Utilisation du modèle De membrane chorioallantoïque de poulet In Vivo pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques

Résumé

Nous présentons le modèle chorioallantoic de membrane de poulet comme modèle alternatif, transplantable, in vivo pour l'engraftment des lignes gynécologiques et urologiques de cellules cancéreuses et des tumeurs patient-dérivées.

Résumé

Les modèles de souris sont les tests de référence pour les études sur le cancer in vivo. Cependant, le coût, le temps et les considérations éthiques ont donné lieu à des appels en faveur de modèles alternatifs de cancer in vivo. Le modèle de membrane chorioallantoïque de poulet (CAM) fournit une alternative peu coûteuse et rapide qui permet la visualisation directe du développement de tumeur et est approprié pour l'imagerie in vivo. En tant que tel, nous avons cherché à développer un protocole optimisé pour engrafting des tumeurs gynécologiques et urologiques dans ce modèle, que nous présentons ici. Environ 7 jours après la fécondation, la cellule d'air est déplacée vers le côté vascularisé de l'œuf, où une ouverture est créée dans la coquille. Les tumeurs des lignées cellulaires et des tissus primaires de la murine et de l'homme peuvent alors être greffées. Ceux-ci sont généralement enseisés dans un mélange de matrice extracellulaire et de milieu pour éviter la dispersion cellulaire et fournir un soutien nutritionnel jusqu'à ce que les cellules recrutent un approvisionnement vasculaire. Les tumeurs peuvent alors croître jusqu'à 14 jours supplémentaires avant l'éclosion des œufs. En implantant des cellules transmises de façon stable à la luciférase luciferase luciferase, l'imagerie par bioluminescence peut être utilisée pour la détection sensible de la croissance tumorale sur la membrane et la propagation des cellules cancéreuses dans l'ensemble de l'embryon. Ce modèle peut potentiellement être employé pour étudier la tumorigénicité, l'invasion, la métastes, et l'efficacité thérapeutique. Le modèle CAM de poulet nécessite beaucoup moins de temps et de ressources financières par rapport aux modèles murins traditionnels. Étant donné que les œufs sont immunodéprimés et tolérants au système immunitaire, les tissus de n'importe quel organisme peuvent potentiellement être implantés sans animaux transgéniques coûteux (p. ex. souris) requis pour l'implantation de tissus humains. Cependant, beaucoup des avantages de ce modèle pourraient potentiellement également être des limitations, y compris le temps court de génération de tumeur et le statut immunocompromis/immune tolérant. En outre, bien que tous les types de tumeur présentéicis ici engraft dans le modèle de membrane chorioallantoic de poulet, ils le font avec des degrés variables de croissance de tumeur.

Introduction

Les souris ont servi d'organisme modèle classique pour l'étude des maladies humaines, y compris la malignité. En tant que mammifères, ils partagent de nombreuses similitudes avec les humains. Leur degré élevé de similitude génétique a permis la manipulation transgénique du génome de la souris pour fournir un aperçu énorme dans le contrôle génétique des maladies humaines¹. Une vaste expérience dans la manipulation et l'expérimentation avec des souris a abouti à leur être le modèle de choix pour la recherche biomédicale. Cependant, en plus des préoccupations éthiques et scientifiques concernant les modèles murins, ils peuvent également être très coûteux et prendre beaucoup de temps^2,3. Le développement des tumeurs peut prendre des semaines, voire des mois. Le logement à une institution typique seul peut fonctionner dans les centaines à des milliers de dollars tandis que les tumeurs se développent. Le cancer de l'ovaire est un exemple de cet inconvénient parce que sa croissance dans les modèles murins peut facilement prendre des mois. Les retards dans les progrès de la recherche peuvent avoir un impact sur le faible taux de survie à 5 ans des patients atteints d'un cancer de l'ovaire, qui n'est que de 47 % (c.-à-d. une augmentation de la survie de seulement 10 % sur 30 ans)⁴. De même, les cancers urologiques (cancers du rein, de la prostate et de la vessie) représentent 19 % de tous les cas de cancer aux États-Unis et 11 % des décès liés au cancer⁴. Ainsi, une nouvelle approche in vivo pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques pourrait faire économiser beaucoup de temps, de travail et d'argent à un laboratoire, même si ce modèle n'est appliqué qu'aux premières expériences de dépistage. De plus, l'accélération des résultats de la recherche qui en résulterait pourrait avoir un impact important sur les 177 000 personnes diagnostiquées avec ces cancers chaque année.

