JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، ونحن نصف أداة تحرير الجينوم على أساس الاستقرار الزمني والمشروط من تتجمع بانتظام تكرار palindromic قصيرة متباعدة- (CRISPR-) البروتين المرتبطة 9 (Cas9) تحت جزيء صغير، الدرع-1. ويمكن استخدام هذه الطريقة للخلايا المستزرعة والنماذج الحيوانية.

Abstract

أصبحت تكنولوجيا تكرار palindromic القصيرة المتجمعة بانتظام (CRISPR-) المرتبطة بالبروتين 9 (CRISPR/Cas9) أداة مختبرية سائدة لإدخال تعديلات دقيقة ومستهدفة في الجينوم. ويعزى شعبيته الهائلة وانتشار سريع إلى سهولة استخدامها ودقة بالمقارنة مع سابقاتها. ومع ذلك، فإن التنشيط التأسيسي للنظام له تطبيقات محدودة. في هذه الورقة، ونحن نصف طريقة جديدة تسمح السيطرة الزمنية للنشاط CRISPR/Cas9 على أساس الاستقرار المشروط للبروتين Cas9. دمج متحولة هندسية من البروتين rapamycin ملزمة FKBP12 إلى Cas9 (DD-Cas9) تمكن من التدهور السريع للكاس9 التي بدورها يمكن أن تستقر من خلال وجود ليغاند الاصطناعية FKBP12 (الدرع-1). على عكس الطرق الأخرى غير القابلة للانتهاك ، يمكن تكييف هذا النظام بسهولة لتوليد أنظمة ثنائية ال سيسترونيك للتعبير المشترك عن DD-Cas9 مع جين آخر من الاهتمام ، دون تنظيم مشروط للجين الثاني. تمكن هذه الطريقة من توليد أنظمة يمكن تتبعها بالإضافة إلى التلاعب المستقل الموازي بال alleles المستهدفة من قبل نواة Cas9. ويمكن استخدام منصة هذه الطريقة لتحديد وتوصيف الجينات الأساسية بشكل منهجي واستجواب التفاعلات الوظيفية للجينات في المختبر وفي البيئات الحية.

Introduction

CRISPR-Cas9 الذي يرمز إلى "تتجمع بانتظام باليندروميك قصيرة يكرر البروتين المرتبطة 9" اكتشفت لأول مرة كجزء من الدراسات على مناعة التكيف البكتيري1،2. اليوم، أصبح CRISPR/Cas9 الأداة الأكثر شهرة لتحرير الجينات القابلة للبرمجة وتم تطوير تكرارات مختلفة للنظام للسماح بالتعديلات النسخية واللاجينية3. هذه التكنولوجيا تمكن التلاعب الجيني دقيقة للغاية من أي تسلسل تقريبا من الحمض النووي4.

المكونات الأساسية لأي تحرير الجينات CRISPR هي تسلسل الحمض النووي الريبي دليل للتخصيص ونوكليا Cas95. يرتبط دليل الحمض النووي الريبي بالتسلسل التكميلي المستهدف في الحمض النووي ، ويوجه نواة Cas9 لأداء كسر مزدوج في نقطة محددة في الجينوم3،4. ثم يتم إصلاح موقع الانقسام الناتج عن طريق الربط النهائي غير المتجانس (NHEJ) أو الإصلاح الموجه بالهومولوجيا (HDR) ، مع إدخال تغييرات لاحقة في تسلسل الحمض النووي المستهدف5.

CRISPR /Cas9 القائم على تحرير الجينات سهلة الاستخدام، وغير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع تقنيات تحرير الجينات السابقة، وقد ثبت أن تكون فعالة وقوية على حد سواء في تعدد النظم2،4،5. ومع ذلك، فإن النظام يفرض بعض القيود. التعبير التأسيسي لل Cas9 كثيرا ما تبين أن يؤدي إلى زيادة عدد من خارج الأهداف وارتفاعسميةالخلية 4 ،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستهداف التأسيسي لجينات البقاء على قيد الحياة الأساسية والخلايا من قبل Cas9 يأخذ من قدرته على إجراء أنواع معينة من الدراسات الوظيفية مثل الدراسات الحركية لوفاة الخلية7.

