זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה להקרנה אנטי צהבת B סוכנים ויראליים לעכב את האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת שיטת. מערכת זו מאפשרת זיהוי קל של אינטראקציות חלבון-חלבון והיא מתאימה לזיהוי מעכבי של אינטראקציות כאלה.

Abstract

יש צורך דחוף סוכנים טיפוליים חדשניים עבור צהבת B וירוס (HBV) זיהום. למרות שהנוקלאונוס הזמינים כרגע (t) מעכבים שכפול ויראלי, אין להם השפעה ישירה על הביטוי של חלבונים ויראליות ששועתק מתוך דנ א ויראלי סגור DNA עגול (cccDNA). כמו לטעון אנטיגן ויראלי גבוהה עשוי לשחק תפקיד זה כרונית ו-HBV הקשורים קרצינובגנזה, המטרה של הטיפול HBV היא לבער חלבונים ויראלי. החלבון HBV התקינה X (HBx) נקשר ל-DNA מארח נזק מחייב חלבון 1 (DDB1) חלבון כדי לבזות תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), וכתוצאה מכך הפעלת תמלול ויראלי מ cccDNA. כאן, באמצעות מפוצל לוציפראז מערכת שיטת הטיפול, אנו מציגים מערכת מקיפה הקרנת מתחם כדי לזהות מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1. הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי קל של הדינמיקה ההדדית בזמן אמת בתוך תאים חיים. טכניקה זו עשויה להפוך להיות מפתח מרכזי כדי לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים לטיפול בזיהום HBV.

Introduction

צהבת B וירוס (HBV) זיהום הוא בריאות הציבור העיקרי הדאגה ברחבי העולם, עם הערכות שנתיות של 240,000,000 אנשים באופן כרוני נגוע HBV ו 90,000 מקרי מוות עקב סיבוכים מן הזיהום, כולל שחמת וקרצינומה hepatocellular (HCC)¹. למרות שהסוכנים הטיפוליים הנוכחיים אנטי-HBV, הנוקלאואים (t) ide, מעכבים מספיק שעתוק ויראלי, הם לרוב משיגים את חיסול החלבונים הנגידיים, שהיא המטרה הקלינית ארוכת הטווח. ההשפעה הירודה שלהם על חיסול חלבון נגיפי נובע היעדר השפעה ישירה על תמלול ויראלי מ epiזומביים ויראלי סגור DNA מעגלי (cccDNA) מיני כרומוזומי בגרעין hepatocyte².

תמלול HBV מופעל ע י חלבון התקינה HBV X (HBx)³. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי HBx מוחלק תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), גורם הגבלה מארח כי חוסם hbv תמלול מ cccdna, באמצעות חטיפת DDB1-CUL4-ROC1 E3 אוביקוויב ליגאז קומפלקס^4,5,6. לכן, צעד מכריע בקידום תמלול ויראלי מ-cccDNA נחשב לאינטראקציה HBx-DDB1. תרכובות מסוגלות לעכב את הכריכה בין HBx ו-DDB1 עשוי לחסום תמלול ויראלי, ואכן nitazoxanide זוהה כמדכא של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת הקרנה שפותחה במעבדה שלנו⁷.

כאן, אנו מציגים את מערכת ההקרנה הנוחה שלנו משמש לזיהוי מעכבי של HBx-DDB1 אינטראקציה, אשר משתמשת מפוצל לוציפראאז שיטה משלימה^7,8. פיצול יחידות משנה מפוצל ל HBx ו DDB1, ואת האינטראקציה HBx-DDB1 מביא את תת היחידות לתוך קרוב ליצור אנזים פונקציונלי שמייצר אות זורח בהיר. כאשר האינטראקציה בין תת היחידות היא הפיכה, מערכת זו יכולה לזהות במהירות HBx-DDB1 חלבונים (איור 1). באמצעות מערכת זו, ספריית מתחם גדול ניתן להקרנה בקלות, אשר עשוי לגרום לגילוי של תרכובות הרומן מסוגל לעכב ביעילות את HBx-DDB1 אינטראקציה.

Protocol

הערה: ייצוג סכמטי של שיטת הפיצול לוציפראז מוצג באיור 1A, ותהליך העיבוד מתואר באיור 1ב. ניתן למדוד את הדינמיקה ההדדית בזמן אמת ללא האפשרות לפירוק תאים.

1. הכנה לתא

1. לשמור על התאים הHEK293T תרבותי ב בינונית הנשר שונה ביותר של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% v/v העובר סרום (FBS), 1x פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° c בתוך 20% O₂ ו 5% CO₂.
2. זרע 5 x 10⁶ תאים לתוך צלחת 100 מ"מ עם 10 מ ל של dmem ו-מודטה ב 37 ° c לילה.
3. Transfect 1 μg של HBx ו DDB1 עם פיצול לוציטיות לתוך התאים בהתאם לשיטה הבאה.
   הערה: כמות העירוי של הדנ א הפלסטי עשויה להיות תלויה בעוצר החצייה שבשימוש. המיקום האופטימלי של מפוצל לוציפראז התמזגו חלבון היעד חייב להיקבע מראש. במקרה זה, HBx התמזגו lgbit ב C-הטרמינוס של HBx (HBx-lgbit) ו DDB1 התמזגו smbit ב-הטרמינוס של DDB1 (smbit-DDB1) סיפק את התוצאות הטובות ביותר (כלומר, אותות ללוציפראז המבריקים ביותר). תהליך זה דווח בעבר בפירוט⁷.
   1. לדלל 1 μg של HBx-LgBit ביטוי ה-DNA פלאמיד 1 μg של SmBit-DDB1 ביטוי ה-DNA פלמיד (טבלת חומרים) ב-dna עיבוי מאגר (טבלת חומרים) לנפח הכולל של 300 μl.
   2. הוסף 16 μL של פתרון שיפור (טבלת חומרים) ולערבב על ידי vortexing עבור 1 s.
   3. מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות.
   4. הוסף 60 μL של העברת מגיב (טבלת חומרים) למדגם ולערבב על ידי vortexing עבור 10 s.
   5. מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות.
   6. במהלך הדגירה, מטפי את המדיום התרבותי ממנה (מוכן בשלב 1.2), ומכבסת תאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). הוצא את PBS על ידי שאיפה והוסף 7 מ ל של DMEM.
   7. הוסיפו 3 מ ג של DMEM לצינור המכיל את מכלולי החצייה. מערבבים באמצעות ליטוף ומוסיפים את מכלולי ההעברה אל התא בצלחת 10 ס מ.
4. דגירה את התאים ב 37 ° c בחממה תחת 5% CO₂ עבור 10 h.
5. Reseed את התאים לתוך צלחת לבן 96 לוחית בגודל 5 x 10⁴ תאים/גם ב 50 μl של בינוני/טוב בהתאם לשיטה הבאה.
   1. הסר את המדיום של תרבות התא שהושקע ושטוף תאים עם 5 מ ל של PBS.
   2. הסר את ה-PBS על ידי השאיפה, להוסיף 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA, ו מודחלת ב 37 ° c עבור 5 דקות לנתק תאים.
   3. הוסף 4 מ ל של DMEM ופזר את המדיום על ידי ליטוף מעל פני השטח של שכבת התא מספר פעמים. . העבר את ההשעיה של התא לשפופרת
   4. בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. . והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מ ל של PBS
   6. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.
   7. לדלל את הגלולה תא עם התרבות התא באגירה בינונית (טבלה של חומרים) שיושלם עם 10% fbs לצפיפות הזריעה של 1.0 x 10⁶ תאים/mL.
   8. פיפטה 50 μL של תא הבולם לתוך כל באר של 96 צלחת הבאר ולהחזיר את התאים לחממה.
6. התאים הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO₂ עבור 10 h.

2. הקרנה מורכבת

1. במהלך הדגירה, לדלל את תרכובות ההקרנה (טבלת חומרים) ו ממס (diמתיל סולפוקסיד [dmso]) בריכוז 13.5 x. לדוגמה, אם המניה היא 10 מ"מ והריכוז ההקרנה הוא 10 μM, להוסיף 1 μL של פתרון מניות כדי 73.1 μL של התרבות התא באגירה בינונית.
2. הוסף 12.5 μL של המצע זורח (טבלה של חומרים) על כל טוב ומארג עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: כפקדים שליליים, הבארות בשני קצות הצלחת (כלומר, עמודות 1 ו-12) לא אמורות להכיל מצע לא זורח.
3. למדוד את האור הבסיסי באמצעות לומימטר (טבלת חומרים).
4. מיד לאחר המדידה הראשונית, להוסיף 5 μL של תרכובות ושליטה DMSO מדולל בשלב 2.1 לכל הבאר.
   הערה: הריכוז הסופי יהיה 10 μm.
5. מדידת ערכי האור כל 30 דקות עבור 2 h.
   הערה: הצלחת להיות מודקת בחושך בטמפרטורת החדר.
6. לחשב את אפקטי העכבות על-ידי השוואה עם טיפול DMSO בקרה לאחר נורמליזציה לאותות בסיסיים.
   הערה: הקרנתכל תרכובת בכפולה או בטרילקאט עלולה להפחית את הווריאציה.

תוצאות

תוצאות הנציג בעקבות השימוש בפרוטוקול זה מוצגות באיור 2א, ב. היחס בין האות לרקע היה גדול מ-80 ו-Z פקטור⁹ (מדד האיכות של הזהב להקרנה בתפוקה גבוהה) היה גדול מ-0.5, והצביע על כך שמערכת שיטה זו הייתה מקובלת עבור הקרנת תפוקה גבוהה. עם הסף שנקבע ל-> ...

Discussion

פיתחנו שיטת הקרנה נוחה באמצעות מפוצל לוציפראז למצוא מעכבי HBx-DDB1 קשירה. הדינמיקה אינטראקציה ניתן לזהות בזמן אמת בתאי החיים ללא צורך בפירוק תאים. עיכוב של HBx-DDB1 אינטראקציה מוביל שחזור של Smc5/6, אשר גורמת לדיכוי של תמלול ויראלי, ביטוי חלבון, ו cccDNA ייצור⁷. זה מנגנון הרומן של פעולה אנטי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049