تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Summary

تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

Abstract

تقييم الصورة العالمية للنوبولوجيا سلسلة في كل مكان داخل البروتيوم هو من المهم الإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. البروتوكول المبين هنا يستفيد من تعديل دي غليسين (-GG) المتبقي بعد الهضم المحاولة من يوبيكيتين أدرجت في سلسلة. من خلال تحديد كميا هذه الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية يمكن تحديد الوفرة النسبية لكل طوبولوجيا سلسلة في كل مكان. وتفيد التقارير بأن الخطوات اللازمة لقياس هذه الببتيدات من خلال تجربة موازية لرصد التفاعل تأخذ في الاعتبار استقرار سلاسل كل مكان. يتم وصف إعداد الضوابط الثقيلة ، وتحلل الخلية ، والهضم جنبا إلى جنب مع إعداد مطياف الكتلة المناسبة وسير عمل تحليل البيانات. يتم تقديم مثال على مجموعة البيانات مع الاضطرابات في طوبولوجيا كل مكان ، مصحوبة بأمثلة عن كيفية تحسين البروتوكول يمكن أن تؤثر على النتائج. باتباع الخطوات المبينة ، سيتمكن المستخدم من إجراء تقييم عالمي لمناظر طوبولوجيا كل مكان في سياقه البيولوجي.

Introduction

التنظيم الوثيق لوظيفة البروتين والاستقرار له أهمية قصوى ، لأنها محركات رئيسية للسيطرة على علم الأحياء. يتم بناء وظيفة البروتين من عنصرين: تسلسله البوليبتيد الجوهري وأي تعديلات ما بعد النقل (PTMs). وقد تم تحديد مختلف PTMs الكيميائية بما في ذلك الجليكوزيليشن، الفوسفور، أسيتيل، والمثيلة¹. في عام 1975، حدد غولدشتاين وآخرون² بروتين صغير وأطلق عليه اسم يوبيكيتين بسبب طبيعته في كل مكان. تم العثور على يوبيكيتين أن تكون مهمة في تدهور البروتين³. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ثبت أن وظيفة كل مكان كجزيء إشارات تمتد إلى ما هو أبعد من تنظيم استقرار البروتين. وتشارك إشارة يوبيكيتين في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية الأخرى, مثل استقرار البروتين, autophagy, خلية التحكم في دورة, والاتجار البروتين⁴.

في حين أن PTMs الأخرى ثنائية بشكل عام (أي يتم تعديل البروتين أو تركه غير معدل) لموقع معين ، يمكن أن يعدل ubiquitin بروتينا سواء كمونومر أو كسلسلة بوليمرية ، مع وجود كل مكان مرفق في حد ذاته في كل مكان. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتطور سلسلة تعدد الأضلاع هذه في العديد من طبولوجيا مع انتشار كل مكان في كل مكان سابق يرتبط بأحد مواقع الربط الثمانية^5،6. يتم نقل يوبيكيتين بواسطة عملية انزيمية متعددة الخطوات (الشكل 1) حيث يرتبط C-terminus من كل مكان إلى واحدة من بقايا اليسين السبعة (K06، K11، K27، K29، K33، K48، أو K63) أو N-محطة من ubiquitin السابقة (يشار إليها باسم M1 أو كل مكان خطي)^5،6. هذه الطوبولوجيا السلسلة هو المفتاح لمصير البروتين قيد التعديل. على سبيل المثال ، فإن التعديل مع سلسلة K48 أو K11 المرتبطة يؤدي إلى تدهور البروتين المعدل في proteasome ، في حين أن سلسلة خطية ضرورية لتنشيط إشارات NF-kB. وبالتالي، فإن التوزيع النسبي لهذه السلاسل من طبولوجيا ذات صلة بمجموعة واسعة من المسائل البيولوجية.

استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) هو ذات فائدة خاصة لتحليل طوبولوجيا سلسلة ubiquitin كما أنها لا تعتمد على التفاعلات القائمة على الأجسام المضادة أو تقارب القائم^7،8، وكثير منها محدودة خصوصية ولا تفرق بين أنواع السلسلة المختلفة. وهناك احتمال مختلف للكشف هو استخدام المسوخ المعدلة وراثيا في كل مكان. هنا, يتم استبدال ليسين محددة للأرجينيين, التي لا يمكن أن تدعم التعديل عن طريق كل مكان. ثم يتم تفسير عدم وجود تشكيل سلسلة في كل مكان على بروتين الركيزة كدليل على طوبولوجيا محددة⁹.