وقد تم تطوير أدوات مختلفة غير قابلة للانعزال أو تسيطر عليها مشروط CRISPR-Cas9 لمعالجة تلك القضايا6، مثل تيت أون وتيت أوف9؛ إعادة التركيب الخاصة بالموقع10; القرب الناجم كيميائيا11; intein الربط التابعة3; و 4-هيدروكسيتاموكسيفين الإستروجين مستقبلات (ER) القائم على أنظمة التعريب النووي12. بشكل عام ، فإن معظم هذه الإجراءات (الربط intein وأنظمة تقسيم القرب الناجمة كيميائيا) لا توفر تحكما قابلا للعكس ، أو تقدم استجابة حركية بطيئة جدا للعلاج الدوائي (نظام Tet-On / Off) ، أو غير قابلة للتلاعب عالي الإنتاجية6.

ولمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير مجموعة أدوات جديدة لا توفر تحرير الجينات السريع والقوية التي يتم التحكم فيها زمنيا فحسب، بل تضمن أيضا إمكانية التتبع، والقابلية للتتبع، والقدرة على الثبات، والقدرة على التلاعب الجيني عالي الإنتاجية. يمكن استخدام هذه التكنولوجيا الجديدة في خطوط الخلايا ، والأعضاء ، والنماذج الحيوانية. ويستند نظامنا على نطاق هندسي، عندما تنصهر في Cas9، فإنه يحفز تدهورها السريع. ومع ذلك، يمكن استقراره بسرعة مع جزيء صغير انتقائي للغاية، غير سام، نفاذية الخلية. وبشكل أكثر تحديدا، قمنا بهندسة FKBP12 الإنسان متحولة "المجال المزعزع للاستقرار" (DD) إلى Cas9، بمناسبة Cas9 للتدهور السريع والتكويني عن طريق نظام ubiquitin-proteasome عندما أعرب في خلايا الثدييات13. يمكن ليغاند DD الاصطناعية، درع-1 استقرار تشكيل DD، وبالتالي منع تدهور البروتينات تنصهر إلى DD (مثل Cas9) بطريقة فعالة جدا، ومع استجابة الحركيةالسريعة 14،15. من الجدير بالذكر، يربط Shield-1 بثلاثة أوامر من الحجم أكثر إحكاما إلى FKBP12 متحولة من نظيرتها البرية من نوع14.

يمكن استخدام زوج DD-Cas9/Shield-1 لدراسة التحديد المنهجي وتوصيف الجينات الأساسية في الخلايا المستزرعة والنماذج الحيوانية كما أظهرنا سابقا من خلال الاستهداف المشروط لجين CypD ، الذي يلعب دورا مهما في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ؛ EGFR، لاعب رئيسي في التحول أونوجينيك؛ و Tp53، جين مركزي في الاستجابة لتلف الحمض النووي. بالإضافة إلى تحرير الجينات مؤقتا ومشروطا، ميزة أخرى من هذه الطريقة هو أن استقرار DD-Cas9 مستقلة عن النسخ. هذه الميزة تمكن التعبير المشترك، تحت نفس المروج، من علامات يمكن تتبعها، فضلا عن recombinases، مثل recombinase مستقبلات هرمون الاستروجين تعتمد، CREER. في هذا العمل، نظهر كيف يمكن استخدام طريقتنا بنجاح في المختبر، لاستهداف مشروط على سبيل المثال، جين تكرار الحمض النووي، RPA3.

Protocol

1.the DD-Cas9 متجه

  1. الحصول على ناقلات DD-Cas9 من أدجين (DD-Cas9 مع تسلسل حشو وفينوس (EDCPV)، بلازميد 90085).
    ملاحظة: هذا هو العدسي DD-Cas9 plasmid مع المروج U6 الذي يدفع نسخة RNA دليل واحد (sgRNA) في حين أن المروج EFS يدفع النسخ DD-Cas9. تسلسل DYKDDDDK (علامة العلم) موجود في المحطة C من Cas9 تليها 2A الببتيد الذاتي المشقوق (P2A) الذي يفصل بين DD-Cas9 والبروتين الفلوري المعدل فينوس (mVenus).