Le modèle CAM de poulet offre de nombreux avantages qui répondent aux problèmes susmentionnés. Un modèle populaire pour étudier l'angiogenèse^5,6, invasion de cellules tumorales^7,8, et métastasie⁷,^9,le modèle CAM embryon poussin a déjà été utilisé pour étudier de nombreuses formes de cancers, y compris le gliome^10,11,12, la tête et le cou carcinome épidermoïde^13,14, leucémie^15,16, cancer du pancréas¹⁷, et cancer colorectal¹⁸. En outre, les modèles de CAM ont été produits pour le neuroblastome¹⁹, le lymphome de Burkitt^20,le mélanome^21,et le fibrosarcome félin^22. Des études antérieures ont également présenté l'engraftment du cancer de la vessie²³ et les lignées cellulaires du cancer de la prostate²⁴, mais avec des détails limités de protocole. Non seulement les œufs sont beaucoup moins chers que les souris, mais ils produisent aussi des résultats très reproductibles^25,26. Ils montrent le développement rapide de vascularisation, et l'engraftment de tumeur peut se produire en aussi rapidement que quelques jours et être visualisé longitudinalement par la fenêtre ouverte. Avec le délai de 21 jours entre la fécondation des œufs et l'éclosion, les expériences peuvent être terminées en quelques semaines. En outre, le faible coût, les besoins limités en matière de logement et la petite taille permettent facilement des expériences à grande échelle qui seraient prohibitives pour les études sur les souris.

Par conséquent, nous avons cherché à optimiser le modèle de CAM pour l'engraftment des cancers gynécologiques et urologiques. En raison de l'état immunocompromis de l'embryon de poulet au début²⁷, la souris et les cellules humaines peuvent être facilement implantés. En tant que tel, nous avons réussi à greffer des cancers de l'ovaire, du rein, de la prostate et de la vessie. Pour chacun de ces types de tumeur, le CAM accepte facilement les lignées de cellules murines et/ou humaines établies de cellules de tumeur. Fait important, les tissus tumoraux humains primaires fraîchement récoltés peuvent également s'engrafter à partir de cellules digérées ou de morceaux de tissu solide avec des taux élevés de succès. Chacun de ces types de cancer et sources cellulaires nécessite une optimisation, que nous partageons ici.

Protocole

Toutes les expériences présentées dans les présentes ont été examinées et approuvées par les comités d'éthique appropriés de l'Université de Californie à Los Angeles (UCLA). L'utilisation des tumeurs humaines humaines primaires et identifiées a été approuvée par le conseil institutionnel d'examen de l'UCLA (numéros de protocole 17-000037, 17-001169, et 11-001363). À l'UCLA, l'examen du Comité de recherche sur les animaux n'est pas nécessaire pour les expériences utilisant des embryons de poulet; l'approbation du protocole n'est requise que lorsque les œufs éclosent. Cependant, les meilleures pratiques, telles que les Lignes directrices de l'AVMA pour l'euthanasie des animaux, ont été utilisées pour manipuler les embryons de poulet de façon éthique et pour éviter autant que possible la douleur. Les chercheurs sont invités à vérifier les exigences de surveillance de leur établissement avant de commencer des études à l'aide de modèles DE CAM.

