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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, describimos una herramienta de edición del genoma basada en la estabilización temporal y condicional de la proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) (Cas9) bajo la pequeña molécula, Shield-1. El método se puede utilizar para células cultivadas y modelos animales.

Resumen

La tecnología de proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada se ha convertido en una herramienta de laboratorio prevalente para introducir modificaciones precisas y específicas en el genoma. Su enorme popularidad y rápida difusión se atribuyen a su fácil uso y precisión en comparación con sus predecesores. Sin embargo, la activación constitutiva del sistema tiene aplicaciones limitadas. En este artículo, describimos un nuevo método que permite el control temporal de la actividad CRISPR/Cas9 basado en la estabilización condicional de la proteína Cas9. La fusión de un mutante diseñado de la proteína de unión a rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite la rápida degradación de Cas9 que a su vez puede estabilizarse mediante la presencia de un ligando sintético FKBP12 (Shield-1). A diferencia de otros métodos inducibles, este sistema se puede adaptar fácilmente para generar sistemas bi-cistrónicos para co-expresar DD-Cas9 con otro gen de interés, sin regulación condicional del segundo gen. Este método permite la generación de sistemas trazables, así como la manipulación paralela e independiente de alelos dirigidos por la nucleasa Cas9. La plataforma de este método se puede utilizar para la identificación y caracterización sistemática de genes esenciales y el interrogatorio de las interacciones funcionales de genes en entornos in vitro e in vivo.

Introducción

CRISPR-Cas9 que significa " proteína asociada arepeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas asociadas" fue descubierta por primera vez como parte de estudios sobre la inmunidad adaptativa bacteriana1,2. Hoy en día, CRISPR/Cas9 se ha convertido en la herramienta más reconocida para la edición de genes programables y se han desarrollado diferentes iteraciones del sistema para permitir modulaciones transcripcionales y epigenéticas3. Esta tecnología permite la manipulación genética de alta precisión de casi cualquier secuencia de ADN4.

Los componentes esenciales de cualquier edición de genes CRISPR son una secuencia de ARN guía personalizable y la nucleasa Cas95. La guía de ARN se une a la secuencia diana-complementaria en el ADN, dirigiendo a la nucleasa Cas9 para realizar una rotura de doble hebra en un punto específico del genoma3,4. El sitio de escisión resultante se repara mediante unión final no homóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR), con la consiguiente introducción de cambios en la secuencia de ADN objetivo5.

La edición de genes basada en CRISPR / Cas9 es fácil de usar y relativamente económica en comparación con las técnicas de edición de genes anteriores y se ha demostrado que es eficiente y robusta en una multiplicidad de sistemas2,4,5. Sin embargo, el sistema presenta algunas limitaciones. A menudo se ha demostrado que la expresión constitutiva de Cas9 da lugar a un mayor número de objetivos no objetivos y una alta toxicidad celular4,6,7,8. Además, la focalización constitutiva de genes esenciales y de supervivencia celular por parte de Cas9 le quita capacidad para realizar ciertos tipos de estudios funcionales como los estudios cinéticos de muerte celular7.

Se han desarrollado diferentes herramientas CRISPR-Cas9 inducibles o controladas condicionalmente para abordar esos problemas6, como Tet-ON y Tet-Off9; recombinación específica del sitio10; proximidad inducida químicamente11; empalme dependiente de inteína3; y sistemas de localización nuclear basados en el receptor de estrógeno (ER) 4-hidroxitamoxifeno12. En general, la mayoría de estos procedimientos (empalme de inteína y sistemas de división de proximidad inducidos químicamente) no ofrecen un control reversible, presentan una respuesta cinética muy lenta al tratamiento farmacológico (sistema Tet-On/Off) o no son susceptibles de manipulación de alto rendimiento6.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un nuevo conjunto de herramientas que no solo proporciona una edición de genes controlada temporalmente rápida y robusta, sino que también garantiza la trazabilidad, la capacidad de ajuste y la capacidad de manipulación de genes de alto rendimiento. Esta novedosa tecnología se puede utilizar en líneas celulares, organoides y modelos animales. Nuestro sistema se basa en un dominio de ingeniería, cuando se fusiona con Cas9, induce su rápida degradación. Sin embargo, se puede estabilizar rápidamente con una molécula pequeña altamente selectiva, no tóxica y permeable a las células. Más específicamente, diseñamos el mutante humano FKBP12 "dominio desestabilizador" (DD) a Cas9, marcando Cas9 para una degradación rápida y constitutiva a través del sistema ubiquitina-proteasoma cuando se expresa en células de mamíferos13. El ligando sintético DD, Shield-1 puede estabilizar la conformación DD, evitando así la degradación de proteínas fusionadas a DD (como Cas9) de una manera muy eficiente, y con una respuesta cinética rápida14,15. Cabe destacar que Shield-1 se une con tres órdenes de magnitud más al mutante FKBP12 que a su contraparte de tipo salvaje14.

El par DD-Cas9/Shield-1 se puede utilizar para estudiar la identificación sistemática y caracterización de genes esenciales en células cultivadas y modelos animales, como mostramos anteriormente al dirigirse condicionalmente al gen CypD, que desempeña un papel importante en el metabolismo de las mitocondrias; EGFR, un actor clave en la transformación oncogénica; y Tp53, un gen central en la respuesta al daño del ADN. Además de la edición de genes controlada temporal y condicionalmente, otra ventaja del método es que la estabilización de DD-Cas9 es independiente de su transcripción. Esta característica permite la coexpresión, bajo el mismo promotor, de marcadores trazables así como recombinasas, como la recombinasa dependiente del receptor de estrógenos, CREER. En este trabajo, mostramos cómo nuestro método puede ser utilizado con éxito in vitro, para apuntar condicionalmente, por ejemplo, al gen de replicación del ADN, RPA3.

Protocolo

1.El vector DD-Cas9

  1. Obtener el vector DD-Cas9 de Addgene (DD-Cas9 con secuencia de relleno y Venus (EDCPV), Plásmido 90085).
    NOTA: Este es un plásmido lentiviral DD-Cas9 con un promotor U6 que impulsa la transcripción de ARN de guía única (sgRNA), mientras que el promotor EFS impulsa la transcripción DD-Cas9. La secuencia DYKDDDDK (flag-tag) está presente en el terminal C de Cas9 seguida de péptido autoescindido 2A (P2A) que separa DD-Cas9 y la proteína fluorescente modificada Venus (mVenus).

2. Diseño de ARN guía pequeño (sgRNA)

  1. Diseñe un ARN guía pequeño (sgRNA) que se clonará en el vector DD-Cas9 mediante el uso de uno de varios algoritmos, dirigido a una región genómica específica.
    NOTA: Para reducir los efectos fuera del objetivo, seleccione secuencias de sgRNA con la puntuación más alta utilizando el sitio web: http://crispr.mit.edu.
  2. Diseñar y ordenar dos oligonucleótidos por secuencia de sgRNA para hacer un sgRNA completo.
    NOTA: Dado que el plásmido será digerido por la enzima BsmBI, diseñe el oligonucleótido hacia adelante y hacia atrás agregando voladizos de digestión BsmBI a la secuencia de sgRNA. Utilice la plantilla de la Tabla 1.

3. Clonación de sgRNA en el vector lentiviral DD-Cas9

  1. Desfosforila los extremos 5′ del plásmido DD-Cas9 mediante el uso de fosfatasa alcalina (FastAP) en una reacción de digestión enzimática de restricción.
    NOTA: Los vectores pueden volver a circularizarse durante la ligadura, especialmente cuando están linealizados por una sola enzima de restricción. Para asegurarse de que el vector no volverá a circularizar, desfosorila el plásmido agregando fosfatasa directamente a la reacción de digestión.
    1. Desfosforilar y digerir el plásmido con la enzima BsmBI preparando una mezcla de 5 μg de plásmido DD-Cas9, 6 μL de tampón de digestión (10x), 0,6 μL de TDT (100 mM), 3 μL de BsmBI, 3 μL de FastAP, sumar hasta 60 μL de agua libre de nucleasa para hacer 60 μL el volumen total de reacción.
      NOTA: Agregue la enzima BsmBI y FastAP a la mezcla al final.
    2. Incubar la mezcla durante 30 min a 37 °C bloque térmico o termociclador.
  2. Purificar el plásmido DD-Cas9 digerido.
    1. Prepare un gel de agarosa de ADN al 0,8% para eliminar el plásmido incompletamente digerido y los rastros de enzimas. Use un peine de gel más ancho para una mejor separación y ejecute el gel a 90 V.
    2. Visualice bandas bajo luz UV de 360-365 nm y corte la banda de plásmido más grande del gel. Descarte el fragmento de 2 kb que corresponde al relleno.
    3. Purifique la banda de gel de corte grande utilizando un kit de purificación de gel comercial y siga las instrucciones del fabricante.
  3. Oligos recocidos ligados con plásmido DD-Cas9 digerido.
    1. Fosforilato y anneal los oligos de sgRNA.
      1. Preparar la mezcla de 1 μL de tampón de ligadura T4 (10x), 1 μL de Oligo 1 (100 μM), 1 μL de Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL de agua libre de nucleasas. Por último, agregue 0.5 μL de T4 PNK. El volumen total de esta reacción es de 10 μL.
      2. Agregue la mezcla de reacción al termociclador con las siguientes condiciones: 37 °C durante 30 min, 95 °C durante 5 min, y luego baje a 25 °C con la velocidad de 5 °C/min.
        NOTA: El PNK debe ser inactivado por calor antes de que los oligonucleótidos se coloquen en la ligadura, de lo contrario, el PNK fosforilará el vector. El paso de fosforilación y el paso de recocido se realizan juntos en un termociclador. La etapa de fosforilación donde se agrega 5' fosfato a los oligonucleótidos de sgRNA es necesaria para que ocurra la ligadura.
    2. Ligado DD-Cas9 digerido plásmido y sgRNA oligos.
      1. Diluya los oligos recocidos a 1:200 en agua libre de nucleasa y use 50 ng de ADN plásmido en la reacción de ligadura.
        NOTA: Utilice la relación molar del vector 6 insert: 1, para promover la integración de inserto o use una calculadora de ligadura para calcular la relación molar: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Preparar la mezcla de reacción de ligadura: 50 ng de vector DD-Cas9 digerido y purificado, volumen apropiado de oligos recocidos diluidos, 1 μL de tampón de ligadura T4 (10x), 1 μL de ADN ligasa T4, hasta 10 μL de agua libre de nucleasa para obtener el volumen total de la reacción 10 μL.
      3. Si usa ligasa de "alta concentración", incube la reacción a temperatura ambiente durante 5 min. De lo contrario, incubar a temperatura ambiente durante 2 h, o para lograr un mayor rendimiento de ligadura, incubar a 16 ° C durante la noche.
        NOTA: Inactivar térmicamente si se utiliza la ADN ligasa T4 estándar a 65 °C durante 20 minutos. No inactive térmicamente si está utilizando mezclas maestras de ligasa.

4. Transformación bacteriana

  1. Placas de agar de ampicilina LB de 10 cm precalentadas a temperatura ambiente.
  2. Descongelar 50 μL de células bacterianas competentes "One shot Stbl3" en hielo.
  3. Agregue 2-3 μL de mezcla de ligadura a 50 μL de células bacterianas competentes y mezcle suavemente moviendo la parte inferior del tubo con un dedo 4 veces. Incubar en hielo durante 30 min.
  4. Choque térmico de las células a exactamente 42 °C durante 40 segundos, utilizando un temporizador. Enfríe las células bacterianas en hielo durante 5 min.
  5. Añadir 500 μL de medios SOC sin antibiótico a las células bacterianas y cultivarlos en la incubadora de agitación a 250 rpm durante 45 min, a 37 °C.
  6. Difunda 100 μL de bacterias transformadas en placas de LB-ampicilina precalentadas e incube durante la noche a 37 °C.

5. Mini/maxi-preparación de plásmido ligado

  1. Prepare una cultura de inicio maxi/mini-prep.
    1. Al día siguiente, elija un solo clon bacteriano e inocule un cultivo iniciador con 8 ml de medios LB que contengan ampicilina.
    2. Cultive las bacterias en la incubadora de agitación a 250 rpm, 37 ° C durante 10-12 h.
    3. Use 3-5 ml de bacterias para la mini-preparación o úselo como un cultivo iniciador para la maxi-preparación. Use el resto de las bacterias como un stock de glicerol bacteriano agregando 100% de glicerol en la proporción de cultivo bacteriano: el glicerol es 1: 1.
      NOTA: Aquí, describiremos el procedimiento de mini-preparación.
  2. Procedimiento de mini-preparación
    1. Cosecha 3-5 mL de células bacterianas y centrifuga a 12.000 x g durante 1 min.
    2. Resuspend el pellet de células bacterianas con 200 μL de tampón P1, que contiene RNasa A y se almacena a 4 °C.
    3. Añadir 200 μL de tampón P2 y mezclar suavemente invirtiendo el tubo 10 veces hasta que el líquido se aclare.
    4. Añadir 300 μL de tampón P3 y mezclar invirtiendo el tubo 10 veces. El líquido se volverá turbio. Proceder inmediatamente con la centrifugación de las muestras a 12.000 x g durante 10 min.
    5. Transfiera el sobrenadante transparente a la columna de centrifugado y centrífuga a 12.000 x g durante 1 min.
      Descarta el flujo.
      NOTA: Asegúrese de que el sobrenadante esté aclarado. Las partículas pueden obstruir la columna de espín y reducir la eficacia de la columna.
    6. Añadir 400 μL de tampón DE PD y centrífuga a 12.000 x g durante 1 min. Descarta el flujo.
    7. Añadir 600 μL de tampón PW para lavar la columna de centrifugado y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min. Descarta el flujo.
    8. Centrifugar de nuevo la columna de centrifugado a máxima velocidad durante 3 min para eliminar los residuos del tampón. Deseche el flujo y déjelo reposar durante 2 minutos.
    9. Coloque la columna de centrifugado en un tubo nuevo y agregue 50 μL de tampón de elución. Incubar durante 5 min y centrifugar a máxima velocidad durante 2 min.
    10. Utilice el dispositivo nanodrop para medir la concentración de plásmido DD-Cas9 purificado con el inserto de sgRNA (ng/μL).
  3. Validar la clonación de sgRNA mediante secuenciación de ADN del plásmido DD-Cas9. Utilice la secuencia de cebadores U6 en la Tabla 2.

6. Preparación lentiviral

  1. Preparar células de envasado HEK293T para transfección.
    1. Use HEK293T sano hasta el paso 10 y sembrarlos uniformemente a densidad 1-2 x 106 células por placa de cultivo de tejido de 10 cm. Use 10 ml de medio águila modificada (DMEM) de glucosa Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) filtrado. Incubar las células en la incubadora de cultivo de tejidos, al 5% de CO2 y 37 °C durante 20 h.
    2. Al día siguiente, confirme que las células alcanzaron el 70% de confluencia por microscopía de campo brillante y que están dispersas uniformemente a través de la placa. Cambie el medio a células 1 h antes de la transfección con el volumen final de 10 ml.
      NOTA: Los medios de comunicación deben estar ausentes de antibióticos y antimicóticos.
    3. Prepare la mezcla de 2 tubos con 500 μL de medios calientes (por ejemplo, OptiMEM).
      1. Añadir 25 μL de reactivo de transfección al tubo 1 que contenga 500 μL calientes de medios e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      2. Mientras tanto, prepare una mezcla de plásmidos para entubar 2 que contenga 3,5 μg de DD-Cas9 que contenga sgRNA clonado, 6 μg del plásmido de envasado (psPAX2) y 3 μg del plásmido de envoltura (pMD2.G) en 500 μL de medio caliente.
      3. Mezclar el tubo 1 con el tubo 2 para formar una mezcla de transfección e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
      4. Gota a gota la mezcla de transfección a células HEK293T y placa de incubación en la incubadora de cultivo de tejidos, a 5% co2 y 37 °C durante la noche.
      5. Después de 18 h, cambie cuidadosamente el medio a 10 ml de DMEM fresco con 10% de FBS para eliminar el reactivo de transfección. Incubar durante las próximas 48 h.
      6. Después de 48 h, recoger el sobrenadante con una jeringa de 10 ml y pasarlo a través de un filtro de 0,45 μm.
      7. Alícuota y almacene el sobrenadante del virus a -80 °C.

7. Determinación del título del virus y la eficacia de la transducción con citometría de flujo

  1. Seque las células HEK293T con 5 x 105 células / pozo en una placa de 6 pozos. Células de semillas en dos placas de 6 pozos. Use un plato para contar al día siguiente.
  2. Incubar las placas en la incubadora a 37 °C, 95% de humedad, 5% de CO2 durante la noche para alcanzar un 50-60% de confluencia al día siguiente.
  3. Al día siguiente, use una de las placas de 6 pozos para contar las células en 6 pozos.
  4. Descongele la alícuota del virus que se utilizará para realizar la dilución en serie y agregue 8 μg / ml de reactivo de polibreno.
  5. Preparar DMEM con FBS al 10% para la dilución seriada del virus y añadir 8 μg/mL de reactivo de polibreno.
  6. Preparar 2 ml de diluciones en serie diez veces del lentivirus de 1 x 10-1 a 1 x 10-4 en medios que contengan polibreno.
  7. Retire los medios de la placa de 6 pozos y agregue 1 ml de diluciones virales a los pozos. Deje uno bien con los medios solos como control negativo y otro bien con el virus al 100%.
  8. Incubar células con el virus en la incubadora durante 24 h.
  9. Al día siguiente, retire el medio con virus de las placas de 6 pozos y cámbielo por 2 ml de DMEM fresco con 10% de FBS. Incubar células durante 48-72 h. Observe la GFP usando un microscopio fluorescente todos los días.
  10. Después de 48-72 h, separe las celdas y vuelva a suuspend en el búfer MACS.
  11. Utilice un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de expresión de GFP.
  12. Calcular el título del virus utilizando la siguiente fórmula: TU/mL = (Número de células transducidas x Porcentaje fluorescente x Factor de dilución)/(Volumen de transducción en ml)

8. Transducción lentiviral de células diana

  1. Platear la línea celular de interés a una placa de 10 cm e incubar durante la noche para alcanzar la confluencia 50-60% al día siguiente.
    NOTA: Utilizamos la línea celular A549 que expresa DD-Cas9 y dos sgRNAs independientes del gen RPA3. También utilizamos el vector de expresión de la línea celular A549 con control Renilla. Se sembraron esas células a la densidad de 2 x 103células/cm2 y las incubamos a 37 °C, 95% de humedad, 5% de CO2 durante la noche para alcanzar el 50-60% de confluencia al día siguiente. Utilizamos medios RPMI con 10% de FBS filtrado. Continuamos con los siguientes pasos:
  2. Al día siguiente, infecte las células con 500-2000 μL de partículas de virus en 10 ml de volumen total de medio de cultivo. Incubar medios virales durante 24 h.
  3. Al día siguiente, cambie los medios virales a medios de cultivo y determine el porcentaje de células GFP positivas mediante citometría de flujo.
  4. Seleccione las células GFP positivas mediante la clasificación de células FACS o mediante la selección de bleomicina.
  5. Expanda las celdas seleccionadas positivamente y congele un stock.

9. Inducción condicional de la edición de genes mediada por Cas9

  1. Placa seleccionada positivamente las células 24 h después de la infección, así como las células no transducidas a la placa de 12 pozos por separado. Espere hasta que las células se adhieran y cambie el medio a medios de cultivo celular que contengan 200 nM de Shield-1. Reemplace el medio en las placas con células transducidas y no transducidas, dejando 2 pozos por placa con medios regulares como control negativo.
  2. Incubar y extraer proteínas de cada pozo en diferentes puntos temporales: tiempo 0, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h y 72 h después de agregar el Shield-1 a los pozos.
  3. Luego retire el medio con Shield-1 del resto de los pozos y cámbielo por medios celulares normales.
  4. Recoge las proteínas de esos pozos 2 h, 6 h y 12 h después de cambiar los medios.
  5. Visualizar mediante análisis western blot la reversibilidad y rapidez de la regulación desestabilizada de la proteína DD-Cas9 tras la adición y retirada de su ligando, Shield-1. Use anticuerpos dirigidos hacia DYKDDDDK Tag para visualizar proteínas y un anticuerpo de control dirigido, por ejemplo, beta-tubulina.
  6. Determinar la dosis óptima de Shield-1 por la curva dosis-respuesta observada por el análisis de Western Blot.

10. Validación de la edición de genes

NOTA: Los ensayos de expresión de GFP, como el análisis de citometría de flujo y el marcador de selección de bleomicina, solo confirman la entrega exitosa del reactivo CRISPR, pero no determinan si la secuencia deseada se dirigió con éxito. Los ensayos más comunes para confirmar el éxito de la orientación génica mediante el experimento CRISPR son la secuenciación del ADN de Sanger, la secuenciación de próxima generación, el ensayo surveyor nuclease, el ensayo tracking of Indels by Decomposition (TIDE) o el análisis de western blot16,17,18.

  1. Placa de células seleccionadas positivamente y cambio de medios a 200 nM de medios que contienen Shield-1. Incubar células durante 5 días, cambiando de medio con Shield-1 cada 3 días.
  2. Utilice las técnicas de validación mencionadas anteriormente 5 días después de la inducción de DD-Cas9 por Shield-1.

Resultados

Para permitir la expresión condicional de Cas9, desarrollamos una construcción de vector lentiviral dual que consiste en un promotor impulsado por U6 para expresar constitutivamente sgRNA, y un promotor de núcleo EF-1α para impulsar la expresión de la proteína de fusión DD-Cas9 (Figura 1A)19. Como paradigma para ilustrar la robustez y eficiencia del sistema, transducimos la línea celular carcinomatosa de pulmón A549 con el con...

Discusión

La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la capacidad de interrogar funcionalmente genomas2. Sin embargo, la inactivación de genes a menudo resulta en letalidad celular, déficits funcionales y defectos de desarrollo, lo que limita la utilidad de tales enfoques para estudiar las funcionesde los genes 7. Además, la expresión constitutiva de Cas9 puede dar lugar a toxicidad y a la generación de efectos fuera del objetivo6. Se han desarrollado di...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros anteriores de nuestro laboratorio y al científico Serif Senturk por su trabajo anterior. Agradecemos a Danilo Segovia por leer críticamente este manuscrito. Este estudio fue posible y apoyado por Swim Across America y el programa Cancer Target Discovery and Development Center del Instituto Nacional del Cáncer.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100mM DTTThermosfisher
10X FastDigest bufferThermosfisherB64
10X T4 Ligation BufferNEBM0202S
colorimetric BCA kitPierce23225
DMEM, high glucose, glutaMaxThermo Fisher10566024
FastAPThermosfisherEF0654
FastDigest BsmBIThermosfisherFD0454
Flag [M2] mouse mAbSigmaF1804-50UG
Genomic DNA extraction kitMacherey Nagel740952.1
lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
oligonucleotidesSigma Aldrich
pMD2.GAddgene12259
polybreneSigma AldrichTR-1003-G
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
secondary antibodiesLICOR
Shield-1Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cellsThermofisherC737303
SURVEYOR Mutation Detection KitTransgenomic/IDT
T4 PNKNEBM0201S
Taq DNA PolymeraseNEBM0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAbMilliporeCP06-100UG

Referencias

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