2. دليل صغير RNA (SgRNA) تصميم

  1. تصميم دليل صغير الجيش الملكي النيبالي (sgRNA) التي سيتم استنساخها في ناقلات DD-Cas9 باستخدام واحدة من عدة خوارزميات، واستهداف منطقة الجينوم محددة.
    ملاحظة: لتقليل التأثيرات خارج الهدف، حدد تسلسلات sgRNA بأعلى الدرجات باستخدام موقع الويب: http://crispr.mit.edu.
  2. تصميم وطلب اثنين oligonucleotides لكل تسلسل SgRNA لجعل sgRNA كاملة.
    ملاحظة: بما أنه سيتم هضم البلازميد بواسطة إنزيم BsmBI ، قم بتصميم أوليغونوكليوتيد الأمام والعكس عن طريق إضافة تراكمات هضم BsmBI إلى تسلسل sgRNA. استخدم القالب من الجدول 1.

3. استنساخ sgRNA في ناقلات DD-Cas9 العدسية

  1. Dephosphorylate 5′-ينتهي من د د-Cas9 البلازميد باستخدام فوسفاتاز قلوية (FastAP) في رد فعل تقييد الهضم الإنزيم.
    ملاحظة: يمكن إعادة تعميم المتجهات أثناء الربط خاصة عندما تكون خطية بواسطة إنزيم تقييد واحد. لضمان عدم إعادة تعميم المتجه ، قم بإزالة الفوسفوريلات من البلازميد عن طريق إضافة فوسفاتاز مباشرة إلى تفاعل الهضم.
    1. Dephosphorylate وهضم البلازميد مع انزيم BsmBI عن طريق إعداد مزيج من 5 ميكروغرام من د د- Cas9 البلازميد، 6 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم (10x)، 0.6 ميكرولتر من DTT (100 mM)، 3 ميكرولتر من BsmBI، 3 ميكرولتر من FastAP، إضافة ما يصل إلى 60 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز لجعل 60 ميكرولتر من إجمالي حجم التفاعل.
      ملاحظة: إضافة إنزيم BsmBI وFastAP إلى الخليط في النهاية.
    2. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في كتلة الحرارة 37 درجة مئوية أو thermocycler.
  2. تنقية هضم DD-Cas9 البلازميد.
    1. إعداد هلام Agarose الحمض النووي 0.8٪ لإزالة البلازميد هضم غير مكتملة وآثار الإنزيمات. استخدام أوسع هلام مشط لفصل أفضل وتشغيل هلام في 90 V.
    2. تصور العصابات تحت 360-365 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية وقطع الفرقة plasmid أكبر من هلام. تجاهل جزء كيلو بايت 2 الذي يتوافق مع حشو.
    3. تنقية قطع كبيرة هلام النطاق باستخدام عدة تنقية هلام التجارية واتبع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. ليغيت أوليغوس مع هضم DD-Cas9 البلازميد.
    1. الفوسفوريلات والصلب oligos sgRNA.
      1. إعداد مزيج من 1 ميكرولتر من T4 الربط العازلة (10x)، 1 ميكرولتر من أوليغو 1 (100 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر من أوليغو 2 (100 ميكرومتر)، 6.5 ميكروغرام من المياه الخالية من النيوكليز. وأخيرا، أضف 0.5 ميكرولتر من T4 PNK. الحجم الإجمالي لرد الفعل هذا هو 10 ميكرولتر.
      2. أضف مزيج التفاعل إلى المدور الحراري مع الشروط التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم قم بزاوية 25 درجة مئوية بسرعة 5 درجات مئوية/دقيقة.
        ملاحظة: يجب أن تكون PNK الحرارة معطلة قبل أن يتم وضع oligonucleotides في الربط وإلا فإن PNK سوف الفوسفور المتجه. يتم تنفيذ خطوة الفوسفور وخطوة التلين معا في دراجة حرارية. خطوة الفوسفور حيث يتم إضافة 5 'الفوسفات إلى oligonucleotides SgRNA مطلوبة للربط أن يحدث.
    2. ليجيت DD-Cas9 هضم البلازميد وsgRNA أوليغوس.
      1. تمييع أوليغوس الصلب إلى 1:200 في الماء الخالي من النيوكليز واستخدام 50 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد في رد فعل الربط.
        ملاحظة: استخدم نسبة الضرس للأدخال 6: 1 متجه، لتعزيز إدراج التكامل أو استخدام آلة حاسبة ربط لحساب نسبة الضرس: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. إعداد مزيج رد فعل الربط: 50 نانوغرام من ناقلات DD-Cas9 المهضومة والمنقية، والحجم المناسب من أوليغوس الصلب المخفف، 1 ميكرولتر من T4 الربط العازلة (10x)، 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغانيس، تصل إلى 10 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكلياز للحصول على الحجم الإجمالي للتفاعل 10 ميكرولتر.
      3. إذا كنت تستخدم "تركيز عال" ليغانس، احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. خلاف ذلك، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة، أو لتحقيق عائد أعلى من الربط، واحتضان في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
        ملاحظة: الحرارة تعطيل إذا باستخدام معيار T4 الحمض النووي ليغانيس في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لا الحرارة inactivate إذا كنت تستخدم يمزج سيد ليجاز.

