Выявление ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1 с помощью системы сплит-люциферазы

Резюме

Здесь мы представляем метод скрининга вирусных агентов против гепатита В, которые подавляют взаимодействие HBx-DDB1 с помощью разделенной системы анализов люциферазы. Эта система позволяет легко обнаруживать белково-белковые взаимодействия и подходит для выявления ингибиторов таких взаимодействий.

Аннотация

Существует настоятельная необходимость в новых терапевтических агентах при инфекции, инфицированной вирусом гепатита В (HBV). Хотя в настоящее время доступнынущие нуклеосы (т)ide аналоги мощно подавляют репликацию вируса, они не имеют прямого влияния на выражение вирусных белков, транскрибированных из вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA). Поскольку высокая вирусная нагрузка антигена может играть определенную роль в этом хроническом и HBV-связанных канцерогенеза, цель лечения HBV является искоренение вирусных белков. HBV регулятивного белка X (HBx) связывается с хозяином ДНК-связывающего белка 1 (DDB1) белка для деградации структурного поддержания хромосом 5/6 (Smc5/6), в результате активации вирусной транскрипции от cccDNA. Здесь, используя систему проверки дополнения разделенной люциферазы, мы представляем комплексную комплексную систему скрининга для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1. Наш протокол позволяет легко обнаруживать динамику взаимодействия в режиме реального времени в живых клетках. Этот метод может стать ключевым ассеем, чтобы обнаружить новые терапевтические агенты для лечения HBV инфекции.

Введение

Инфекция вируса гепатита В (HBV) является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, с ежегодными оценками 240 миллионов человек, хронически инфицированных HBV и 90000 смертей из-за осложнений от инфекции, в том числе цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)¹. Хотя нынешние анти-HBV терапевтические агенты, нуклеосы (т) аналоги, достаточно подавляют вирусную обратную транскрипцию, они редко достигают ликвидации вирусных белков, что является долгосрочной клинической целью. Их плохое влияние на устранение вирусного белка из-за их отсутствия прямого влияния на вирусную транскрипцию от эпизомальной вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA) минимомосомы в ядре гепатоцитов².

Транскрипция HBV активируется HBV регулятивным X (HBx) белком^3. Недавние исследования показали, что HBx деградирует структурное обслуживание хромосом 5/6 (Smc5/6), фактор ограничения хозяина, который блокирует Транскрипцию HBV от cccDNA, через угон DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin лигазе комплекс^4,5,6. Таким образом, решающим шагом в продвижении вирусной транскрипции от cccDNA считается взаимодействие HBx-DDB1. Соединения, способные ингибировать связывание между HBx и DDB1 может блокировать вирусную транскрипцию, и действительно нитазоксанид был определен в качестве ингибитора взаимодействия HBx-DDB1 через систему скрининга, разработанную в нашей лаборатории⁷.

Здесь мы представляем нашу удобную систему скрининга, используемую для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1, которая использует разделенный люциферазы комплементарный анализ^7,8. Сплит luciferase субъединиц сливается с HBx и DDB1, и взаимодействие HBx-DDB1 приносит подразделения в непосредственной близости к форме функционального фермента, который генерирует яркий люминесцентный сигнал. Поскольку взаимодействие между подразделениями обратимо, эта система может обнаруживать быстро диссоциирующие белки HBx-DDB1(рисунок 1). С помощью этой системы можно легко проверить большую библиотеку соединений, что может привести к открытию новых соединений, способных эффективно ингибировать взаимодействие HBx-DDB1.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление сплит-люциферазы асссея показано на рисунке 1A,и процесс проверки изложен на рисунке 1B. Динамика взаимодействия может измеряться в режиме реального времени без клеточного лиза.

