使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂

摘要

在这里，我们提出了一种使用裂解荧光素酶检测系统来抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统易于检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于识别此类相互作用的抑制剂。

摘要

迫切需要新的治疗乙型肝炎病毒（HBV）感染的治疗方法。虽然目前可用的核细胞（t）ide类比能有效抑制病毒复制，但它们对从病毒共价闭环DNA（cccDNA）转录的病毒蛋白的表达没有直接影响。由于高病毒抗原负荷可能在这个慢性和HBV相关的致癌作用，HBV治疗的目标是根除病毒蛋白。HBV调节蛋白X（HBx）与宿主DNA损伤结合蛋白1（DDB1）蛋白结合，降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，导致从cccDNA激活病毒转录。在这里，使用裂化荧光素酶补充测定系统，我们提出了一个全面的化合物筛选系统，以识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂。我们的协议能够轻松检测活细胞内的相互作用动力学。这项技术可能成为发现治疗HBV感染的新治疗剂的关键测定方法。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界一个重大的公共卫生问题，每年估计有2.4亿人长期感染乙肝病毒，9万人死于感染并发症，包括肝硬化和肝细胞癌^{（HCC）1。}虽然目前抗HBV治疗剂，核细胞（t）类比，足以抑制病毒逆转录，但它们很少实现病毒蛋白的消除，这是长期的临床目标。它们对病毒蛋白消除的不良影响是因为他们对肝细胞核²中表皮病毒共价闭合环DNA（cccDNA）小染色体的病毒转录缺乏直接影响。

HBV转录由HBV调节X（HBx）蛋白³激活。最近的研究表明，HBx通过劫持DDB1-CUL4-ROC1 E3泛素结合酶复合^{物4，5，6，}降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，这是阻止HBV转录从cccDNA的宿主限制因子。因此，促进来自cccDNA的病毒转录的关键步骤被认为是HBx-DDB1相互作用。能够抑制HBx和DDB1之间结合的化合物可以阻断病毒转录，事实上，硝基氧烷通过实验室⁷开发的筛选系统被确定为HBx-DDB1相互作用的抑制剂。

在这里，我们介绍我们方便的筛选系统，用于识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂，它利用裂性荧光素酶补充测定^7，8。裂化荧光素酶亚单位与HBx和DDB1融合，HBx-DDB1相互作用使亚单位接近，形成产生明亮发光信号的功能酶。由于亚单位之间的相互作用是可逆的，该系统可以检测迅速分离的HBx-DDB1蛋白（图1）。利用该系统，可以很容易地筛选大型化合物库，从而发现能够有效抑制HBx-DDB1相互作用的新型化合物。

研究方案

注:图1A显示了裂解荧光素酶测定的示意图表示，如图1B所示。图1B概述了测定过程。 相互作用动力学可以实时测量，无需细胞分变。

1. 细胞制备

1. 在Dulbeco的改性Eagle培养基（DMEM）中保持培养的HEK293T细胞，辅以10%v/v胎儿牛血清（FBS），1x青霉素/链霉素在37°C，在20%O₂和5%CO₂中。
2. 种子 5 x 10⁶细胞放入 100 mm 的培养皿中，其 DMEM 为 10 mL，并在 37°C 下孵育过夜。
3. 根据以下方法，用裂化荧光素酶将HBx和DDB1的瞬时转染1μg进入细胞。
   注:质粒DNA转染的量可能取决于所使用的转染。与靶蛋白融合的裂性荧光素酶的最佳位置必须事先确定。在这种情况下，HBx 在 HBx （HBx-LgBit） 的 C 端与 LgBit 融合，DDB1 在 DDB1 的 N 端（SmBit-DDB1）与 SmBit 融合，提供了最佳结果（即最亮的荧光素酶信号）。此过程之前已详细报告⁷。
   1. 在DNA冷凝缓冲液（材料表）中稀释1μg的HBx-LgBit表达DNA质粒和1μgSmBit-DDB1表达DNA质粒（材料表），总体积为300μL。
   2. 加入16μL的增强剂溶液（材料表），通过涡旋混合1s。
   3. 在室温下孵育样品3分钟。
   4. 将60μL转染试剂（材料表）加入样品，通过涡旋混合10s。
   5. 在室温下孵育样品8分钟。
   6. 在孵育期间，从培养基盘中吸出培养基（在步骤1.2中制备），用5 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。通过吸入移除 PBS 并添加 7 mL 的 DMEM。
   7. 在含有转染复合物的管中加入3 mL的DMEM。通过移液混合，并将转染复合物添加到10厘米盘中的细胞中。
4. 在5%CO2以下的培养箱中，在37°C下孵育细胞10小时。
5. 根据以下方法，在 5 x 10⁴细胞/孔 50 μL 的介质/孔中，将细胞重新播种到白色 96 孔板中。
   1. 去除废细胞培养基，用5 mL的PBS洗涤细胞。
   2. 通过吸入去除PBS，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C孵育5分钟以分离细胞。
   3. 加入4 mL的DMEM，通过多次移液在细胞层表面分散介质。将细胞悬浮液转移到管子上。
   4. 在室温下，在500 x g下离心细胞5分钟。
   5. 丢弃上清液，在1mL的PBS中重新悬浮细胞颗粒。
   6. 在室温下将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
   7. 用缓冲细胞培养基（材料表）稀释细胞颗粒，辅以10%FBS，种子密度为1.0 x 10⁶细胞/mL。
   8. 将50μL的细胞悬浮液放入96孔板的每个孔中，并将细胞返回到孵化器。
6. 在37°C下孵育细胞，在5%CO₂下孵育10小时。

2. 化合物筛选

1. 在孵育过程中，以13.5倍的浓度稀释筛选化合物（材料表）和溶剂（二甲基磺酸二氧化硫[DMSO]）。例如，如果库存为 10 mM，筛选浓度为 10 μM，则向缓冲细胞培养基的 73.1 μL 中添加 1 μL 的库存溶液。
2. 在每个井中加入12.5 μL的发光基板（材料表），并在室温下孵育5分钟。
   注:作为负控制，板两端的孔（即1和12柱）不应含有发光基板。
3. 使用光度计（材料表）测量基线发光。
4. 在初始测量后，立即添加 5 μL 的化合物，并在步骤 2.1 中控制分量DMSO稀释到每个井中。
   注:最终浓度为10μM。
5. 每 30 分钟测量一次发光值 2 小时。
   注:板应在室温下在黑暗中孵育。
6. 在归一化基线信号后，通过与对照 DMSO 处理进行比较，计算抑制效果。
   注:在重复或三联中筛选每种化合物可以减少变异。

结果

使用该协议后的代表性结果如图2A，B所示。信背景比大于80，Z'因子^9（高通量筛选的黄金标准质量指数）大于0.5，表明该检测系统对于高通量筛选是可以接受的。与对照组（仅限DMSO）相比，阈值设置为>40%抑制，我们确定硝基氧烷为候选药物^7。使用这个系统，通过筛选其他更大的化合物库可以找到更好...

讨论

我们开发了一种方便的筛选方法，使用裂光酶测定法来发现HBx-DDB1结合抑制剂。相互作用动力学可以在活细胞中实时检测，而无需细胞变热。抑制HBx-DDB1相互作用导致Smc5/6的恢复，导致抑制病毒转录，蛋白质表达和cccDNA生产⁷。这种新的抗病毒作用机制可以克服目前HBV疗法的不足。

虽然有许多方法可用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，但检查这些相?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049