4. التحول البكتيري

  1. لوحات أجار LB-ampicillin قبل الدافئة 10 سم في درجة حرارة الغرفة.
  2. تذوب 50 ميكرولتر من "طلقة واحدة Stbl3" الخلايا البكتيرية المختصة على الجليد.
  3. إضافة 2-3 ميكرولتر من خليط الربط إلى 50 ميكرولتر من الخلايا البكتيرية المختصة وتخلط بلطف عن طريق النقر على الجزء السفلي من الأنبوب بإصبع 4 مرات. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. الحرارة صدمة الخلايا في بالضبط 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية، وذلك باستخدام جهاز توقيت. تبريد الخلايا البكتيرية على الجليد لمدة 5 دقائق.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام SOC دون المضادات الحيوية إلى الخلايا البكتيرية وتنمو لهم في حاضنة تهتز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة، في 37 درجة مئوية.
  6. انتشار 100 ميكرولتر من البكتيريا المتحولة على لوحات LB-ampicillin الدافئة قبل واحتضانها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

5. مصغرة / ماكسي الإعدادية من بلازميد ليغاند

  1. إعداد ثقافة ماكسي / الإعدادية الإعدادية المبتدئين.
    1. في اليوم التالي اختيار استنساخ بكتيري واحد وتطعيم ثقافة بداية مع 8 مل من وسائل الإعلام LB التي تحتوي على الأمبيسلين.
    2. تنمو البكتيريا في حاضنة تهتز في 250 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 10-12 ساعة.
    3. استخدام 3-5 مل من البكتيريا لصغرى الإعدادية أو استخدامه كثقافة بداية لماكسي الإعدادية. استخدام بقية البكتيريا ك الجرزفيرول الجرثومية الأسهم بإضافة 100٪ الجلسرين في نسبة الثقافة البكتيرية:الجلسرين هو 1:1.
      ملاحظة: هنا، سوف نصف الإجراء الإعدادية المصغرة.
  2. إجراء الإعدادية المصغرة
    1. حصاد 3-5 مل من الخلايا البكتيرية والطرد المركزي في 12000 × غرام لمدة دقيقة واحدة.
    2. إعادة ضغط بيليه الخلايا البكتيرية مع 200 ميكرولتر من العازلة P1، التي تحتوي على RNase A وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة P2 وتخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب 10 مرات حتى يوضح السائل.
    4. إضافة 300 ميكرولتر من العازلة P3 وتخلط عن طريق عكس الأنبوب 10 مرات. السائل سيصبح غائما المضي قدما على الفور مع الطرد المركزي العينات في 12000 س غ لمدة 10 دقائق.
    5. نقل supernatant واضحة لعمود تدور والطرد المركزي في 12000 × ز لمدة 1 دقيقة.
      تجاهل التدفق من خلال.
      ملاحظة: تأكد من توضيح الفائقة. يمكن للجسيمات تسد العمود تدور والحد من فعالية العمود.
    6. أضف 400 ميكرولتر من العازلة PD والطرد المركزي في 12000 x ز لمدة دقيقة واحدة. تجاهل التدفق من خلال.
    7. أضف 600 ميكرولتر من العازلة PW لغسل العمود تدور والطرد المركزي في 12000 س ز لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
    8. الطرد المركزي مرة أخرى العمود تدور في سرعة قصوى لمدة 3 دقائق لإزالة بقايا العازلة. تجاهل تدفق من خلال والسماح لها الجلوس لمدة 2 دقيقة.
    9. ضع عمود الدوران إلى أنبوب جديد وأضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لل elution. حضانة لمدة 5 دقائق والطرد المركزي في سرعة قصوى لمدة 2 دقيقة.
    10. استخدم جهاز الإنزال النانوي لقياس تركيز د.د-كاس9 البلازميد المنقى مع إدخال الزنجنا (نانوغرام/ميكرولتر).
  3. التحقق من صحة الاستنساخ SgRNA عن طريق تسلسل الحمض النووي من البلازميد DD-Cas9. استخدم تسلسل التمهيدي U6 في الجدول 2.