ويستند تحديد MS القائم على البروتينات في كل مكان على حقيقة أن C-terminus من كل مكان يحتوي على بقايا أرجينين في الموقف 74 التي يتم التعرف عليها من قبل تريبسين أثناء إعداد بروتيوليك من العينات لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد, فصل الجليسين المزدوج C-المحطة الطرفية. هذا غليغلي (-GG) لا تزال تعلق على مجموعة الأمينية ε من بقايا اليسين من بروتين الركيزة. لتحليل طوبولوجيا في كل مكان، يحدث التعديل على واحدة من بقايا اليوزين السبعة في كل مكان. وهذا يخلق مجموعة من سبعة الببتيدات الرئيسية التي تحمل بقايا ليسين التي يتم تعديلها من قبل GG، محددة لكل من طبولوجيا(الشكل 2). على سبيل المثال، مع طوبولوجيا K06، سيتم حماية ال ليسين في الموقف 6 على تسلسل الأحماض الأمينية من الهضم المحاولة مع تعديل -GG من 114 دا إضافة إلى هذا اليوزين.

ويشار إلى تحديد الببتيدات محددة سلفا من قبل MS كما proteomics المستهدفة، أو على وجه التحديد، اقتناء الببتيد^{المستهدفة 10}. وقد تم تطوير طريقتين اعتمادا على أداء مطياف الكتلة المستخدمة. هذه هي رصد رد الفعل المختار (SRM) ، وتسمى أيضا رصد ردود الفعل المتعددة (MRM) ، ورصد التفاعل الموازي (PRM). SRM ينطوي على اختيار التحولات التي تتكون من السلائف م / ض والمنتج أيون م / ض. وعلى العكس من ذلك، لا يتطلب إجراء إعادة المتر سوى السلائف m/z. بعد التحديد، يتم إجراء مسح كامل لعملية مسح أيونات المنتج. هذا له ميزة أنه لا يوجد اختيار أيونات المنتج المناسب للكمية على مطياف الكتلة محددة ضروري قبل القياس¹¹. ويمكن جدولة كل من إدارة الموارد البشرية واستراتيجية الحد من الفقر، اعتمادا على الصك. الجدولة هي ممارسة تعيين نافذة زمنية يتم خلالها تضمين أيون معين للتحليل ، حيث أن الببتيدات يتم تهييثها في أوقات احتجاز محددة من النظام الكروماتوغرافي. ويؤدي تخفيض عدد الأيونات التي يجري استجوابها في أي وقت من الأوقات إلى زيادة وتيرة استجواب تلك الأيونات المقرر إجراؤها في ذلك الوقت، مما يحسن دقة البيانات.

بشكل عام ، فإن تطبيق البروتيوميات المستهدفة لطبولوجيا كل مكان هو نفس أي تجربة بروتيوميات مستهدفة أخرى. ومع ذلك، هناك اختلافان رئيسيان مهمان: أولا، يجب النظر في استقرار سلاسل البيكيتين. هناك العديد من الإنزيمات القوية التي تتحلل بسرعة عند تحلل الخلايا. وproteases في كل مكان محددة تندرج في فئتين، وthioesterases و metalloproteases. معظم الهيدرولاسيس في كل مكان هي ثيويستراس وتحمل بقايا السيستين في مركزها النشط. عن طريق الألكيلات هذه بقايا السيستين، يمكن تعطيلها. على هذا النحو ، فإن استخدام مخازن تثبيت في كل مكان تحتوي على عوامل الألكيلات ، مثل N-ethylmaleimide (NEM) ، والمواد الكيميائية عالية الإزالة ، والحفاظ على العينات المبردة أمر حيوي لتحليل ناجح. ثانيا، على عكس التجارب المستهدفة الأخرى، يتم إصلاح خيار الببتيد. في تجربة نموذجية مستهدفة ، يمكن اختيار الببتيد البروتيوتيبيك لأداء كروماتوغرافي وتأين جيد. بالنسبة لبعض الببتيدات المميزة للطبولوجيا مثل K48 ، فإن هذه الخصائص جيدة ، بينما بالنسبة للآخرين ، فهي أقل جاذبية. على سبيل المثال ، K33 الكروماتوغرافيا في الإعداد نموذجية عكس المرحلة سيئة بسبب تشكيل ملف elution امتدت ، وضعف خصائص التأين من الببتيد K27 تقليل وضوحه من قبل MS¹².

في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية إجراء تقييم طوبولوجيا في كل مكان من عينة بيولوجية من قبل PRM. يتم تقديم بيانات مثال على الإجراء باستخدام اضطراب البروتيازوم باستخدام علاج مثبط MG-132 في عدة أنواع مختلفة من الخلايا.

Protocol

1. إعداد معيار الببتيد الثقيلة

1. اعتمادا على المورد وجودة الببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها ، فإن الببتيدات الثقيلة تحتاج إلى تخفيفها. استخدم هذا البروتوكول تسلسل الببتيد المبلغ عنها في الجدول 1، مع الأحماض الأمينية C-terminal المعدلة إلى ليسين⁽¹³C₆¹⁵N₂-lysine) أو أرجينين (¹³C₆¹⁵N₄- أرجينين).
   1. خلط الببتيدات الثقيلة، وتمييع المزيج مع 50٪ أسيتونيتريل (ACN) لإنشاء مزيج الببتيد مع كل الببتيد في 10 ميكرومتر.
   2. إنشاء aliquots من مزيج الببتيد وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد العينة

1. تحلل العينة
   ملاحظة: يجب مراعاة استقرار سلاسل ubiquitin أثناء إعداد العينة. الحفاظ على العينات البيولوجية والمخازن المؤقتة المبردة في 4 درجة مئوية وإضافة عينات إلى التخزين المؤقت استقرار ubiquitin في أسرع وقت ممكن.
   1. إعداد حل من 1 M NH₄HCO₃ (بيكربونات الأمونيوم) في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام 1 M NaOH.
   2. إعداد حل من 200 mM N-ethylmaleimide (NEM) في الماء.
   3. إعداد ubiquitin استقرار العازلة باستخدام 8 M اليوريا في 50 mM NH₄HCO₃/10 mM NEM. يجب أن تكون مستعدة يوبيكيتين استقرار العازلة طازجة في كل مرة.
      ملاحظة: سوف يتطلب محلول 5 مل من 8 M يوريا أقل بكثير من 5 مل من الماء نظرا لتوسيع المياه عندما تكون في محلول مشبع مع اليوريا.
      تنبيه: لا تعد العازل فوق 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا إلى تشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.
   4. Resuspend العينة البيولوجية التي سيتم التحقيق فيها في العازلة استقرار في كل مكان تهدف إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين وlyse الخلايا مع طريقة مناسبة للعينة. طريقة سونيكيشن تتكون من ثلاث نبضات 10 ق مع سونيفير برانسون SFX 150 تعيين في كثافة 70٪ مع فواصل 10 ق على الجليد بين كل نبضة، واستخدمت لخطوط الخلية في هذا البروتوكول.
   5. عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.
   6. نقل supernatant إلى أنبوب الطارد الدقيق ملزمة منخفضة البروتين الطازجة. يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية عند هذه النقطة إذا لزم الأمر.
2. إعداد العينة والضوابط
   1. إذا تم تجميد العينات، اخلط (على سبيل المثال، مع ثيرموميكسر) أثناء إذابتها لإذابة اليوريا بسرعة.
      تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.
   2. عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.
   3. نقل 20 ميكروغرام من العينة إلى أنبوب طرد دقيق منخفض الربط جديد وضبط مستوى الصوت إلى 50 ميكرولتر مع حاجز تثبيت كل مكان.
   4. إنشاء عنصر تحكم سالب باستخدام وحدة تخزين طبيعية من المخزن المؤقت لتثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). في هذه العينة ، لا ينبغي أن تكون هناك نسخة خفيفة من كل ببتيد ، مما يسمح بمراقبة أي تلوث خفيف ينشأ عن الببتيدات الثقيلة. واستخدمت هذه السيطرة السلبية أيضا لجدولة وقت الاحتفاظ ب PRM الموضحة في القسم 3-1.
   5. كما تم إنشاء سيطرة إيجابية مع التخزين المؤقت لتثبيت ubiquitin وإضافة أنواع السلسلة المتاحة تجاريا إلى الحجم الطبيعي لحاجز تثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). عادة، K63، K48، و M1 متوفرة. في النتائج التمثيلية 20 نانوغرام من K48، K63، و M1 استخدمت.
3. الحد، الألكيل، والهضم
   1. إعداد حل من بيكربونات الأمونيوم 50 mm (NH₄HCO₃) في الماء وضبط العينة إلى درجة الحموضة = 8 مع 1 M NaOH.
   2. تم طرد ثقافة الإشريكية القولونية التي تزرع في مرق LB 5000 × ز لمدة 5 دقائق لتشكيل بيليه ، والتي تم غسلها بعد ذلك 2x مع PBS قبل إعادة الإنفاق في حاجز تثبيت في كل مكان عند 5 ميكروغرام / ميكرولتر.
   3. أضف 1 ميكروغرام من lysate الإشريكية القولونية إلى كل عينة والتحكم. يستخدم هذا البروتوكول الإشريكية القولونية (DH10B)، ولكن يمكن استخدام أي lysate معقدة دون كل مكان. لاحظ أن كل مكان مشترك بين جميع eukaryotes.
      ملاحظة: استخدام مصفوفة lysate القولونية يقلل من فقدان الببتيدات بسبب التصاق غير محدد إلى الأواني البلاستيكية. هذا ملحوظ بشكل خاص في السيطرة السلبية أو عينات مع محتوى البروتين محدودة ولها تأثير قوي على مراقبة K63¹².
   4. إعداد حل من 500 مللي متر تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) في MS الصف المياه (DTT يمكن استخدامها كبديل).
   5. تقليل العينات والضوابط بإضافة TCEP إلى تركيز نهائي قدره 50 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إذا تم استخدام DTT، يجب رفع درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
      تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.
   6. إعداد حل من 550 mM الكلورواسيتاميد (CAA) في NH₄HCO₃. تخزين في الظلام.
   7. Alkylate العينات والضوابط بإضافة CAA إلى تركيز النهائي من 55 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام.
      ملاحظة: يستخدم CAA بدلا من iodoacetamide كعامل تخفيض لتقليل فرصة تعديل كارباميدوميثيل مزدوج (114.0429) على بقايا ليسين يجري مخطئا لتعديل -GG (114.0429)¹³.
   8. إضافة endopeptidase LysC إلى العينات في 1:25 (ث / ث) نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
   9. تمييع العينات والضوابط مع 200 ميكرولتر من 50 م م NH₄HCO₃ درجة الحموضة = 8 (1:5 v/v).
   10. إضافة تريبسين إلى العينات في 1:25 ث / ث نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية.
   11. إضافة 10٪ محلول حمض الفورميك (FA) في مياه درجة MS بنسبة 1:10 v/v إلى كل عينة وعينة تحكم. تحقق من أن درجة الحموضة هي < 3) قبل تنظيف C₁₈ وإضافة المزيد من حمض الفورميك إذا لزم الأمر.
   12. لكل عينة والتحكم إضافة 0.5 ميكرولتر من معيار الببتيد الثقيلة التي تم إنشاؤها في القسم 1.
4. تنظيف الببتيد
   1. تقدم العديد من الشركات المصنعة نصائح تنظيف C₁₈ أو لوحات. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمنتج المستخدم، والببتيدات المجففة في جهاز طرد مركزي فراغ، وعلى استعداد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.

3. تحليل LC-MS/MS

1. تنفيذ تحليل PRM الأولي على معيار الببتيد الثقيل بطريقة غير مقررة.
   1. Resuspend العينات المجففة في 10 ميكرولتر من MS تحميل العازلة 2٪ ACN/0.05٪ حمض ثلاثي فلوريستيك (TFA).
   2. تجهيز HPLC مع عكس المرحلة C₁₈ عمود تحليلي (75 ميكرومتر × 15 سم، 2 ميكرومتر 100 Å C₁₈ حبات) مصممة لnanoflow MS. شكل التدرجات الخطية تبادل المياه درجة MS تكملها مع 0.1٪ FA مع ACN تحتوي على 0.1٪ FA. تم استخدام عمود فخ التضحية (75 ميكرومتر × 2 سم ، 3 ميكرومتر ، 100 حبة₁₈ Å C) للحفاظ على حياة العمود التحليلي هنا ولكن ليس مطلوبا.
   3. يزوج إخراج العمود التحليلي بمصدر نانو-ESI على مطياف كتلة عالي الدقة.
   4. استخدام طريقة بروتيوميات مستهدفة مناسبة لمطياف الكتلة. على سبيل المثال، على Q-Exactive بالإضافة إلى أسلوب التجربة اثنين، دورة بين MS الكامل وتجربة PRM. بالنسبة لتجربة التصلب المتعدد الكامل، تم استخدام حل قدره 120,000 مع هدف AGC من 1e6 و 240 مللي ثانية كحد أقصى. وبالنسبة لتجربة إدارة الحد من الفقر، استخدم نفس الهدف من نظام تحديد القيمة المضافة والحد الأقصى من تكنولوجيا المعلومات بدقة أقل قدرها 000 60 ونافذة عزل تبلغ 1.2 م/ض.
   5. حقن 200 نانوغرام من عنصر التحكم السلبي على العمود التحليلي باستخدام الطوابع التلقائية HPLC. تطبيق تدرج خطي على العينة على العمود التحليلي زيادة تركيز ACN من 2-25٪ على مدى فترة ~ 45 دقيقة.
      ملاحظة: تركيز ACN 25٪ أقل من المعتاد لبروتيوميات بسبب الطبيعة الهيدروفيلية المنخفضة للببتيدات النموذجية ذات الخصائص الطوبولوجية في كل مكان. وإذا كان للببتيدات الأخرى أن تحدد كميا، فقد يكون من المرغوب فيه تركيز أعلى لل ACN لتحقيق فصل جيد للهدف.
   6. تحليل نتائج تشغيل الجدولة كما هو موضح في المقطع 4.2 لإنشاء قائمة تضمين مجدولة.
2. تحليل العينات
   1. تشغيل العينات المتبقية كما هو موضح للجدولة في 3.1 بصرف النظر عن استخدام قائمة التضمين المجدولة التي تم إنشاؤها في القسم 4.2.
      ملاحظة: يجب تشغيل فارغة بعد عنصر التحكم الإيجابي للتأكد من أنه يتم الكشف عن أي ترحيل من التشغيل السابق في عينات لاحقة.

4. تحليل البرمجيات

1. إنشاء قائمة تضمين التنسيق المناسب ل MS المستخدمة. استخدم هذا البروتوكول برنامج المصدر المفتوح Skyline (الإصدار 19.1.0.193) (https://skyline.ms)، والذي يقدم دعما ومساعدة موثقين جيدا. ويمكن إنشاء قائمة إدراج لعدة مطيافات كتلة باستخدام مرفق قائمة عزل الصادرات.
   1. افتح مستند Skyline جديد.
   2. حدد تعديلات النظائر الثقيلة حسب الاقتضاء للببتيدات الثقيلة المميزة للطبولوجيا. في الإعدادات| إعدادات الببتيد تحت علامة التبويب تعديل، انقر على حقل الاسم لرؤية التعديل المحتمل. ويستند الاختيار على الحالة النظيرية للببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها. في هذا المثال، استخدمت الببتيدات الاصطناعية التي تحمل إما ليسين الثقيلة⁽¹³C₆¹⁵N₂-lysine) أو أرجينين الثقيلة⁽¹³C₆¹⁵N₄-arginine) في C-terminus. التسميات المناسبة ستكون: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" و "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
   3. حدد الإعدادات| الانتقال. ضمن علامة التبويب تصفية تشمل رسوم السلائف 2، 3، 4.
   4. إدراج الببتيدات عن طريق تحديد تحرير| إدراج| الببتيدات.
   5. قم بتعبئة الحقول ذات الصلة بما في ذلك تسلسل الببتيد المميز للطبولوجيا واسم البروتين (على سبيل المثال، "Chain-K63").
   6. توسيع كل الببتيد هو مبين الآن في لوحة الأهداف. حذف حالات الرسوم غير المرغوب فيها. حالة الشحنة المفضلة وطاقة التصادم ، والتي قد تختلف استنادا إلى مطياف الكتلة المستخدم ، لكل ببتيد مميز طوبولوجيا موضح في الجدول 1.
   7. لكل ببتيد طوبولوجيا مميزة (باستثناء M1 حيث يتم تضمين GG في التسلسل) انقر بزر الماوس الأيمن على التسلسل وحدد تعديل. إضافة GG كتعديلات هيكلية بالنقر فوق حقل الاسم وتحديد <إظهار كافة... > قبل اختيار "غليغلي (K)".
   8. تصدير ملف قائمة العزل| تصدير| قائمة العزل، حدد نوع الأداة وتعيين نوع الأسلوب إلى قياسي. سيؤدي تحديد موافق إلى فتح مطالبة لحفظ ملف .csv * يمكن استخدامه لإنشاء أسلوب PRM.
2. إنشاء قائمة إدراج مجدولة استنادا إلى تشغيل جدولة الببتيد الثقيلة وأوضح هنا باستخدام برنامج أفق المصدر المفتوح.
   1. إنشاء قائمة أهداف كما هو موضح في المقطع 4.1.
   2. استيراد الجدولة تشغيل في 3.1 عن طريق تحديد ملف| استيراد| النتائج.
   3. راجع الهويات. يمكن ملاحظة الإشارة الثقيلة لكل ببتيد من خلال النقر على الكتلة لكل إدخال الببتيد الثقيل. غالبا ما يتم تحديد التعرف الصحيح على الذروة تلقائيا ، ولكن قد يتطلب البرنامج المعالجة اليدوية عن طريق تحديد الذروة باستخدام النقر والسحب تحت المحور س.
   4. يتم أيضا تطبيق أوقات الاستبقاء المحددة للمتغيرات الثقيلة على الإصدارات الخفيفة ، وبالتالي إنشاء جدول زمني ل PRM. يمكن تعديل إطار الجدولة ضمن الإعدادات| إعدادات الببتيد باستخدام علامة التبويب التنبؤ، عن طريق تغيير الإطار الزمني.
   5. يمكن الآن تصدير قائمة إدراج مجدولة باستخدام File| تصدير| قائمة العزل وتحديد نوع الأداة المناسبة ونوع أسلوب الإعداد إلى جدولة.
3. تحليل البيانات.
   1. استيراد العينات بنفس الطريقة لتحليل تشغيل الجدولة في القسم 4.2.
   2. بعد الاستيراد الكامل لجميع العينات ، يوصى بعلاج التحولات. هذه هي العملية التي تتم من خلالها إزالة التحولات مع التداخل أو نسب الإشارة إلى الضوضاء الضعيفة. يظهر مثال على اللوني قبل وبعد المعالجة في الشكل 4.
   3. يمكن الآن تصدير البيانات إما عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الرسوم البيانية ذات الصلة وتحديد نسخ البيانات أو عن طريق تحديد File| تصدير| النتائج.

النتائج

لإثبات استخدام تحليل سلسلة في كل مكان من قبل PRM ، تم اختيار ثلاثة خطوط الخلية: خط الخلية الميلانوما الماوس B16 ، وخطي الخلايا البشرية المشتركة A549 (الخلايا الظهارية السنية الغدية) وهيلا (خلايا سرطان عنق الرحم). نمت هذه الثقافات إلى مرحلة متوسطة في الوسائط المناسبة قبل أن يتم علاجها مع 0 أو 10 أو 1...

Discussion

تحليل حالة كل مكان داخل البروتيوم هو ذات أهمية متزايدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يجب أن يركز وصف حالة الانتشار في كل مكان للعينة ليس فقط على ملف البروتينات التي يتم نشرها في كل مكان ولكن أيضا على طوبولوجيا مثل هذا الانتشار. تقييم هذه الطوبولوجيا من قبل MS المستهدفة، كما هو موضح ه?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN)	Merck	100029
Ammonium bicarbonate (ABC)	Fluka	9830
Centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA)	Sigma	22790
Eppendorf LoBind	Eppendorf	22431081
Formic acid (FA)	Thermo Fisher Scientific	85178
Heavy Peptides	JPT Peptide Technologies
HPLC	Dionex	Ulitimate 3000
LC Column	Thermo Fisher Scientific	160321
Lys C	Wako	125-05061
Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM)	ACROS Organics	156100050
Positive Control Chain K48	Boston Biochem	UC-240
Positive Control Chain K63	Boston Biochem	UC-340-100
Positive Control Chain M1	Boston Biochem	UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S5881
Sonifier	Branson sonifier	SFX 150
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigam	T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific	77720
Trypsin	Promega	V1511A
Urea	Sigma	51456
Waters μElution C18 plates	Waters	186002318