1. Подготовка клеток

1. Поддержание культивированных клеток HEK293T в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнены 10% v/v сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1x пенициллина/стрептомицина при 37 КК в 20% O₂ и 5% CO₂.
2. Семя 5 х 10⁶ ячеек в 100 мм блюдо с 10 мл DMEM и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
3. Переходно пресловуто 1 мкг HBx и DDB1 с разделенными люциферасами в клетки в соответствии со следующим методом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество плазмидной ДНК трансфицируется может зависеть от трансфекционного регента используется. Оптимальное положение сплит-люциферазы, сросанного с целевым белком, должно быть определено заранее. В этом случае HBx, слитый с LgBit на C-терминах HBx (HBx-LgBit) и DDB1, слитый с SmBit на N-термине DDB1 (SmBit-DDB1), обеспечил наилучшие результаты (т.е. самые яркие сигналы люциферазы). Этот процесс был сообщен ранее подробно⁷.
   1. Разбавить 1 мкг HBx-LgBit, выражающий плазмид ДНК и 1 мкг SmBit-DDB1, выражающий плазмид ДНК(Таблица материалов)в буфере конденсации ДНК(Таблица материалов) в общей объеме 300 зл.
   2. Добавьте 16 зл усилитель раствора(Таблица материалов)и перемешайте путем вихря в течение 1 с.
   3. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 3 мин.
   4. Добавьте 60 кЛ трансфекционного реагента(Таблица материалов)в образец и смешайте путем вихря в течение 10 с.
   5. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 8 мин.
   6. Во время инкубации, аспирируют культурную среду из тарелки (подготовленной в шаге 1.2) и мыть клетки с 5 мл фосфат-буферизированного соления (PBS). Удалить PBS по аспирации и добавить 7 мл DMEM.
   7. Добавьте 3 мл DMEM в трубку, содержащую трансфекционные комплексы. Смешайте путем пипетки и добавьте трансфекционные комплексы на клетку в тарелке 10 см.
4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе под 5% CO₂ на 10 ч.
5. Пересить клетки в белый 96 хорошо пластины на 5 х 10⁴ клетки / хорошо в 50 Л л среднего / хорошо в соответствии со следующим методом.
   1. Удалите отработанные среды культуры клеток и мыть клетки с 5 мл PBS.
   2. Удалить PBS по аспирации, добавить 1 мл 0,25% трипсин-EDTA, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы отделить клетки.
   3. Добавьте 4 мл DMEM и разогнать среду, несколько раз протянив по поверхности слоя клетки. Перенесите суспензию клетки в трубку.
   4. Центрифуги клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Откажитесь от супернатанта и отрепримите клеточные гранулы в 1 мл PBS.
   6. Центрифуги яточной подвески на 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отбросить супернатант.
   7. Разбавить клеточные гранулы с буферизированной средой культуры клеток(Таблица Материалов)дополнены 10% FBS к плотности посева 1,0 х 10⁶ клеток/мл.
   8. Пипетка 50 зл клеточной подвески в каждой скважине 96 хорошо пластины и вернуть клетки в инкубатор.
6. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия под 5% CO₂ на 10 ч.

2. Комплексный скрининг

1. Во время инкубации разбавить скрининговые соединения(Таблица материалов)и растворитель (диметилсульфоксид (DMSO) при концентрации 13,5x. Например, если запас составляет 10 мМ, а концентрация скрининга составляет 10 мкм, добавьте 1 кЛ стокового раствора к 73,1 л буферизированной среды культуры клеток.
2. Добавьте 12,5 л люминесцентного субстрата(Таблица материалов)к каждой скважине и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как отрицательный контроль, скважины на обоих концах пластины (т.е. колонны 1 и 12) не должны содержать люминесцентный субстрат.
3. Измерьте светимость исходного состава с помощью люминометра(Таблица материалов).
4. Сразу же после первоначального измерения добавьте 5 зЛ соединений и контролируйте DMSO, разбавленное в шаге 2.1 к каждой скважине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация будет 10 мкм.
5. Измерьте значения люминесценции каждые 30 минут в течение 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть инкубирована в темноте при комнатной температуре.
6. Рассчитайте ингибирующие эффекты по сравнению с контролем лечения ДМСО после нормализации к исходным сигналам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг каждого соединения в дублировать или тройной может уменьшить вариации.

Результаты

Репрезентативные результаты после использования этого протокола показаны на рисунке 2A,B. Соотношение сигнала к фону превышало 80, а коэффициент⁹ (индекс качества золотого стандарта для скрининга с высокой пропускной стоимостью) п?...

Обсуждение

Мы разработали удобный метод скрининга с использованием разделенной люциферазы, чтобы найти ингибиторы связывания HBx-DDB1. Динамика взаимодействия может быть обнаружена в режиме реального времени в живых клетках без необходимости в клеточном лизах. Ингибирование взаимодействия HBx-DDB1 п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049