6. إعداد لينتيفيرال

  1. إعداد خلايا التعبئة والتغليف HEK293T لtransfection.
    1. استخدام صحي HEK293T تصل إلى مرور 10 والبذور لهم بالتساوي في كثافة 1-2 × 106 خلايا لكل 10 سم لوحة زراعة الأنسجة. استخدام 10 مل من الجلوكوز Dulbecco المعدلة النسر المتوسط (DMEM) مع 10٪ مصفيه مصل البقر الجنين (FBS). احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة، بنسبة 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
    2. في اليوم التالي، تأكد من أن الخلايا وصلت إلى التقاء 70٪ عن طريق المجهر برايتفيلد وأنها موزعة بالتساوي عبر لوحة. تغيير الوسائط إلى خلايا 1 ساعة قبل التحويل مع الحجم النهائي من 10 مل.
      ملاحظة: يجب أن تكون الوسائط غائبة عن المضادات الحيوية ومضادات الذهان.
    3. إعداد خليط من 2 أنابيب مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدافئة (على سبيل المثال، OptiMEM).
      1. أضف 25 ميكرولتر من كاشف العدوى إلى الأنبوب 1 الذي يحتوي على 500 ميكرولتر دافئ من الوسائط، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. وفي الوقت نفسه إعداد مزيج من البلازميدات إلى أنبوب 2 تحتوي على 3.5 ميكروغرام من DD-Cas9 التي تحتوي على sgRNA المستنسخة، 6 ميكروغرام من البلازميد التعبئة والتغليف (psPAX2)، و 3 ميكروغرام من البلازميد المغلف (pMD2.G) في 500 ميكرولتر دافئة من وسائل الإعلام.
      3. مزيج أنبوب 1 مع أنبوب 2 لتشكيل خليط transfection واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      4. دروبيوايز خليط العدوى إلى خلايا HEK293T ولوحة حضانة في حاضنة زراعة الأنسجة، في 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      5. بعد 18 ساعة، تغيير وسائل الإعلام بعناية إلى 10 مل من DMEM الطازجة مع 10٪ FBS لإزالة كاشف العدوى. حضانة ل48 ساعة القادمة.
      6. بعد 48 ساعة، وجمع supernatant مع حقنة 10 مل وتمريرها من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
      7. Aliquot وتخزين الفيروس الفائقة في -80 درجة مئوية.

