تحديد مثبطات التفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام الفحص التحليلي المنقسم

Summary

هنا ، نقدم طريقه لفحص العوامل الفيروسية المضادة للتهاب الكبد B التي تمنع تفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام المقايسة الخاص بالانقسام. هذا النظام يسمح بسهوله الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين وهو مناسب لتحديد مثبطات مثل هذه التفاعلات.

Abstract

هناك حاجه ماسه للعوامل العلاجية الجديدة للعدوى بفيروس التهاب الكبد B (HBV). علي الرغم من ان النظائر المتوفرة حاليا النيونوس (t) ide تمنع النسخ المتماثل الفيروسية ، فانها ليس لها تاثير مباشر علي التعبير عن البروتينات الفيروسية المنقولة من الحمض النووي الفيروسي الدائري المغلق (cccDNA). كما تحميل مستضد الفيروسية عاليه قد تلعب دورا في هذا السرطان المزمنة وذات الصلة HBV, الهدف من العلاج HBV هو القضاء علي البروتينات الفيروسية. HBV البروتين التنظيمية X (HBx) بربط البروتين الحمض النووي المضيف الضرر الملزمة 1 (DDB1) البروتين لتتحلل الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، مما ادي إلى تفعيل النسخ الفيروسي من cccDNA. هنا ، باستخدام نظام الفحص المتكامل لمسح البيانات ، نقدم نظاما شاملا للفحص المركب للتعرف علي مثبطات تفاعل HBx-DDB1. بروتوكولنا يتيح الكشف السهل لديناميكيات التفاعل في الوقت الحقيقي داخل الخلايا الحية. قد تصبح هذه التقنية فحصا رئيسيا لاكتشاف العوامل العلاجية الجديدة لعلاج عدوي HBV.

Introduction

فيروس التهاب الكبد B (HBV) العدوى هي مصدر قلق رئيسي في مجال الصحة العامة في جميع انحاء العالم ، مع التقديرات السنوية 240,000,000 الأشخاص المصابين بامراض مزمنة مع HBV و 90,000 الوفاات بسبب مضاعفات العدوى ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية (اتش سي سي)¹. علي الرغم من ان العوامل العلاجية المضادة لHBV الحالية, النيونوس (ر) نظائرها ide, تمنع بما فيه الكفاية النسخ العكسي الفيروسية, انها نادرا ما تحقيق القضاء علي البروتينات الفيروسية, وهو الهدف السريري علي المدى الطويل. تاثيرها الفقراء علي القضاء علي البروتين الفيروسي ويرجع ذلك إلى عدم وجود تاثير مباشر علي النسخ الفيروسية من الفيروسات الفيروسية بشكل دائري مغلقه الحمض النووي (cccDNA) minichromosomes في نواه الخلايا الكبدية².

يتم تنشيط النسخ HBV من قبل HBV التنظيمية X (HBx) البروتين³. وكشفت الدراسات الحديثة ان hbx يحط من الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، وهو عامل تقييد المضيف الذي يمنع HBV النسخ من cccdna ، عن طريق اختطاف DDB1-CUL4-ROC1 E3 اوبيكويتين يغاز مجمع^4،5،6. ولذلك ، ويعتقد ان خطوه حاسمه في تعزيز النسخ الفيروسي من cccDNA هو التفاعل HBx-DDB1. المركبات القادرة علي تثبيط الربط بين hbx و DDB1 قد منع النسخ الفيروسية ، وفي الواقع تم تحديد نيتازوكسانيد كمثبط للتفاعل hbx-DDB1 عن طريق نظام الفرز المتقدمة في المختبر لدينا⁷.

هنا ، ونحن نقدم نظام الفرز لدينا مريحه تستخدم لتحديد مثبطات التفاعل hbx-DDB1 ، والتي تستخدم المقايسة التكميلية الانقسام لوسيفيراز^7،8. وتنصهر وحدات الوحدات الفرعية لتقسيم لوسيفيراز إلى hbx و DDB1 ، ويجلب تفاعل hbx-DDB1 الوحدات الفرعية إلى القرب القريب لتشكيل انزيم وظيفي يولد اشاره مضيئه ساطعه. وبما ان التفاعل بين الوحدات الفرعية قابل للعكس ، فان هذا النظام يمكنه الكشف بسرعة عن البروتينات DDB1 (الشكل 1). وباستخدام هذا النظام ، يمكن فحص مكتبه مجمعه كبيره بسهوله ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف مركبات جديده قادره علي تثبيط تفاعل DDB1 بكفاءة.

Protocol

ملاحظه: يبين الشكل 1(ا) التمثيل التخطيطي لفحص البيانات التحليلية المجزاه ، وترد عمليه الفحص في الشكل 1باء. ويمكن قياس ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي دون تحلل الخلية.

1. اعداد الخلية

1. الحفاظ علي الخلايا الHEK293Tه المستزرعة في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ v/v الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1x البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية في 20 ٪ O₂ و 5 ٪ CO₂.
2. بذور 5 × 10⁶ خلايا في صحن 100 ملم مع 10 مل من dmem واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
3. Transfect عابره 1 ميكروغرام من HBx و DDB1 مع الluciferases الانقسام في الخلايا وفقا للأسلوب التالي.
   ملاحظه: قد يعتمد مبلغ الحمض النووي البلازميد علي الوصي المستخدم. يجب تحديد الوضع الأمثل لانقسام لوسيفيراز إلى البروتين المستهدف مسبقا. في هذه الحالة, hbx تنصهر إلى lgbit في C-المحطة من hbx (hbx-lgbit) و DDB1 تنصهر إلى smbit في N-تيرمينوس من DDB1 (smbit-DDB1) قدمت أفضل النتائج (اي, ألمع إشارات لوسيفيراز). وقد تم الإبلاغ عن هذه العملية سابقا بالتفصيل⁷.
   1. تمييع 1 ميكروغرام من hbx-lgbit التعبير عن البلازميد الحمض النووي و 1 ميكروغرام من smbit-DDB1 التعبير عن الحمض النووي البلازميد (جدول المواد) في العازلة الحمض النووي التكثيف (جدول المواد) إلى حجم إجمالي 300 μl.
   2. أضافه 16 μL من حل محسن (جدول المواد) ومزيج من vortexing ل 1 s.
   3. احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 3 دقائق.
   4. أضافه 60 μL من الكاشف ترانسفيكشن (جدول المواد) إلى العينة ومزيج من قبل vortexing ل 10 s.
   5. احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 8 دقائق.
   6. اثناء الحضانة ، يستنشق الوسط الثقافي من الطبق (أعدت في الخطوة 1.2) ، ويغسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة (تلفزيوني). أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح وأضافه 7 مل من DMEM.
   7. أضف 3 مل من DMEM إلى الأنبوب الذي يحتوي علي المجمعات الناقلة. اخلطيها بالأنابيب واضفي المجمعات الناقلة إلى الخلية في طبق 10 سم.
4. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية في حاضنه تحت 5 ٪ CO₂ لمده 10 ساعة.
5. Reseed الخلايا في لوحه بيضاء 96 جيدا في 5 × 10⁴ خلايا/بئر في 50 μl متوسطه/جيدا وفقا للأسلوب التالي.
   1. أزلت ال ينفق خليه ثقافة متوسطه ويغسل خلايا مع 5 [مل] من [ببس].
   2. أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح ، أضافه 1 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا ، واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق لفصل الخلايا.
   3. أضافه 4 مل من DMEM وتفريق المتوسطة عن طريق التنضيد علي سطح طبقه الخلية عده مرات. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب.
   4. خلايا الطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
   5. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من تلفزيوني.
   6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة وتجاهل supernatant.
   7. تمييع الخلية بيليه مع مخزنه الخلية المتوسطة الثقافة (الجدول من المواد) تستكمل مع 10 ٪ لكثافة البذر من 1.0 x 10⁶ خلايا/مل.
   8. ماصه 50 μL من تعليق الخلية في كل بئر من لوحه جيده 96 وأعاده الخلايا إلى الحاضنة.
6. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية تحت 5 ٪ CO₂ لمده 10 ساعة.

2. الفحص المركب

1. اثناء الحضانة ، تمييع مركبات الفحص (جدول المواد) والمذيبات (ثنائي ميثيل سولفوكسيد [dmso]) في تركيز 13.5 x. علي سبيل المثال ، إذا كان المخزون هو 10 ملم وتركيز الفرز هو 10 μM ، أضافه 1 μL من الحل الأسهم إلى 73.1 μL من المتوسطة الخلية الثقافة.
2. أضافه 12.5 μL من الركيزة الاناره (جدول المواد) إلى كل بئر واحتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
   ملاحظه: كما الضوابط السلبية ، ينبغي ان الآبار في كلا طرفي لوحه (اي ، الاعمده 1 و 12) لا تحتوي علي الركيزة الاناره.
3. قياس التلالؤ الأساسي باستخدام مقياس الاناره (جدول المواد).
4. مباشره بعد القياس الاولي ، أضافه 5 μL من المركبات والتحكم DMSO المخفف في الخطوة 2.1 إلى كل بئر.
   ملاحظه: سيكون التركيز النهائي 10 μM.
5. قياس قيم التلالؤ كل 30 دقيقه لمده 2 ساعة.
   ملاحظه: يجب احتضان لوحه في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
6. حساب الآثار المثبطة بالمقارنة مع السيطرة DMSO العلاج بعد التطبيع إلى إشارات خط الأساس.
   ملاحظه: يمكن ان يؤدي فحص كل مركب في تكرار أو ثلاث نسخ إلى تقليل التباين.

النتائج

وترد النتائج التمثيلية بعد استخدام هذا البروتوكول في الشكل 2الف وباء. وكانت نسبه الاشاره إلى الخلفية أكبر من 80 وكان عامل Z '⁹ (مؤشر الجودة القياسي الذهبي للفحص العالي الانتاجيه) أكبر من 0.5 ، مما يشير إلى ان نظام الفحص هذا كان مقبولا للف?...

Discussion

قمنا بتطوير طريقه فحص مريحه باستخدام اختبار المسح الذي تم تقسيمه للعثور علي مثبطات DDB1 الملزمة من HBx. ويمكن الكشف عن ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية دون الحاجة إلى تحلل الخلية. تثبيط التفاعل HBx-DDB1 يؤدي إلى استعاده Smc5/6 ، مما يؤدي إلى قمع النسخ الفيروسية ، والتعبير عن البروت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049