1. Préparation des œufs

1. Avant de recevoir les œufs, assembler et réquilibrer l'incubateur d'œufs à 37,8 oC (100 oF) avec une humidité de 60 à 70 % suivant les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Pour minimiser les risques de contamination, de l'eau autoclave peut être utilisée pour contrôler l'humidité.
2. Après avoir reçu des œufs de poulet rouges fertilisés de Rhode Island d'un fournisseur d'œufs certifié de qualité laboratoire, essuyez à sec la surface des coquilles avec des essuie-tout. Un essuie-tout légèrement humidifié peut être utilisé pour enlever le matériel adhérent. Séchez immédiatement.
   REMARQUE : Mouiller la coquille avec du liquide inférieur à 43,3 oC peut introduire des bactéries dans l'œuf. Si l'on choisit de laver ou de désinfecter les œufs, la température du liquide doit être comprise entre 43,3 et 48,9 oC. Des températures plus élevées peuvent faire bouillir les œufs. Le choix du désinfectant doit être fait en fonction des micro-organismes qui suscitent des inquiétudes.
3. Utilisez un crayon ou un marqueur pour étiqueter la date sur l'œuf. Ceci est considéré comme le jour de développement 0.
4. Placer les œufs dans l'incubateur d'œufs et couver pendant au moins 7 jours avec rotation pour permettre le développement de CAM. Un rotateur automatique peut être utilisé, ou les œufs peuvent être tournés 180 '2-3x par jour.

2. Ouverture des œufs

REMARQUE : L'ouverture des œufs doit être faite lorsque le CAM est complètement développé. C'est typiquement le jour de développement 7 ou 8.