7. تحديد تيتر الفيروس وفعالية النقل مع تدفق قياس الخلايا

  1. البذور خلايا HEK293T مع 5 × 105 خلايا / جيدا في لوحة 6 جيدا. خلايا البذور في اثنين من لوحات 6-جيدا. استخدام لوحة واحدة لحساب اليوم التالي.
  2. احتضان لوحات في الحاضنة في 37 درجة مئوية، 95٪ الرطوبة، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها للوصول إلى 50-60٪ التقاء في اليوم التالي.
  3. في اليوم التالي، استخدم إحدى الصفائح ذات 6 آبار لحساب الخلايا الموجودة في 6 آبار.
  4. تذوب aliquot الفيروس التي سيتم استخدامها لأداء التخفيف التسلسلي وإضافة 8 ميكروغرام / مل من كاشف البوليبرين.
  5. إعداد DMEM مع 10٪ FBS لتخفيف المسلسل من الفيروس وإضافة 8 ميكروغرام / مل من كاشف البوليبرين.
  6. إعداد 2 مل من عشر مرات المخففات التسلسلية من الفيروس العدسي من 1 × 10-1 إلى 1 × 10-4 في الوسائط المحتوية على البوليبرين.
  7. إزالة الوسائط من لوحة 6-جيدا وإضافة 1 مل من التخفيفات الفيروسية إلى الآبار. ترك واحد جيدا مع وسائل الإعلام وحدها والسيطرة السلبية واحدة بشكل جيد مع الفيروس 100٪.
  8. احتضان الخلايا مع الفيروس في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
  9. في اليوم التالي، إزالة وسائل الإعلام مع الفيروس من لوحات 6-جيدا وتغييره ل2 مل من DMEM الطازجة مع FBS 10٪. احتضان الخلايا لمدة 48-72 ساعة. مراقبة GFP باستخدام المجهر الفلورسنت كل يوم.
  10. بعد 48-72 ساعة، فصل الخلايا وإعادة إنفاقها في المخزن المؤقت MACS.
  11. استخدم مقياس تدفق الخلايا لتحديد النسبة المئوية لتعبير GFP.
  12. حساب titer الفيروس باستخدام الصيغة التالية: TU / مل = (عدد الخلايا التي تم تحويلها x في المئة الفلورسنت x معامل التخفيف)/(حجم النقل في مل)

8. تحويل الخلايا المستهدفة إلى حد كبير

  1. لوحة خط الخلية من الفائدة إلى لوحة 10 سم واحتضان بين عشية وضحاها للوصول إلى التقاء 50-60٪ في اليوم التالي.
    ملاحظة: استخدمنا خط الخلية A549 التعبير عن DD-Cas9 واثنين من RPA3-الجينات sgRNAs مستقلة. استخدمنا أيضا خط الخلية A549 التعبير عن ناقلات مع التحكم رينيلا. قمنا بزرع تلك الخلايا بكثافة 2 × 103خلايا / سم2 واحتضانناها عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 95 ٪ ، 5 ٪ CO2 بين عشية وضحاها للوصول إلى 50-60 ٪ التقاء في اليوم التالي. استخدمنا وسائط RPMI مع FBS تمت تصفيته بنسبة 10٪. ونمضي في الخطوات التالية على النحو التالي:
  2. في اليوم التالي، تصيب الخلايا مع 500-2000 ميكروغرام من جزيئات الفيروس في 10 مل الحجم الإجمالي للوسط الثقافة. احتضان وسائل الإعلام الفيروسية لمدة 24 ساعة.
  3. في اليوم التالي، قم بتغيير الوسائط الفيروسية إلى وسائط الثقافة وحدد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي.
  4. حدد الخلايا الإيجابية ل GFP بواسطة فرز خلايا FACS أو باستخدام تحديد bleomycin.
  5. توسيع الخلايا المختارة بشكل إيجابي وتجميد المخزون.

9. التعريفي المشروط من Cas9 بوساطة تحرير الجينات

  1. لوحة الخلايا المختارة بشكل إيجابي 24 ساعة بعد العدوى، فضلا عن الخلايا غير المنقولة إلى لوحة 12 جيدا بشكل منفصل. انتظر حتى إرفاق الخلايا وتغيير الوسائط إلى وسائط الثقافة الخلية التي تحتوي على 200 nM من Shield-1. استبدال الوسائط في لوحات مع الخلايا المنقولة وغير المنقولة، وترك 2 الآبار لكل لوحة مع وسائل الإعلام العادية كعنصر تحكم سلبي.
  2. احتضان واستخراج البروتينات من كل بئر في نقاط زمنية مختلفة: الوقت 0، 2 ساعة، 6 ح، 12 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة بعد إضافة الدرع-1 إلى الآبار.
  3. ثم إزالة وسائل الإعلام مع درع-1 من بقية الآبار وتغييره لوسائل الإعلام الخلية العادية.
  4. جمع البروتينات من تلك الآبار 2 ساعة، 6 ساعة، و 12 ساعة بعد تغيير وسائل الإعلام.
  5. تصور من قبل تحليل لطخة الغربية عكس وسرعة تنظيم البروتين DD-Cas9 مزعزعة للاستقرار بعد إضافة وانسحاب ليغاند لها، درع-1. استخدام الأجسام المضادة الموجهة نحو DYKDDDDK العلامة لتصور البروتينات والأجسام المضادة السيطرة التي تستهدف على سبيل المثال بيتا توبولين.
  6. تحديد الجرعة المثلى من Shield-1 بواسطة منحنى الاستجابة الجرعة التي لاحظها تحليل بلوت الغربية.

