة. يتم الحصول على عمق التخدير الكافي عندما تتوقف الحركة الجنينية.
   ملاحظة: يمكن استخدام كميات أكبر من الايفورلوران (100 ميكرولتر) لeuthaninged البيض.
5. ضع البيض في جهاز تصوير حيوي وصورة باستخدام الإعدادات المناسبة حسب تعليمات الشركة المصنعة. لهذه الدراسة، تم استخدام وقت التعرض من 1 دقيقة.
6. لتصوير CAM المتبقية والجنين، افتح البويضة في طبق زراعة الأنسجة 10 سم.
   1. اقبض على البيضة بأصابع كلتا اليدين على الجانب السفلي من البيضة بالقرب من منتصف البيضة والإبهام على جانبي فتحة القشرة.
   2. سحب بلطف بصرف النظر عن نصفي البيض مع الإبهام في حين الضغط بلطف في البيض مع الأصابع.
   3. عندما تكون القشرة شبه منفصلة عن CAM والجنين ، قم بقلب البويضة رأسًا على عقب فوق طبق زراعة أنسجة بطول 10 سم.
   4. الاستمرار في فصل أنصاف قذيفة. إذا كان CAM العصي إلى داخل قذيفة، استخدم بلطف الأصابع لدفع كام بعيدا عن قذيفة.
   5. قد ينقلب الجنين إلى طبق آخر إذا رغبت في ذلك.
   6. وإذا لزم الأمر، يمكن إعطاء إيوفلوران إضافي كما هو الحال في الخطوة 7-4.

8. حصاد الأورام

ملاحظة: قد يتم حصاد الأورام في أي وقت يتناسب مع الاحتياجات التجريبية وسرعة نمو الورم. ومع ذلك ، في المتوسط ، يفقس البيض بعد 21 يومًا من التخصيب. لذلك، يوم التطوير 18 هو نقطة نهاية مناسبة لتجنب الفقس غير المرغوب فيها.

1. فهم الورم مع ملقط. باستخدام مقص (مقص قزحية الربيع تعمل بشكل جيد) أو مشرط، استئصال الورم بعناية من CAM.
2. إذا تم نقل الورم باستخدام جين لوسيفيراز اليراعة، يمكن إجراء إعادة التصوير للتحقق من النجاح في إزالة الأورام التي يصعب تصورها.
   ملاحظة: يمكن تحليل الأورام المُستأصلة بأي طريقة مناسبة لتجربة معينة. كما يمكن إعادة زرع الأورام في CAM أو الفئران. لتأكيد هوية الورم، قد تكون الأورام ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ، وفحصها مع هيماتوكسيلين وإيوسين أو تلطيخ الهيستوكيميائية المناعية.

النتائج

حتى الآن ، وجدنا أن هذه الطريقة في الزرع ناجحة لسرطان المبيض والكلى والبروستاتا والمثانة. تم تحسين كل منها لتحديد شروط محددة للزرع ، على الرغم من أنه قد تكون هناك مرونة. من أنواع الورم المختبرة ، كان نمو سرطان المبيض أقل وضوحًا ولا يظهر عادة ً دون مساعدة من التصوير الحيوي

Discussion

توسيع الورم وتطعيم باستخدام نموذج CAM يسمح نمو الورم أسرع ويمكن ملاحظته مباشرة من الموجودة في نماذج الحيوانات الحي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التكاليف تكون أقل بكثير بمجرد الانتهاء من الشراء الأولي للمعدات، لا سيما بالمقارنة مع تكلفة الفئران التي لا تنقصها المناعة. تسمح الحالة الأولية المنق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.