1. Désinfecter une armoire de biosécurité avec 70 % d'éthanol. De même désinfecter et placer dans l'armoire de biosécurité une grille d'oeufs, candler d'oeuf, marqueur, outil rotatif sans fil avec une pierre de broyage de carbure de silicium et roue de coupe circulaire, 18 G aiguille, contrôleur de pipet avec tube à vide de quart de pouce, ruban d'emballage, bureau ciseaux, ciseaux incurvés, forceps Semken (ou similaires), boules de coton et vinaigrette à film transparent de 6 x 7 cm. Dans la mesure du possible, utilisez des outils stériles, jetables ou autoclaved.
2. Éteignez le rotateur d'œufs. Placer environ 1-3 œufs dans l'armoire de biosécurité sur la grille à œufs. Dans l'obscurité, placez la candeur d'œufs contre la coquille d'œuf pour identifier la cellule d'air. Marquez l'emplacement de la cellule aérienne.
   REMARQUE : L'intensité de l'éclairage de la candre d'oeuf est cruciale pour visualiser l'intérieur de l'oeuf. Si la cellule d'air ou la vascularisation est toujours difficile à voir, essayez de remplacer les piles de candeur d'oeuf.
3. Déplacez la candre d'oeufs au-dessus de la coquille pour trouver un grand réseau de vaisseaux sanguins. Faire pivoter l'œuf si nécessaire. Une vascularisation idéale sera ramifiée près du milieu de l'œuf. Utilisez un marqueur pour dessiner sur la vascularisation à utiliser pour l'implantation.
4. Allumez la lumière dans le capot. À l'aide d'un outil rotatif sans fil muni d'une pierre de broyage de carbure de silicium, percer un petit trou dans la coquille directement au-dessus du centre de la cellule d'air. Percer jusqu'à ce que la majeure partie de la coquille a été enlevée, mais la membrane intérieure blanche est intacte.
   REMARQUE : Le forage au-dessus de la cellule d'air avant de cibler la vascularisation permet de déterminer l'épaisseur de cette coquille d'œuf particulière au-dessus de la cellule d'air plutôt que sur le CAM et la vascularisation. Si le CAM ou la vascularisation est perturbé, l'œuf n'est pas utilisable pour l'implantation.
5. Percer et ouvrir un autre petit trou où la fenêtre vasculaire sera ouverte comme cela a été fait pour la cellule d'air (étape 2.4).
6. À l'aide d'une aiguille de 18 G, percer délicatement la membrane intérieure blanche au-dessus de la cellule d'air et de la vascularisation. S'il est incapable de pénétrer dans la coquille, puis forer soigneusement un peu plus. Assurez-vous que la membrane intérieure blanche (mais pas la CAM) est perturbée sur l'ensemble de la zone forée. L'enlèvement de la pièce membranaire n'est pas nécessaire.
   REMARQUE : Si le CAM ou la vascularisation est perturbé pendant cette étape, jetez l'œuf. Les dommages sont évidents s'il y a du sang ou de l'albumine qui fuit d'un trou percé.
7. Éteignez la lumière du capot. À l'aide de la candeuse à œufs, vérifiez que la cellule d'air a été transférée de l'extrémité de l'œuf à la zone au-dessus de la vascularisation. Si nécessaire, placez le tube à vide inséré dans un contrôleur de pipet autour du trou au-dessus de la cellule d'air d'origine et appliquez doucement l'aspiration en rafales courtes pour déplacer la cellule d'air.
8. Utilisez un marqueur pour décrire le nouvel emplacement de la cellule d'air à environ 0,5 cm à l'intérieur de la limite air-CAM. Affix un morceau de ruban adhésif juste au-dessus de la nouvelle cellule d'air. Si nécessaire, utilisez des ciseaux de bureau standard pour couper le ruban à une taille appropriée.
   REMARQUE : La bande peut perturber le flux d'air à travers la coquille et ne doit pas être plus grande que nécessaire pour couvrir entièrement la cellule d'air.
9. Remettre les œufs à l'incubateur pour réchauffer sans rotation avec la nouvelle cellule d'air face vers le haut. Répéter les étapes 2.2-2.9 pour les œufs restants à ouvrir.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. S'ils ne sont pas sûrs de la qualité du développement de la MCA, un petit nombre d'œufs doivent passer par l'étape 2.16 avant d'ouvrir les œufs restants.
10. Placez environ 1 à 3 œufs avec des cellules d'air relocalisées sur la grille d'œufs dans l'armoire de biosécurité.
    REMARQUE : Il faut prendre soin d'éviter d'introduire de la contamination dans l'œuf ouvert. Par conséquent, ouvrez toujours les œufs à l'intérieur d'une armoire de biosécurité et utilisez des outils et de l'équipement stériles dans la mesure du possible.
11. À l'aide d'un outil rotatif sans fil muni d'une roue de coupe circulaire, couper une petite ligne au-dessus de la limite de la cellule d'air tracée à l'étape 2.8. Assurez-vous qu'il s'agit d'environ 0,5 cm à l'intérieur de la limite réelle air-CAM pour éviter de perturber la CAM ou la vascularisation. Couper complètement à travers la coquille, mais attention à ne pas pénétrer assez profondément pour perturber le CAM ou la vascularisation.
12. À l'aide de ciseaux incurvés, couper autour de la cellule d'air restante pour créer une fenêtre dans la coquille.
    REMARQUE : Si du sang ou de la membrane est présent sur la coquille enlevée, l'œuf ne convient pas à l'implantation. Si une forte proportion des œufs ne sont pas ouverts proprement, envisagez d'attendre au moins 1 jour de plus pour ouvrir les œufs restants afin de permettre une meilleure formation de CAM. Si les coquilles des œufs restants n'ont pas été percées, la rotation des œufs à l'intérieur de l'incubateur doit être reprise.
13. Vérifier la viabilité de l'embryon. Les embryons viables présenteront une vascularisation étendue, de l'albumine claire, un mouvement embryonnaire ou un battement de cœur visible.
14. À l'aide de forceps Semken, retirer de petits morceaux de coton d'une boule de coton stérile. Effacer délicatement la surface du CAM pour enlever la poussière et les débris de la coquille.
    REMARQUE : L'enlèvement des débris doit être effectué le jour même de l'ouverture des œufs.
15. Couvrir l'ouverture de la coquille d'un quart de vinaigrette transparente de 6 x 7 cm.
16. Remettre les œufs à l'incubateur. Assurez-vous que l'œuf se trouve solidement avec la fenêtre ouverte vers le haut et le CAM ne touche pas la vinaigrette de film transparente. Utilisez un morceau de grille d'œufs, le bord du rotateur d'œufs, ou un autre élément approprié pour soutenir tous les œufs qui continuent à rouler.
17. Répéter les étapes 2.10-2.16 pour tous les œufs restants à ouvrir.
    REMARQUE : L'ouverture des œufs n'a pas besoin d'être terminée le même jour que l'implantation. Attendre au moins 1 jour peut aider à éliminer les œufs dont la viabilité a été compromise par l'ouverture de la coquille.

3. Préparation de la suspension des cellules cancéreuses pour la transplantation (option 1)

REMARQUE : Cela doit être terminé juste avant l'implantation, ce qui devrait idéalement avoir lieu entre les jours 7 et 10. Veuillez consulter les notes au début de l'étape 5 ou 6 pour plus d'informations concernant la date d'implantation. Cette approche a été employée pour toutes les lignes de cellules et les digests cultivés de tumeur de cancer de rein.

1. Décongeler la solution de matrice extracellulaire sur la glace.
2. À l'aide d'une digestion mécanique et/ou enzymatique, obtenir une suspension à cellule unique en utilisant une méthode appropriée pour le type de cellule implantée.
3. Resuspendre le nombre total de cellules à implanter dans un milieu approprié pour l'implantation. Les implants de 1-2 x 10⁶ cellules par oeuf sont typiques.
   REMARQUE : Le milieu utilisé pour l'implantation des lignées cellulaires est généralement le milieu complet utilisé pour la culture des cellules, contenant le SGF ou le remplacement du sérum. L'implantation des digestes de tumeur emploie typiquement le milieu complet employé pour cultiver des lignes de cellules du même type de cancer. Cependant, des ajustements à la formulation moyenne peuvent être faits si nécessaire expérimentalement. Les effets sur le développement et la croissance de tumeur devraient être empiriquement déterminés.
4. Pelleter les cellules en utilisant une vitesse centrifugeuse et le temps approprié pour les cellules utilisées. Les vitesses typiques sont 250-300 x g,et les temps sont 5-10 min.
5. Retirez le supernatant des cellules granulées par pipetting. Suspendre mécaniquement les cellules dans le milieu résiduel par le clignotement ou le tuyauterie. Placer sur la glace pour refroidir. Mesurer le volume des cellules et du milieu à l'aide d'un tuyau de taille appropriée.
6. Calculer les volumes d'implantation de telle sorte que 1-2 x 10⁶ cellules sont implantées dans un volume de 20-100 L par oeuf avec une concentration de matrice extracellulaire finale de 2,7-4 mg/mL de protéines. Ajouter moyen, tous les facteurs de croissance souhaités ou des additifs, et la solution de matrice extracellulaire selon ce calcul. Conserver sur la glace jusqu'au moment de l'implant.
   REMARQUE : Pour les calculs effectués aux étapes 3.3 et 3.6, un volume supplémentaire d'au moins un demi-implant d'ovules devrait être incorporé afin d'assurer un volume adéquat pour tous les œufs du groupe. Pour l'implantation des lignées cellulaires cancéreuses de l'ovaire (c.-à-d. SKOV3 et ID8), 10⁶ cellules par ovule ont été implantées. Pour l'implantation de la lignée cellulaire rénale RENCA, des cellules cultivées dérivées du carcinome rénal humain digéré, des lignées de cellules cancéreuses de la prostate (c.-à-d. CWR, C4-2 et MyC-CaP) et des lignées de cellules cancéreuses de la vessie (c.-à-d. HT-1376 et T24), 2 x 10⁶ cellules ont été implantées.

4. Préparation des morceaux tumoraux pour l'implantation (option 2)

REMARQUE : Cela doit être terminé juste avant l'implantation, ce qui devrait idéalement avoir lieu entre les jours 7 et 10. Veuillez consulter les notes au début de l'étape 5 ou 6 pour plus d'informations concernant la date d'implantation. Des cancers primaires d'ovaire et de réservoir souple ont été implantés comme morceaux de tumeur.

1. Décongeler la solution de matrice extracellulaire sur la glace. Diluer à une concentration finale de protéines de 2,7-4 mg/mL dans un milieu approprié contenant tous les facteurs de croissance souhaités ou des additifs. Restez sur la glace.
   REMARQUE : L'implantation des morceaux de tumeur emploie typiquement le milieu complet employé pour cultiver des lignes de cellules du même type de cancer. Cependant, des ajustements à la formulation moyenne peuvent être faits si nécessaire expérimentalement. Les effets sur l'engraftment et la croissance de tumeur devraient être empiriquement déterminés.
2. À l'aide d'un scalpel ou de ciseaux, exciser les morceaux de la tumeur fraîche. Les tailles idéales varient de 2 à 5 mm de chaque côté. Gardez les tissus immergés dans le milieu jusqu'au moment de l'implant.

5. Implantation à l'aide d'un anneau antiadhésif (option 1)

REMARQUE : Les cellules peuvent être implantées à partir du jour du développement 7 si le CAM est entièrement développé. L'implantation peut se produire n'importe quand avant l'éclosion qui permet suffisamment de temps pour le développement de la tumeur et l'expérience souhaitée, mais notez que les cellules immunitaires de l'embryon commencent à être présents autour du jour 10 postfertilisation²⁷. Le taux de croissance tumoral varie considérablement selon le type de cellule et doit être déterminé empiriquement pour le type de cellule d'intérêt. Le cancer de l'ovaire et les cellules cancéreuses de la prostate ont été implantés à l'aide de la méthode de l'anneau antiadhésif. Notez que lorsqu'un anneau antiadhésif n'est pas disponible, une pointe de pipet peut être coupée à une taille similaire et utilisée.

1. Utilisez 70 % d'éthanol pour désinfecter une armoire de biosécurité et tous les outils nécessaires : un porte-œufs, des forceps d'iris incurvés, des anneaux antiadhésifs (1/4 pouce de diamètre intérieur), une tige à remuer en verre, des tuyaux et des pointes de volume appropriés, un pansement transparent de 6 x 7 cm, des ciseaux de bureau et un marqueur ou un crayon. Dans la mesure du possible, des outils stériles, jetables ou autoclaved doivent être utilisés.
2. Placer les œufs à implanter sur une grille d'œufs dans une armoire de biosécurité. Sélectionnez un nombre gérable d'œufs. Jusqu'à six est typique. Évitez de laisser les œufs refroidir considérablement tout en travaillant avec eux.
3. Retirez le pansement transparent de la coquille en roulant les bords vers la fenêtre ouverte pour éviter de retirer des morceaux de coquille. Vérifiez que les œufs sont viables et sains. Les œufs idéaux auront un grand récipient au centre de la zone ouverte avec de plus petits récipients s'émettant de lui.
4. À l'aide de forceps incurvés à l'iris, placez un anneau stérile et antiadhésif sur le CAM au-dessus du navire, idéalement au-dessus d'un point de branchement. Utilisez une tige stérile en verre pour abréder doucement le CAM.
5. Pipet la suspension cellulaire de l'étape 3.6 dans le centre de l'anneau antiadhésif. Alternativement, utilisez des forceps pour placer une pièce de tumeur de l'étape 4.2 dans le centre de l'anneau antiadhésif et couvrir avec 20-50 L de la solution de matrice extracellulaire générée à l'étape 4.1.
6. Sceller l'ouverture avec un quart de pièce de 6 x 7 cm de vinaigrette transparente. Étiqueter les œufs avec une désignation d'implant appropriée.
   REMARQUE : Le numérotage des œufs au sein d'un groupe facilite les observations longitudinales.
7. Remettre l'œuf à l'incubateur. Assurez-vous que l'ouverture de la coquille se trouve debout et que l'œuf est bien fixé.
   REMARQUE : Les œufs peuvent être retournés dans un incubateur d'œufs sans rotation. Alternativement, la viabilité élevée de poteauimplant peut être obtenue utilisant un incubateur de cellules de 37-38 oC avec le CO₂ désactivé et un hygromètre pour surveiller l'humidité, qui devrait être 50%-80%.

6. Implantation sans anneau antiadhésif (option 2)

REMARQUE : Les cellules peuvent être implantées à partir du jour du développement 7 si le CAM est entièrement développé. L'implantation peut se produire n'importe quand avant l'éclosion qui permet suffisamment de temps pour le développement de la tumeur et l'expérience souhaitée, mais notez que les cellules immunitaires de l'embryon commencent à être présents autour du jour 10 postfertilisation²⁷. Cette méthode a été utilisée pour implanter les cellules rénales du carcinome et les cellules cancéreuses de la vessie.

1. Utilisez 70 % d'éthanol pour désinfecter une armoire de biosécurité et tous les outils requis : pipets et pointes de volume appropriés, plats stériles de culture de tissus de 10 cm, porte-œufs, pansement transparent de film de 6 x 7 cm, ciseaux de bureau et marqueur.
2. Aspirez un volume d'inoculation de la suspension cellulaire générée à l'étape 3.6 en une pointe de tuyauterie de taille appropriée (200 L est typique). Tout en tenant la partie supérieure de la pointe, éjecter soigneusement la pointe du pipet et placer horizontalement dans un plat stérile de culture tissulaire de 10 cm.
3. Répétez l'étape 6.2 pour tous les échantillons d'un groupe avec un plat pour chaque groupe.
4. Placez les pointes dans un incubateur de 37 oC pendant 15 à 30 min pour permettre à la matrice extracellulaire de polymériser partiellement.
5. Après 15 min d'incubation, commencez à vérifier la polymérisation. Une petite quantité de liquide fuit généralement hors de la pointe lorsqu'il est placé sur le plat. La polymérisation de ce liquide peut être utilisée pour estimer l'étendue de la polymérisation du liquide à l'intérieur de la pointe.
6. Placer les œufs à implanter sur une grille d'œufs dans une armoire de biosécurité. Sélectionnez un nombre gérable d'œufs. Jusqu'à six est typique. Évitez de laisser les œufs refroidir considérablement tout en travaillant avec eux.
7. Retirez le pansement transparent de la coquille en roulant les bords vers la fenêtre ouverte. Cela évite de retirer des morceaux de coquille.
8. Vérifiez que les œufs sont viables et sains. Les œufs idéaux auront un grand récipient au centre de la zone ouverte avec de plus petits récipients s'émettant de lui.
9. Placez une pointe de pipet sur un tuyau de taille appropriée. Baisser le piston pour forcer la suspension cellulaire partiellement polymétésur le CAM sur un grand navire bien développé, idéalement sur un point de branche.
10. Sceller l'ouverture avec un quart de pièce de 6 x 7 cm de vinaigrette transparente.
11. Étiqueter l'œuf avec une désignation d'implant appropriée.
    REMARQUE : Le numérotage des œufs au sein d'un groupe facilite les observations longitudinales.
12. Remettre l'œuf à l'incubateur. Assurez-vous que l'ouverture de la coquille se trouve debout et que l'œuf est bien fixé.
    REMARQUE : Les œufs peuvent être retournés dans un incubateur d'œufs dédié sans rotation. Alternativement, la viabilité élevée de poteauimplant peut être obtenue utilisant un incubateur de cellules de 37-38 oC avec le CO₂ désactivé et un hygromètre pour surveiller l'humidité, qui devrait être 50%-80%.

7. Imagerie de bioluminescence des tumeurs marquées de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase

REMARQUE : Si les cellules implantées ont été transduced de façon stable avec le gène codant la luciferase de luciferase de luciferase de luciferase ou d'autres facteurs d'imagerie, alors les tumeurs résultantes peuvent être visualisées utilisant la formation image de bioluminescence. L'imagerie par fluorescence n'est pas recommandée sur les œufs intacts en raison de l'arrière-plan élevé de la coquille d'œuf. Il s'agit d'une analyse de point de terminaison, car l'ouverture de la coquille réduit considérablement la survie. Les tumeurs peuvent être imageà tout moment qui est approprié pour les besoins expérimentaux et la vitesse de la croissance tumorale. Cependant, en moyenne, les œufs éclosent 21 jours après la fécondation. Par conséquent, le jour de développement 18 est un point de terminaison approprié pour éviter l'éclosion non désirée.

1. Si nécessaire, transportez les œufs à l'installation d'imagerie. Tapez les œufs sur des plats de culture de tissus de 10 cm. Retournez-les dans un incubateur d'œufs de 37,8 oC (100 oF) avec le mécanisme de rotation enlevé ou désactivé. L'humidité n'est pas cruciale pour le transport et l'imagerie.
2. À l'aide de forceps d'iris incurvés, poussez doucement le CAM loin de la coquille jusqu'à ce que le CAM soit rempli de l'albumine et de l'embryon. À l'aide de forceps à large pointe, briser les morceaux de la coquille pour étendre l'ouverture de la coquille de manière adéquate pour la visualisation tumorale.
3. Injecter un minimum de 50 oL de 30 mg/mL de D-luciferin dans l'albumine des œufs. Un volume similaire de D-luciferin peut également être pipetted dans l'anneau antiadhésif ou sur la surface du CAM dans la zone contenant les cellules implantées. Cela assure une bioluminescence optimale en l'absence d'un approvisionnement vasculaire idéal. Incuber pendant 8 min.
4. Injecter 20-50 l d'isoflurane dans l'albumine de l'œuf pour anesthésier l'œuf. Incuber pendant 2 min supplémentaires. Alternativement, l'œuf peut être placé dans une chambre d'induction contenant 2-2,5% d'isoflurane vaporisé de 2 à 2,5%. Une profondeur d'anesthésie adéquate est obtenue lorsque le mouvement embryonnaire cesse.
   REMARQUE : De plus grands volumes d'isoflurane (100 l) peuvent être utilisés pour euthanasier l'œuf.
5. Placez les œufs dans un dispositif d'imagerie de bioluminescence et l'image en utilisant les paramètres appropriés selon les instructions du fabricant. Pour cette étude, un temps d'exposition de 1 min a été utilisé.
6. Pour imager le CAM et l'embryon restants, ouvrez l'œuf dans un plat de culture tissulaire de 10 cm.
   1. Saisir l'œuf avec les doigts des deux mains sur le dessous de l'œuf près du milieu de l'œuf et les pouces de chaque côté de l'ouverture de la coquille.
   2. Démonter délicatement les deux moitiés de l'œuf avec les pouces tout en appuyant doucement sur l'œuf avec les doigts.
   3. Lorsque la coquille est à peu près à moitié séparée de la MCA et de l'embryon, retourner l'œuf à l'envers au-dessus d'un plat de culture tissulaire de 10 cm.
   4. Continuer à séparer les moitiés de coquille. Si le CAM colle à l'intérieur de la coquille, utilisez délicatement les doigts pour pousser le CAM loin de la coquille.
   5. L'embryon peut être retourné dans un autre plat si désiré.
   6. Si nécessaire, l'isoflurane supplémentaire peut être administré comme à l'étape 7.4.

8. Récolte de tumeurs

REMARQUE : Les tumeurs peuvent être récoltées à tout moment qui convient aux besoins expérimentaux et à la vitesse de croissance de la tumeur. Cependant, en moyenne, les œufs éclosent 21 jours après la fécondation. Par conséquent, le jour de développement 18 est un point de terminaison approprié pour éviter l'éclosion non désirée.

1. Saisir la tumeur avec des forceps. À l'aide de ciseaux (les ciseaux d'iris de printemps fonctionnent bien) ou d'un scalpel, excise soigneusement la tumeur de CAM.
2. Si la tumeur a été transduced avec le gène de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase, la reimaging peut être exécutée pour vérifier l'enlèvement réussi des tumeurs difficiles-à-visualiser.
   REMARQUE : Les tumeurs excisées peuvent être analysées par n'importe quelle méthode appropriée pour une expérience particulière. Les tumeurs peuvent également être réimplantées dans le CAM ou les souris. Pour confirmer l'identité de tumeur, les tumeurs peuvent être fixées, paraffine incorporée, et examinées avec l'hématoxylin et l'éosin ou la coloration immunohistochemical.

Résultats

Jusqu'ici, nous avons trouvé cette méthode d'implantation pour être réussie pour des cancers ovariens, de rein, de prostate, et de réservoir souple. Chacun a été optimisé pour identifier des conditions spécifiques pour l'implantation, bien qu'il puisse y avoir flexibilité. Parmi les types de tumeurs testés, la croissance du cancer de l'ovaire était beaucoup moins prononcée et généralement non visible sans l'aide de la formation image de bioluminescence (

Discussion

L'expansion et l'engraftment de tumeur utilisant le modèle de CAM permettent une croissance plus rapide et directement observable de tumeur que les modèles animaux in vivo existants. En outre, les coûts sont significativement plus faibles une fois l'achat initial de l'équipement est terminé, surtout par rapport au coût des souris immunocompromised. L'état initial et immunocompromis des embryons de poulet permet facilement l'engraftment du tissu humain et murine. Malgré ces atouts, le modèle CAM a des limites. Le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.