10. التحقق من صحة تحرير الجينات

ملاحظة: إن المقايسات التعبير GFP، مثل تحليل قياس التدفق الخلوي وعلامة اختيار bleomycin تؤكد فقط تسليم كاشف CRISPR ناجحة لكنها لا تحدد ما إذا كان التسلسل المطلوب تم استهداف بنجاح. المقايسات الأكثر شيوعا لتأكيد استهداف الجينات الناجحة من قبل تجربة CRISPR هي تسلسل الحمض النووي سانجر، تسلسل الجيل القادم، والمساح Nuclease المقايسة، وتتبع Indels عن طريق التحلل (TIDE) المقايسة، أو تحليل لطخةالغربية 16،17،18.

  1. لوحة خلايا مختارة بشكل إيجابي وتغيير وسائل الإعلام إلى 200 nM من Shield-1 التي تحتوي على وسائل الإعلام. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام، وتغيير وسائل الإعلام مع درع-1 كل 3 أيام.
  2. استخدام تقنيات التحقق المذكورة أعلاه 5 أيام بعد DD-Cas9 التعريفي بواسطة Shield-1.

النتائج

لتمكين التعبير المشروط عن Cas9 ، قمنا بتطوير بناء ناقل ثنائي العدسية يتكون من مروج مدفوع ب U6 للتعبير عن sgRNA بشكل تأسيسي ، ومروج أساسي EF-1α لدفع التعبير عن بروتين الاندماج DD-Cas9 (الشكل 1A)19. كنموذج لتوضيح قوة وكفاءة النظام، قمنا بنقل خط الخلية A549 carcino...

Discussion

أحدثت تقنية CRISPR/Cas9 ثورة في قدرة استجواب الجينوم2وظيفيا. ومع ذلك ، فإن تعطيل الجينات غالبا ما يؤدي إلى فتك الخلايا ، والعجز الوظيفي ، والعيوب التنموية ، مما يحد من فائدة هذه النهج لدراسة الوظائف الجينية7. بالإضافة إلى ذلك، التعبير التأسيسي لل Cas9 قد يؤدي إلى سمية وتو...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الأعضاء السابقين في مختبرنا وعالمنا شريف سينتورك على العمل السابق. نشكر دانيلو سيغوفيا على قراءته الناقدة لهذه المخطوطة. كانت هذه الدراسة ممكنة وبدعم من برنامج السباحة في جميع أنحاء أمريكا والمعهد الوطني للسرطان لاكتشاف أهداف السرطان وتطويره.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100mM DTTThermosfisher
10X FastDigest bufferThermosfisherB64
10X T4 Ligation BufferNEBM0202S
colorimetric BCA kitPierce23225
DMEM, high glucose, glutaMaxThermo Fisher10566024
FastAPThermosfisherEF0654
FastDigest BsmBIThermosfisherFD0454
Flag [M2] mouse mAbSigmaF1804-50UG
Genomic DNA extraction kitMacherey Nagel740952.1
lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
oligonucleotidesSigma Aldrich
pMD2.GAddgene12259
polybreneSigma AldrichTR-1003-G
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
secondary antibodiesLICOR
Shield-1Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cellsThermofisherC737303
SURVEYOR Mutation Detection KitTransgenomic/IDT
T4 PNKNEBM0201S
Taq DNA PolymeraseNEBM0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAbMilliporeCP06-100UG

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175 CRISPR Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved