JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.

Abstract

טכנולוגיית החלבון 9 (CRISPR/Cas9) המשויכת באופן קבוע לתחביבים קצרים הפכה לכלי מעבדה נפוץ כדי להציג שינויים מדויקים וממוקדים בגנום. הפופולריות העצומה שלה והתפשטות מהירה מיוחסים לשימושו הקל ודיוק בהשוואה לקודמיו. עם זאת, ההפעלה המכוננת של המערכת מוגבלת. במאמר זה, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת שליטה זמנית של פעילות CRISPR/Cas9 המבוססת על ייצוב מותנה של חלבון Cas9. היתוך מוטציה מהונדסת של חלבון מחייב rapamycin FKBP12 ל- Cas9 (DD-Cas9) מאפשר השפלה מהירה של Cas9 כי בתורו ניתן לייצב על ידי נוכחות של ליגנד סינתטי FKBP12 (מגן-1). שלא כמו שיטות לא מובלות אחרות, ניתן להתאים מערכת זו בקלות כדי ליצור מערכות דו-ציסטרוניות לבטא DD-Cas9 עם גן אחר של עניין, ללא ויסות מותנה של הגן השני. שיטה זו מאפשרת ייצור מערכות הניתנות למעקב, כמו גם מניפולציה מקבילה ועצמאית של אללים הממוקדים על ידי נוקלאז Cas9. הפלטפורמה של שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ואפיון שיטתיים של גנים חיוניים וחקירת האינטראקציות התפקודיות של הגנים בהגדרות במבחנה וב- vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9 אשר מייצג "מקובצים באופן קבוע interspaced קצר פלינדרומי חוזר חלבון הקשורים 9" התגלה לראשונה כחלק ממחקרים עלחסינותאדפטיבית חיידקית 1,2. כיום, CRISPR/ Cas9 הפך לכלי המוכר ביותר לעריכת גנים הניתנת לתכנות ואיטרציות שונות של המערכת פותחו כדי לאפשר אפנון תמלול ואפיגנטי3. טכנולוגיה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ביותר של כמעט כל רצף של DNA4.

הרכיבים החיוניים של כל עריכת גנים CRISPR הם רצף RNA מדריך להתאמה אישית ואת נוקלאז Cas95. מדריך הרנ"א נקשר לרצף המשלים את המטרה בדנ"א, ומכוון את גרעין Cas9 לבצע שבירה כפולה בנקודה מסוימת בגנום3,4. אתר המחשוף המתקבל מתוקן לאחר מכן על ידי צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה ההומולוגיה (HDR), עם כניסתם של שינויים ברצף ה- DNA הממוקד5.

עריכת גנים מבוססת CRISPR/Cas9 היא קלה לשימוש, וזולה יחסית לטכניקות קודמות לעריכתגניםוהיא הוכחה כיעילה וחזקה בריבוי מערכות 2,4,5. עם זאת, המערכת מציגה כמה מגבלות. הביטוי המכונן של Cas9 הוכח לעתים קרובות כתוצאה של מספר מוגבר של מטרות מחוץ למטרות ורעילות תאים גבוהה4,6,7,8. בנוסף, מיקוד המכונן של גנים חיוניים והישרדות תאים על ידי Cas9 לוקח את יכולתו לבצע סוגים מסוימים של מחקרים פונקציונליים כגון מחקרים קינטיים של מוות תאים7.

כלי CRISPR-Cas9 שונים, שאינם ניתנים לערעור או מבוקרים מותנית, פותחו כדי לטפל בבעיות6, כגון Tet-ON ו-Tet-Off9; רקומבינציה ספציפית לאתר10; קרבה כימית11; intein תלוי splicing3; ו 4-Hydroxytamoxifen אסטרוגן קולטן (ER) מבוסס מערכות לוקליזציה גרעינית12. באופן כללי, רוב ההליכים האלה (חיבור intein ומערכות פיצול קרבה המושרה כימית) אינם מציעים שליטה הפיכה, מציגים תגובה קינטית איטית מאוד לטיפול תרופתי (מערכת Tet-On/Off), או אינם מקובלים על מניפולציה בתפוקה גבוהה6.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה פיתחנו ערכת כלים חדשנית שלא רק מספקת עריכת גנים מהירה וחזקה הנשלטת על ידי הזמן, אלא גם מבטיחה עקיבות, יכולת טונה וזמינות למניפולציה גנטית בתפוקה גבוהה. טכנולוגיה חדשנית זו יכולה לשמש קווי תאים, organoids, ומודלים בעלי חיים. המערכת שלנו מבוססת על תחום מהונדס, כאשר מותך Cas9, זה גרים השפלה מהירה שלה. עם זאת, ניתן לייצב אותו במהירות עם מולקולה קטנה סלקטיבית מאוד, לא רעילה, חדירת לתא. ליתר דיוק, הנדסנו את המוטציה האנושית FKBP12 "תחום מערער" (DD) ל- Cas9, מסמנת את Cas9 להשפלה מהירה ומהורכבת באמצעות מערכת אוביקוויטין-פרוטאזום כאשר היא באה לידי ביטוי בתאי יונקים13. ליגנד סינתטי DD, Shield-1 יכול לייצב את התאמת DD, ובכך למנוע את השפלה של חלבונים הותכו DD (כגון Cas9) בצורה יעילה מאוד, ועם תגובה קינטית מהירה14,15. שימו לב, מגן-1 נקשר עם שלושה סדרי גודל הדוקים יותר ל- FKBP12 המוטנטי מאשר למקבילו הפראי14.

ניתן להשתמש בזוג DD-Cas9/Shield-1 כדי לחקור את הזיהוי והאפיון השיטתיים של גנים חיוניים בתאים מתורבתים ומודלים של בעלי חיים כפי שהראנו בעבר על ידי מיקוד מותנה בגן CypD, הממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים של המיטוכונדריה; EGFR, שחקן מפתח בטרנספורמציה אונקוגנית; ו Tp53, גן מרכזי בתגובת נזק DNA. בנוסף לעריכת גנים מבוקרת זמנית ומותנית, יתרון נוסף של השיטה הוא שהתייצבות DD-Cas9 אינה תלויה בתעתיק שלה. תכונה זו מאפשרת ביטוי משותף, תחת אותו מקדם, של סמנים למעקב, כמו גם רקומבינסות, כגון רקומבינאז תלוי קולטן אסטרוגן, CREER. בעבודה זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה שלנו בהצלחה במבחנה, כדי למקד באופן מותנה למשל, גן שכפול DNA, RPA3.

Protocol

1.וקטור DD-Cas9

  1. להשיג וקטור DD-Cas9 מ Addgene (DD-Cas9 עם רצף מילוי ונוגה (EDCPV), Plasmid 90085).
    הערה: זהו פלסמיד DD-Cas9 lentiviral עם מקדם U6 שמניע את תמלול ה- RNA המדריך היחיד (sgRNA) בעוד מקדם EFS מניע את תמלול DD-Cas9. רצף DYKDDDDK (תג דגל) נמצא בטרמינל C של Cas9 ואחריו פפטיד 2A עם מחשוף עצמי (P2A) המפריד בין DD-Cas9 לבין חלבון פלואורסצנטי שונה ונוס (mVenus).

2. עיצוב RNA מדריך קטן (sgRNA)

  1. עצב RNA מדריך קטן (sgRNA) שישוכפל לווקטור DD-Cas9 באמצעות אחד ממספר אלגוריתמים, המתמקד באזור גנומי מסוים.
    הערה: כדי להפחית את האפקטים מחוץ ליעד, בחר רצפי sgRNA עם הציון הגבוה ביותר באמצעות אתר האינטרנט: http://crispr.mit.edu.
  2. עצב והזמין שני אוליגונוקלאוטידים לכל רצף sgRNA כדי ליצור sgRNA מלא.
    הערה: מאז plasmid יתעוכל על ידי האנזים BsmBI, לעצב את קדימה ואת אוליגונוקלאוטיד הפוך על ידי הוספת עיכול BsmBI overhangs לרצף sgRNA. השתמש בתבנית מתוך טבלה 1.

3. שיבוט של sgRNA לתוך וקטור DD-Cas9 lentiviral

  1. Dephosphorylate 5′-קצוות של DD-Cas9 plasmid באמצעות פוספטאז אלקליין (FastAP) בתגובת עיכול אנזים הגבלה.
    הערה: וקטורים יכולים להסתגר מחדש במהלך קשירה במיוחד כאשר הם ליניאריים על ידי אנזים הגבלה יחיד. כדי להבטיח הווקטור לא להקיף מחדש, דה-זרחן plasmid על ידי הוספת פוספטאז ישירות לתוך תגובת העיכול.
    1. Dephosphorylate לעכל את plasmid עם אנזים BsmBI על ידי הכנת תערובת של 5 מיקרוגרם של DD-Cas9 plasmid, 6 μL של חוצץ עיכול (10x), 0.6 μL של DTT (100 mM), 3 μL של BsmBI, 3 μL של FastAP, להוסיף עד 60 μL מים ללא גרקלאז כדי להפוך 60 μL נפח התגובה הכולל.
      הערה: מוסיפים את האנזים BsmBI ו FastAP לתערובת בסופו של דבר.
    2. לדגור על התערובת במשך 30 דקות ב 37 °C בלוק חום או thermocycler.
  2. לטהר את DD-Cas9 פלסטיד מעוכל.
    1. הכן 0.8% ג'ל אגרוז DNA כדי להסיר plasmid מתעכל חלקית ועקבות של אנזימים. השתמש במסרק ג'ל רחב יותר להפרדה טובה יותר והפעל את הג'ל ב- 90 V.
    2. דמיינו רצועות מתחת לאור UV 360-365 ננומטר וחתכו את רצועת הפלסמיד הגדולה יותר מהג'ל. מחק את קטע 2 kb המתאים למילוי.
    3. טהרו את רצועת הג'ל הגדולה באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית ובצעו את הוראות היצרן.
  3. ליגת חידשה אוליגוס עם פלסמיד DD-Cas9 מעוכל.
    1. זרחן ואנל אוליגוס sgRNA.
      1. הכן את התערובת של 1 μL של T4 חיץ קשירה (10x), 1 μL של אוליגו 1 (100 מיקרומטר), 1 μL של אוליגו 2 (100 מיקרומטר), 6.5 μL של מים ללא נוקלאז. לבסוף, להוסיף 0.5 μL של T4 PNK. הנפח הכולל של תגובה זו הוא 10 μL.
      2. הוסף את תגובת תערובת התרמוציקלר עם התנאים הבאים: 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות, 95 °C (5 דקות), ולאחר מכן רמפה עד 25 °C (5 °F) עם המהירות של 5 °C /min.
        הערה: PNK חייב להיות מומת בחום לפני oligonucleotides לשים לתוך קשירה אחרת PNK יהיה זרחן הווקטור. שלב הזרחן וצעד החישול מבוצעים יחד בתרמוציקלר. שלב הזרחן שבו 5 ' פוספט מתווסף oligonucleotides sgRNA נדרש עבור קשירה להתרחש.
    2. Ligate DD-Cas9 עיכל פלסמיד ואוליגו sgRNA.
      1. לדלל את אוליגוס מחושל ל 1: 200 במים ללא נוקלאז ולהשתמש 50 ננוגרם של DNA plasmid בתגובת קשירה.
        הערה: השתמש ביחס הטוחנת של 6 להוסיף : וקטור 1, כדי לקדם שילוב הוספה או להשתמש במחשבון קשירה כדי לחשב את יחס הטוחנת: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. הכן את תערובת תגובת הקשירה: 50 ננוגרם של וקטור DD-Cas9 מעוכל ומטוהר, נפח מתאים של אוליגוס מחושל מדולל, 1 μL של חיץ קשירת T4 (10x), 1 μL של T4 DNA Ligase, עד 10 μL מים ללא נוקלאז כדי להשיג את הנפח הכולל של התגובה 10 μL.
      3. אם משתמשים בליגאז "ריכוז גבוה", יש לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. אחרת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, או כדי להשיג תשואה גבוהה יותר של קשירה, דגירה ב 16 °C (50 °F) לילה.
        הערה: חימום-inactivate אם משתמשים ליגת ה- DNA T4 הסטנדרטית ב 65 °C (65 °F) במשך 20 דקות. אין לנטרל חום אם אתה משתמש בתערובות מאסטר ligase.

4. טרנספורמציה חיידקית

  1. צלחות אגר אמפיצ'ילין 10 ס"מ חמות מראש בטמפרטורת החדר.
  2. להפשיר 50 μL של "ירייה אחת Stbl3" תאי חיידקים מוסמכים על קרח.
  3. הוסף 2-3 μL של תערובת קשירה ל 50 μL של תאים חיידקיים מוסמכים ומערבבים בעדינות על ידי הבהוב תחתית הצינור עם אצבע 4 פעמים. דגירה על קרח במשך 30 דקות.
  4. חום-לזעזע את התאים בדיוק 42 °C (40 °F) במשך 40 שניות, באמצעות שעון זמן. לקרר את תאי החיידקים על קרח במשך 5 דקות.
  5. הוסף 500 μL של מדיה SOC ללא אנטיביוטיקה לתאי החיידקים ולגדל אותם באינקובטור רועד ב 250 סל"ד במשך 45 דקות, ב 37 °C (7 °F).
  6. להפיץ 100 μL של חיידקים שעברו טרנספורמציה על לוחות LB-אמפיצלין חמים מראש ודגורה לילה ב 37 °C (50 °F).

5. מיני/מקסי-הכנה של פלסמיד קשירה

  1. הכן תרבות מקסימום / מיני-הכנה למתחילים.
    1. למחרת לבחור שיבוט חיידקי יחיד ולחסן תרבות המתנע עם 8 מ"ל של מדיה LB המכיל אמפיצ'ין.
    2. לגדל את החיידקים באינקובטור רועד ב 250 סל"ד, 37 °C (55 °F) עבור 10-12 שעות.
    3. השתמש 3-5 מ"ל של חיידקים עבור מיני-הכנה או להשתמש בו כתרבית המתנע עבור maxi-prep. השתמש בשאר החיידקים כגליצריל-מלאי חיידקי על ידי הוספת 100% גליסול ביחס של תרבית חיידקים:גליצלול הוא 1:1.
      הערה: כאן, נתאר את הליך המיני-הכנה.
  2. הליך הכנה מצומצם
    1. קציר 3-5 מ"ל של תאים חיידקיים וצנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות.
    2. Resuspend הכדור של תאים חיידקיים עם 200 μL של חוצץ P1, המכיל RNase A ומאוחסן ב 4 °C (50 °F).
    3. מוסיפים 200 μL של חוצץ P2 ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 10 פעמים עד שהנוזל מבהיר.
    4. הוסף 300 μL של חוצץ P3 ומערבבים על ידי היפוך הצינור 10 פעמים. הנוזל יהיה מעונן. המשך מיד עם centrifuging הדגימות ב 12,000 x g במשך 10 דקות.
    5. העבר supernatant ברור לעמוד ספין צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות.
      זרוק את הזרימה דרך.
      הערה: ודא שסופר-נט מובהר. חלקיקים יכולים לסתום את עמודת הסיבוב ולהפחית את יעילות העמודות.
    6. הוסף 400 μL של חוצץ PD וצנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות. זרוק את הזרימה דרך.
    7. הוסף 600 μL של חוצץ PW לשטוף את עמוד ספין צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות. זרוק את הזרימה דרך.
    8. צנטריפוגה שוב את עמודת הסיבוב במהירות הגבוהה ביותר במשך 3 דקות כדי להסיר את שאריות המאגר. להשליך את הזרימה דרך ולתת לו לשבת במשך 2 דקות.
    9. מקם את עמודת הספין לצינור טרי ולהוסיף 50 μL של חוצץ elution. דגירה במשך 5 דקות וצנטריפוגה במהירות הגבוהה ביותר במשך 2 דקות.
    10. השתמש בהתקן nanodrop כדי למדוד את הריכוז של פלסמיד DD-Cas9 מטוהר עם הכנס sgRNA (ng/μL).
  3. לאמת את שיבוט sgRNA על ידי ריצוף DNA של DD-Cas9 plasmid. השתמש ברצף הפריימר U6 בטבלה 2.

6. הכנה לנטיוויראלית

  1. הכן תאי אריזה HEK293T עבור transfection.
    1. השתמש HEK293T בריא עד מעבר 10 ולזרוע אותם באופן שווה בצפיפות 1-2 x 106 תאים לכל צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. השתמש 10 מ"ל של גלוקוז Dulbecco שונה נשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום בקר עובר מסונן (FBS). תאי דגירה באינקובטור תרבית הרקמות, ב 5% CO2 ו 37 °C (20 °F).
    2. למחרת, לאשר כי תאים הגיעו 70% השפעה על ידי מיקרוסקופיה Brightfield וכי הם מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת. שנה מדיה לתאים שעה אחת לפני ההדבקה בנפח הסופי של 10 מ"ל.
      הערה: התקשורת צריכה להיעדר מאנטיביוטיקה ותרופות אנטי ממיקוטיקה.
    3. הכן את התערובת של 2 צינורות עם 500 μL של מדיה חמה (למשל, OptiMEM).
      1. הוסף 25 μL של ריאגנט transfection לצינור 1 המכיל חם 500 μL של מדיה, ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      2. בינתיים להכין תערובת של plasmids לצינור 2 המכיל 3.5 מיקרוגרם של DD-Cas9 המכיל sgRNA משובט, 6 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה (psPAX2), ו 3 מיקרוגרם של plasmid המעטפה (pMD2.G) לתוך חם 500 μL של מדיה.
      3. מערבבים צינור 1 עם צינור 2 כדי ליצור תערובת transfection ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
      4. זרוק את תערובת transfection לתאי HEK293T צלחת דגירה באינקובטור תרבית הרקמות, ב 5% CO2 ו 37 °C (5°F) לילה.
      5. לאחר 18 שעות, בזהירות לשנות את המדיה ל 10 מ"ל של DMEM טרי עם 10% FBS כדי להסיר את ריאגנט transfection. דגירה ל-48 השעות הבאות.
      6. לאחר 48 שעות, לאסוף את supernatant עם מזרק 10 מ"ל ולהעביר אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
      7. Aliquot ולאחסן את הנגיף supernatant ב -80 °C (80 °F).

7. קביעת טיטר וירוס ויעילות transduction עם ציטומטריית זרימה

  1. זרע את תאי HEK293T עם 5 x 105 תאים / גם לתוך צלחת 6-טוב. תאי זרעים לשתי צלחות של 6 בארות. השתמש בצלחת אחת לספירה למחרת.
  2. לדגור על הלוחות באינקובטור ב 37 °C (7 °F), 95% לחות, 5% CO2 לילה כדי להגיע 50-60% מפגש למחרת.
  3. למחרת, השתמש באחת מלוחות 6-בארות לספור את התאים ב 6 בארות.
  4. להפשיר את aliquot הווירוס שישמש לביצוע דילול סדרתי ולהוסיף 8 מיקרוגרם / מ"ל של ריאגנט polybrene.
  5. הכן DMEM עם 10% FBS לדילול סדרתי של הנגיף ולהוסיף 8 מיקרוגרם / מ"ל של ריאגנט polybrene.
  6. הכן 2 מ"ל של דילול טורי פי עשרה של הנגיף מ- 1 x 10-1 ל- 1 x 10-4 במדיה המכילה פוליברן.
  7. הסר מדיה מצלחת 6-טוב ולהוסיף 1 מ"ל של דילול ויראלי לבארות. השאירו אחד טוב עם מדיה לבד כמו שליטה שלילית ואחד גם עם וירוס 100%.
  8. דגירה תאים עם הנגיף באינקובטור עבור 24 שעות.
  9. למחרת, להסיר את המדיה עם וירוס מ 6-טוב צלחות ולשנות אותו עבור 2 מ"ל של DMEM טרי עם 10% FBS. תאי דגירה עבור 48-72 שעות. שים לב GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל יום.
  10. לאחר 48-72 שעות, נתק את התאים והגדיל אותם מחדש במאגר MACS.
  11. השתמש בציטומטר זרימה כדי לקבוע את אחוז ביטוי GFP.
  12. חשב טיטר וירוס באמצעות הנוסחה הבאה: TU/mL = (מספר התאים transduced x אחוז פלואורסצנטי x גורם דילול)/(אמצעי אחסון טרנסדוקציה ב- mL)

8. טרנסדוקציה לנטיוויראלית של תאי יעד

  1. צלחת קו התא של עניין צלחת 10 ס"מ ודגרה לילה להגיע למפגש 50-60% למחרת.
    הערה: השתמשנו בקו התא A549 המבטא DD-Cas9 ושני sgRNAs גנים RPA3 עצמאיים. השתמשנו גם בקו התא A549 המבטא וקטור עם בקרת רנילה. זרענו את התאים האלה בצפיפות של 2 x 103תאים / ס"מ2 ודגרנו אותם ב 37 °C (5 °F), 95% לחות, 5% CO2 לילה כדי להגיע 50-60% השפעה למחרת. השתמשנו במדיה RPMI עם 10% FBS מסונן. המשכנו בשלבים הבאים כדלקמנו:
  2. למחרת, להדביק את התאים עם 500-2000 μL של חלקיקי וירוס בנפח הכולל של 10 מ"ל של מדיום תרבות. לדגור מדיה ויראלית עבור 24 שעות.
  3. למחרת, שנה את המדיה הוויראלית למדיית תרבות וקבע את אחוז התאים החיוביים של GFP באמצעות ציטומטריית זרימה.
  4. בחר תאים חיוביים של GFP לפי מיון תאים של FACS או באמצעות בחירת bleomycin.
  5. הרחב תאים שנבחרו באופן חיובי והקפא מניה.

9. אינדוקציה מותנית של עריכת גנים בתיווך Cas9

  1. צלחת בחרה חיובית תאים 24 שעות לאחר זיהום, כמו גם תאים untransduced לצלחת 12-well בנפרד. המתן עד התאים לצרף ולשנות את המדיה למדיה תרבית התא המכיל 200 nM של Shield-1. החלף את המדיה בלוחות עם תאים transduced ו untransduced, משאיר 2 בארות לכל צלחת עם מדיה רגילה כמו שליטה שלילית.
  2. לדגור ולהפיק חלבונים מכל באר בנקודות זמן שונות: זמן 0, 2 שעות, 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות, 48 שעות, ו 72 שעות לאחר הוספת מגן-1 לבארות.
  3. לאחר מכן הסר את המדיה עם Shield-1 משאר הבארות ושנה אותה למדיה סלולרית רגילה.
  4. לאסוף את החלבונים מאותם בארות 2 שעות, 6 שעות, ו 12 שעות לאחר שינוי המדיה.
  5. דמיינו על ידי ניתוח כתם מערבי את הפיכות והמהירות של ויסות חלבון DD-Cas9 מעורער לאחר התוספת והנסיגה של הליבנד שלה, Shield-1. השתמש בנוגדן המכוון לתג DYKDDDDK כדי לדמיין חלבונים ונוגדי בקרה המיועדים למשל בטא-טובולין.
  6. לקבוע את המינון האופטימלי של מגן-1 על ידי עקומת תגובת מינון שנצפתה על ידי ניתוח כתם מערבי.

10. אימות עריכת גנים

הערה: ביטוי GFP מנסח, כגון ניתוח ציטומטריית זרימה וסמן בחירת בלומיצין רק לאשר מסירה מוצלחת של ריאגנט CRISPR, אך הם אינם קובעים אם הרצף הרצוי היה ממוקד בהצלחה. הבדיקות הנפוצות ביותר לאישור פילוח גנים מוצלח על ידי ניסוי CRISPR הן ריצוף DNA סנגר, רצף הדור הבא, נוקלאז אסאי המודד, המעקב אחר Indels על ידי פירוק (TIDE) אסאי, או ניתוח כתם מערבי16,17,18.

  1. צלחת תאים שנבחרו באופן חיובי ולשנות מדיה ל 200 nM של מדיה המכילה Shield-1. לדגור תאים במשך 5 ימים, שינוי מדיה עם מגן-1 כל 3 ימים.
  2. השתמש בטכניקות האימות שהוזכרו לעיל 5 ימים לאחר אינדוקציה DD-Cas9 על-ידי Shield-1.

תוצאות

כדי לאפשר את הביטוי המותנה של Cas9, פיתחנו מבנה וקטורי עדשותי כפול המורכב ממקדם מונחה U6 לבטא באופן מרכיב sgRNA, ומקדם ליבה EF-1α כדי להניע את הביטוי של חלבון ההיתוך DD-Cas9 (איור 1A)19. כפרדיגמה להמחשת החוסן והיעילות של המערכת, הטרנסנו את קו התאים A549 הקרצי?...

Discussion

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה ביכולת לחקור באופן פונקציונלי גנומים2. עם זאת, חוסר הפעילות של גנים לעתים קרובות גורם קטלניות התא, ליקויים תפקודיים, פגמים התפתחותיים, הגבלת התועלת של גישות כאלה לחקרפונקציות גנים 7. בנוסף, ביטוי ממהווה את Cas9 עלול לגרום לרעילות וליציר...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

אנו מודים לחברים קודמים במעבדה שלנו ולמדען שלנו, סריף סנטרק, על עבודה קודמת. אנו מודים לדנילו סגוביה שקרא את כתב היד הזה בביקורתיות. מחקר זה היה אפשרי ונתמך על ידי לשחות ברחבי אמריקה ואת המכון הלאומי לסרטן היעד גילוי ופיתוח תוכנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100mM DTTThermosfisher
10X FastDigest bufferThermosfisherB64
10X T4 Ligation BufferNEBM0202S
colorimetric BCA kitPierce23225
DMEM, high glucose, glutaMaxThermo Fisher10566024
FastAPThermosfisherEF0654
FastDigest BsmBIThermosfisherFD0454
Flag [M2] mouse mAbSigmaF1804-50UG
Genomic DNA extraction kitMacherey Nagel740952.1
lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
oligonucleotidesSigma Aldrich
pMD2.GAddgene12259
polybreneSigma AldrichTR-1003-G
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
secondary antibodiesLICOR
Shield-1Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cellsThermofisherC737303
SURVEYOR Mutation Detection KitTransgenomic/IDT
T4 PNKNEBM0201S
Taq DNA PolymeraseNEBM0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAbMilliporeCP06-100UG

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175CRISPRCas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved