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要約

ここでは、低分子Shield-1の下で定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(Cas9)の時間的および条件付き安定化に基づくゲノム編集ツールについて説明する。この方法は、培養細胞および動物モデルに使用することができる。

要約

クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)技術は、ゲノムに正確で標的化された改変を導入するための一般的な実験室ツールとなっています。その巨大な人気と急速な普及は、その前任者に比べてその使いやすさと精度に起因しています。しかし、システムの構成的な活性化は限られた用途を有する。本論文ではCas9タンパク質の条件安定化に基づくCRISPR/Cas9活性の時間的制御を可能にする新しい方法について述べた。ラパマイシン結合タンパク質FKBP12の操作された変異体をCas9(DD-Cas9)に融合させることで、FKBP12合成リガンド(Shield-1)の存在により安定させることができるCas9の急速な分解が可能になります。他の誘導可能な方法とは異なり、このシステムは、第2の遺伝子の条件付き調節なしに、関心のある別の遺伝子とDD-Cas9を共発現させるバイシストロニック系を生成するように容易に適応することができる。この方法は、追跡可能なシステムの生成だけでなく、Cas9ヌクレアーゼによって標的とされる対立遺伝子の平行、独立した操作を可能にする。この方法のプラットフォームは、必須遺伝子の系統的同定と特徴付け、およびin vitroおよびin vivo設定における遺伝子の機能的相互作用の尋問に使用することができる。

概要

CRISPR-Cas9は、定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復関連タンパク質9"を表すCRISPR-Cas9は、細菌適応免疫1,2に関する研究の一環として初めて発見された。今日、CRISPR/Cas9はプログラム可能な遺伝子編集のための最も認識されたツールとなっており、システムの異なる反復は、転写およびエピジェネティックな変調を可能にするために開発されています3.この技術は、DNA4のほぼすべての配列の非常に正確な遺伝子操作を可能にする。

CRISPR遺伝子編集の必須コンポーネントは、カスタマイズ可能なガイドRNA配列とCas9ヌクレアーゼ5です。RNAガイドはDNA中の標的相補配列に結合し、Cas9ヌクレアーゼをゲノム3,4の特定の時点で二本鎖破断を行うように指示する。得られた切断部位は、次いで非相同性エンド結合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)によって修復され、その結果、標的DNA配列5に変化が導入された。

CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集は使いやすく、以前の遺伝子編集技術に比べて比較的安価であり、システム2、4、5の多重度において効率的かつ堅牢であることが証明されている。しかし、システムはいくつかの制限を提示します。Cas9の構成的な表現は、しばしばオフターゲットの増加数と高い細胞毒性4、6、7、8をもたらすことが示されている。さらに、Cas9による必須および細胞生存遺伝子の構成的標的化は、細胞死の運動学的研究のような特定のタイプの機能研究を行う能力を奪う7。

これらの問題に対処するために、Tet-ON や Tet-OFF9など、さまざまな誘導可能なまたは条件付きで制御された CRISPR-Cas9 ツールが開発されています。部位特異的組換え10;化学的に誘発された近接性11;インテイン依存スプライシング3;4-ヒドロキシタモキシフェンエストロゲン受容体(ER)ベース核局在化システム12.一般に、これらの手順の大部分(インテインスプライシングおよび化学的に誘発された近接分割システム)は、可逆的な制御を提供せず、薬物治療に対する非常に遅い運動応答(Tet-On/Offシステム)を提示するか、またはハイスループット操作6に適していない。

これらの制限に対処するために、我々は、高速かつ堅牢な時間制御遺伝子編集を提供するだけでなく、高スループット遺伝子操作にトレーサビリティ、タンナビリティ、無時性を保証する新しいツールキットを開発しました。この新しい技術は、細胞株、オルガノイド、および動物モデルに使用することができます。私たちのシステムは、Cas9に融合すると、その急速な劣化を誘発する、工学的ドメインに基づいています。しかし、非常に選択的で非毒性の細胞透過性の低分子で急速に安定化することができます。より具体的には、ヒトFKBP12変異体「不安定化ドメイン」(DD)をCas9に設計し、哺乳動物細胞13で発現したユビキチン・プロテアソーム系を介して迅速かつ構成的な分解を行うためにCas9をマーキングした。DD合成リガンドは、Shield-1がDD立体構造を安定化させることができ、非常に効率的な方法でDD(Cas9など)に融合したタンパク質の分解を防ぎ、かつ速い運動応答14,15を有する。注目に、Shield-1は、その野生型の対応する14よりも突然変異FKBP12に3桁の重さで結合します。

DD-Cas9/Shield-1ペアは、ミトコンドリアの代謝に重要な役割を果たすCypD遺伝子を条件付きで標的化することによって、培養細胞および動物モデルにおける必須遺伝子の体系的同定と特徴付けを研究するために使用することができます。EGFR、発癌性転換の主要プレーヤー;そしてTp53、DNA損傷応答の中心遺伝子。一時的および条件付きの遺伝子編集に加えて、この方法のもう一つの利点は、DD-Cas9の安定化がその転写に依存しない点である。この機能は、同じプロモーターの下で、エストロゲン受容体依存リコンビナーゼ、CREERなどのリコンビナーゼと同様に追跡可能なマーカーの共発現を可能にする。本研究では、DNA複製遺伝子、RPA3などの条件付きで標的化するために、インビトロで我々の方法をうまく使用する方法を示す。

プロトコル

1.DD-Cas9 ベクトル

  1. Addgene(フィラーシーケンスと金星(EDCPV)、プラスミド90085を有するDD-Cas9ベクターを得る。
    注:これは、EFSプロモーターがDD-Cas9転写を駆動している間、単一のガイドRNA(sgRNA)転写を駆動するU6プロモーターを備えたレンチウイルスDD-Cas9プラスミドです。DYKDDDDK配列(フラグタグ)は、Cas9のC末端に存在し、続いてDD-Cas9と修飾蛍光タンパク質Venus(mVenus)を分離する2A自己切断ペプチド(P2A)が続きます。

2. 小型ガイドRNA(sgRNA)設計

  1. 特定のゲノム領域を対象とする複数のアルゴリズムのいずれかを使用して、DD-Cas9ベクターにクローン化される小さなガイドRNA(sgRNA)を設計します。
    注: オフターゲット効果を低減するには、ウェブサイトを使用して最高スコアの sgRNA 配列を選択 http://crispr.mit.edu します。
  2. sgRNA配列ごとに2つのオリゴヌクレオチドを設計し、注文して完全なsgRNAを作ります。
    注:プラスミドはBsmBI酵素によって消化されるため、BsmBI消化オーバーハングをsgRNA配列に加えてフォワードオリゴヌクレオチドを設計します。 表 1のテンプレートを使用します。

3. レンチウイルスDD-Cas9ベクターへのsgRNAのクローニング

  1. 制限酵素消化反応にアルカリホスファターゼ(FastAP)を用い、DD-Cas9プラスミドの5′末端を脱リン酸化する。
    注: ベクターは、特に単一の制限酵素によって線形化される場合、ライゲーション中に再循環することができます。ベクターが再循環しないようにするには、ホスファターゼを直接消化反応に加えてプラスミドを脱リン酸化します。
    1. DD-Cas9プラスミド5μg、6μLの消化バッファー(10x)、0.6 μLのDTT(100 mM)、3 μLのBsmBI、3 μLのFastAPを、最大60μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、60μLの全容量反応を作り、60μLの分解液を加えて、BsmBI酵素を用いてプラスミドを消化します。
      注: 最後に、混合に BsmBI 酵素と FastAP を追加します。
    2. 37°Cのヒートブロックまたはサーモサイクラーで30分間、混合物をインキュベートします。
  2. 消化されたDD-Cas9プラスミドを精製します。
    1. 0.8%のDNAアガロースゲルを調製し、不完全に消化されたプラスミドと酵素の痕跡を取り除きます。より良い分離のためにより広いゲルくめきを使用し、90 Vでゲルを実行します。
    2. 360-365 nm UV光の下でバンドを視覚化し、より大きなプラスミドバンドをゲルから切り取ります。フィラーに対応する2 kbのフラグメントを破棄します。
    3. 市販のゲル精製キットを使用して、大きなカットゲルバンドを精製し、メーカーの指示に従ってください。
  3. 消化されたDD-Cas9プラスミドとリゲートアニールオリゴ。
    1. sgRNAオリゴをリン酸化およびアニールする。
      1. T4ライゲーションバッファー(10x)の1 μL、オリゴ1(100 μM)の1 μL、オリゴ2(100 μM)の1 μL、ヌクレアーゼフリー水6.5μLの混合を準備します。最後に、T4 PNKの0.5 μLを加えます。この反応の総容積は10μLである。
      2. サーモサイクラーに反応ミックスを加え、30分間37°C、5分間95°C、5°Cの速度で25°Cまでランプダウンします。
        注: PNK は、オリゴヌクレオチドがライゲーションに入れる前に熱不活性化する必要があります。リン酸化工程およびアニーリング工程は、サーモサイクラーで一緒に行われる。5'リン酸がsgRNAオリゴヌクレオチドに添加されるリン酸化工程は、ライゲーションが起こるために必要とされる。
    2. リゲート DD-Cas9 消化プラスミドと sgRNA オリゴ.
      1. アンニールオリゴをヌクレアーゼフリー水で1:200に希釈し、ライゲーション反応にプラスミドDNAを50ng使用します。
        注:6インサート:1ベクターのモル比を使用して、挿入統合を促進するか、またはライゲーション計算機を使用してモル比を計算します: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation。
      2. ライゲーション反応ミックスを調製:50ngの消化精製DD-Cas9ベクター、希釈されたアニールオリゴの適切な体積、T4ライゲーションバッファー(10x)の1μL、T4 DNAリガーゼの1μL、最大10μLヌクレアーゼフリー水、反応10μLの総体積を得る。
      3. 「高濃度」リガーゼを使用する場合は、反応を室温で5分間インキュベートします。それ以外の場合は、室温で2時間インキュベートし、またはライゲーションのより高い収率を達成するために、一晩16°Cでインキュベートする。
        注:標準T4 DNAリガーゼを65°Cで20分間使用した場合は熱不活性化。リガーゼマスターミックスを使用している場合は、加熱不活性化しないでください。

4. 細菌の変容

  1. 室温で10cmLB-アンピシリン寒天プレートを温める前に。
  2. 氷の上に「ワンショットStbl3」有能な細菌細胞の50 μLを解凍します。
  3. 2~3 μLのライゲーション混合物を50 μLの有能な細菌細胞に加え、チューブの底部を指で4回軽く混ぜます。氷の上で30分間インキュベートします。
  4. タイマーを使用して、正確に42°Cで40秒間セルを加熱衝撃します。氷上の細菌細胞を5分間冷まします。
  5. 抗生物質を含まないSOC培地500μLを細菌細胞に加え、37°Cで45分間250rpmで振度インキュベーターで増殖させます。
  6. 100 μLの形質転換菌を温め前のLBアンピシリンプレートに広げ、37°Cで一晩インキュベートします。

5. 合字プラスミドのミニ/マキシ準備

  1. マキシ/ミニプレップスターターカルチャーを準備します。
    1. 翌日、単一の細菌クローンを選び、アンピシリンを含む8 mLのLB培地でスターター培養を接種する。
    2. 250 rpm、37°Cで10〜12時間の振盪インキュベーターで細菌を増殖させます。
    3. ミニ準備のための細菌の3〜5 mLを使用するか、マキシ準備のためのスターター培養としてそれを使用してください。細菌培養の比率で100%グリセロールを添加することにより細菌グリセロールストックとして細菌の残りの部分を使用する:グリセロールは1:1です。
      注: ここでは、ミニ準備手順について説明します。
  2. ミニ準備手順
    1. 3~5 mLの細菌細胞と遠心分離機を12,000 x gで1分間収穫します。
    2. 細菌細胞のペレットを、RNase Aを含む200 μLのP1バッファーで再懸濁し、4°Cで保存します。
    3. バッファーP2の200 μLを加え、液体が明確になるまでチューブを10回反転して穏やかに混ぜます。
    4. 300 μLのバッファー P3 を加え、チューブを 10 回反転して混ぜます。液体が濁ります。12,000 x g でサンプルを 10 分間遠心して直ちに進みます。
    5. スピンカラムに透明な上清を、12,000 x gで遠心分離機に1分間移動します。
      フロースルーを破棄します。
      注: 上清が明確になっていることを確認してください。粒子は、スピンカラムを詰まらせ、カラムの有効性を低下させることができます。
    6. PDバッファーと遠心分離機を12,000 x gで1分間400 μL加えます。フロースルーを破棄します。
    7. 600 μL の PW バッファを加えて、スピンカラムと遠心分離機を 12,000 x g で 1 分間洗浄します。フロースルーを破棄します。
    8. 遠心分離機は、再び、スピンカラムを最高速度で3分間、バッファー残基を除去する。フロースルーを破棄し、2分間座らせます。
    9. スピンカラムをフレッシュチューブに入れ、50 μLの溶出バッファーを追加します。5分間インキュベートし、遠心分離機を最高速度で2分間インキュベートします。
    10. ナノドロップデバイスを使用して、sgRNAインサート(ng/μL)を使用して精製されたDD-Cas9プラスミドの濃度を測定します。
  3. DD-Cas9プラスミドのDNAシーケンシングによるsgRNAクローニングを検証します。 表 2で U6 プライマーシーケンスを使用します。

6. レンチウイルス製剤

  1. トランスフェクション用のHEK293T包装セルを用意します。
    1. 正常なHEK293Tを10まで使用し、密度1〜2 x106細胞あたり10cmの組織培養プレートで均等に播種します。10%ろ過した牛胎児血清(FBS)とグルコースダルベックコの修正イーグル培地(DMEM)の10 mLを使用してください。組織培養インキュベーター内の細胞をインキュベートし、5%CO2及び37°Cで20時間用いた。
    2. 翌日、明視野顕微鏡で細胞が70%の合流率に達し、プレート全体に均等に分散していることを確認します。培地をトランスフェクションの1時間前に最終体積10mLで変える。
      注:メディアは抗生物質と抗ミコティックを欠いてはならない。
    3. 500 μL の温かい媒体(例えば、OptiMEM)との2つの管の混合物を準備する。
      1. 25 μLのトランスフェクション試薬を、暖かい500 μLの培地を含むチューブ1に加え、室温で5分間インキュベートします。
      2. 一方、クローンsgRNAを含むDD-Cas9の3.5 μg、包装プラスミド(psPAX2)6 μg、および3μgのエンベローププラスミド(pMD2.G)を含むプラスミドをチューブ2に混合して、500μLの培地を暖かく調製します。
      3. チューブ1とチューブ2を混合してトランスフェクション混合物を形成し、室温で20分間インキュベートする。
      4. トランスフェクション混合物をHEK293T細胞に滴下し、培養インキュベーターでプレートをインキュベートし、一晩で5%CO2および37°Cで行う。
      5. 18時間後、培地を10%FBSで10mLの新鮮なDMEMに慎重に交換し、トランスフェクション試薬を除去する。次の48時間のインキュベート。
      6. 48時間後、上清を10 mLのシリンジで回収し、0.45 μmフィルターを通します。
      7. アリコートと -80 °Cでウイルス上清を保管してください。

7. フローサイトメトリーによるウイルス力細胞およびトランスダクション効果の決定

  1. HEK293T細胞に5 x 105 個の細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種します。2つの6ウェルプレートに細胞を播種します。次の日にカウントするために1つのプレートを使用してください。
  2. 37°C、湿度95%、CO2の5%を一晩でインキュベーターでインキュベートし、翌日50~60%の合流度に達します。
  3. 翌日、6ウェルプレートの1つを使用して、6つのウェルの細胞を数えます。
  4. シリアル希釈を行うために使用されるウイルスアリコートを解凍し、ポリブレン試薬の8 μg/mLを添加します。
  5. ウイルスの連続希釈のために10%FBSでDMEMを調製し、ポリブレン試薬の8 μg/mLを加えます。
  6. ポリブレン含有培地でレンチウイルスの10倍の連続希釈液を1 x10-1 から1 x10-4 に2mL調製する。
  7. 6ウェルプレートから培地を取り出し、1 mLのウイルス希釈液をウェルに加えます。ネガティブコントロールとしてメディアを単独で1ウェルのままにし、100%ウイルスで1井戸を残します。
  8. 24時間インキュベーターにウイルスを含む細胞をインキュベートする。
  9. 翌日、6ウェルプレートからウイルスを含む培地を取り除き、10%FBSで新鮮なDMEMの2mLに変更します。48-72時間の細胞をインキュベートする。蛍光顕微鏡を毎日使用してGFPを観察します。
  10. 48~72時間後、セルを取り外し、MACSバッファで再中断します。
  11. フローサイトメーターを使用して、GFP発現の割合を決定します。
  12. 次の式を使用してウイルス価率を計算します: TU/mL = (蛍光度 x 希釈係数のパーセントを導入した細胞の数)/(mL内のトランスダクション体積)

8. 標的細胞のレンチウイルス伝達

  1. 関心のある細胞株を10cmのプレートにプレートし、翌日に合流率50〜60%に達するために一晩インキュベートします。
    注:DD-Cas9と2つの独立したRPA3遺伝子sgRNAを発現するA549細胞株を使用しました。また、レニラコントロールを用いたベクターを表現するA549細胞株も使用しました。これらの細胞を2 x 103細胞/cm2の密度で播種し、37°C、湿度95%、CO25%で一晩にインキュベートし、翌日50~60%の合流度に達しました。10%フィルタリングされたFBSでRPMIメディアを使用しました。次の手順を実行します。
  2. 翌日、培養培地の総体積を10mLで500-2000μLのウイルス粒子で細胞に感染させる。24時間のウイルス培地をインキュベートする。
  3. 翌日、ウイルス培地を培養培地に変更し、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞の割合を決定する。
  4. FACS セルの並べ替えまたはブレオマイシン選択を使用して GFP 陽性セルを選択します。
  5. 正のセルを展開し、ストックを固定します。

Cas9媒介遺伝子編集の条件付き誘導

  1. 正に選択された細胞24時間後に、また12ウェルプレートに未透過細胞を別々に選んだ。細胞が付着し、200 nMのShield-1を含む細胞培養培地にメディアを交換するまで待ちます。プレート内のメディアをトランスデューセおよび未透過細胞に置き換え、プレートあたり2つのウェルを通常のメディアを陰性対照として残します。
  2. 異なる時点で各ウェルからタンパク質をインキュベートし、抽出します:時間0、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、および72 hをウェルに追加した後。
  3. その後、シールド-1でメディアを残りのウェルから取り外し、通常のセルメディアに変更します。
  4. これらのウェルからタンパク質を収集 2 h, 6 h, 12 メディアを変更した後、 12 時間.
  5. ウェスタンブロット分析により、そのリガンドShield-1の添加と離脱後の不安定化したDD-Cas9タンパク質調節の可逆性と迅速性を可視化します。DYKDDDDKタグに向けられた抗体を使用して、タンパク質および対照抗体を例えばβ-チューブリンを標的に可視化します。
  6. ウェスタンブロット解析で観察した線量応答曲線によりShield-1の最適用量を決定する。

10. 遺伝子編集の検証

注: フローサイトメトリー解析やブレオマイシン選択マーカーなどのGFP発現アッセイはCRISPR試薬の正常な送達を確認するだけですが、目的の配列が正常に標的化されたかどうかは判断しません。CRISPR実験による成功した遺伝子標的化を確認するための最も一般的なアッセイは、サンガーDNAシーケンシング、次世代シーケンシング、測量者ヌクレアーゼアッセイ、分解によるインデルの追跡(TIDE)アッセイ、またはウェスタンブロット分析16、17、18である。

  1. 正に選択した細胞をプレートし、メディアを含むShield-1の200 nMにメディアを交換します。細胞を5日間インキュベートし、3日ごとにShield-1で培地を交換します。
  2. シールド-1によるDD-Cas9誘導の5日後に上記の検証技術を使用してください。

結果

Cas9の条件式を可能にするため、SgRNAを構成的に発現させるU6駆動プロモーターと、DD-Cas9融合タンパク質の発現を駆動するEF-1αコアプロモーターからなる二重レンチウイルスベクター構築物を開発した(図1A)19。システムの堅牢性と効率を説明するパラダイムとして、レンチウイルス構築物を用いた肺癌腫A549細胞株を導入した。リ...

ディスカッション

CRISPR/Cas9技術は、機能的にゲノム2を尋問する能力に革命を起こしました。しかし、遺伝子の不活性化は、しばしば細胞の致死性、機能的欠陥、および発生欠陥をもたらし、遺伝子機能を研究するためのそのようなアプローチの有用性を制限する7。さらに、Cas9の構成的な表現は、毒性およびオフターゲット効果6の生成をもたらす可能性が?...

開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

私たちの研究室の以前のメンバーと科学者のセリフ・セントゥルクに前の研究に感謝します。この原稿を批判的に読んでくださったダニーロ・セゴビアに感謝します。この研究は、スイム・アクロス・アメリカと国立がん研究所がんターゲット発見開発センタープログラムによって可能であり、支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100mM DTTThermosfisher
10X FastDigest bufferThermosfisherB64
10X T4 Ligation BufferNEBM0202S
colorimetric BCA kitPierce23225
DMEM, high glucose, glutaMaxThermo Fisher10566024
FastAPThermosfisherEF0654
FastDigest BsmBIThermosfisherFD0454
Flag [M2] mouse mAbSigmaF1804-50UG
Genomic DNA extraction kitMacherey Nagel740952.1
lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
oligonucleotidesSigma Aldrich
pMD2.GAddgene12259
polybreneSigma AldrichTR-1003-G
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
secondary antibodiesLICOR
Shield-1Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cellsThermofisherC737303
SURVEYOR Mutation Detection KitTransgenomic/IDT
T4 PNKNEBM0201S
Taq DNA PolymeraseNEBM0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAbMilliporeCP06-100UG

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