Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

Resumen

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Resumen

La evaluación del perfil global de las topologías de la cadena de ubiquitina dentro de un proteoma es de interés para responder a una amplia gama de preguntas biológicas. El protocolo descrito aquí aprovecha la modificación di-glicina (-GG) que queda después de la digestión tríptica de ubiquitina incorporada en una cadena. Al cuantificar estos péptidos de topología-característica se puede determinar la abundancia relativa de cada topología de cadena de ubiquitina. Los pasos necesarios para cuantificar estos péptidos mediante un experimento paralelo de monitoreo de reacciones se informan teniendo en cuenta la estabilización de las cadenas de ubiquitina. La preparación de controles pesados, lisis celular y digestión se describen junto con el flujo de trabajo adecuado de configuración de espectrómetros de masas y análisis de datos. Se presenta un conjunto de datos de ejemplo con perturbaciones en la topología de ubiquitina, acompañado de ejemplos de cómo la optimización del protocolo puede afectar a los resultados. Siguiendo los pasos descritos, un usuario podrá realizar una evaluación global del panorama de la topología de ubiquitina dentro de su contexto biológico.

Introducción

La estrecha regulación de la función y estabilidad de las proteínas es de suma importancia, ya que son los principales impulsores del control fenotípico de la biología. La función de una proteína se construye a partir de dos componentes: su secuencia intrínsa de polipéptidos y cualquier modificación posttranslacional (PTM). Se han identificado varios PTMs químicos, incluyendo glicosilación, fosforilación, acetilación y metilación^1. En 1975, Goldstein et al.² identificaron una pequeña proteína y la llamaron ubiquitina debido a su naturaleza omnipresente. Se encontró que la ubiquitina era importante en la degradación de^{proteínas 3.} Sin embargo, desde entonces se ha establecido que la función de la ubiquitina como molécula de señalización se extiende mucho más allá de la regulación de la estabilidad de las proteínas. La señalización de ubiquitina participa en una amplia gama de otras funciones biológicas, como la estabilización de proteínas, la autofagia, el control del ciclo celular y el tráfico de proteínas^4.

Mientras que otros PTMs son generalmente binarios (es decir, la proteína se modifica o se deja sin modificar) para un sitio dado, la ubiquitina puede modificar una proteína tanto como monómero como como una cadena polimérica, con la ubiquitina adjunta en sí siendo ubiquitina. Además, esta cadena de poliubiquitinación puede desarrollarse en varias topologías con la ubiquitinación de la ubiquitina anterior que se une a uno de los ocho sitios de eslabones^5,6. La ubiquitina se transfiere mediante un proceso enzimático multipaso(Figura 1)donde la C-terminus de ubiquitina está vinculada a uno de sus siete residuos de lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o al N-terminal de la ubiquitina anterior (denominada ubiquitina M1 o lineal)^5,6. Esta topología de cadena es clave para el destino de la proteína bajo modificación. Por ejemplo, la modificación con una cadena vinculada K48 o K11 conduce a la degradación de la proteína modificada en el proteasoma, mientras que una cadena lineal es necesaria para la activación de la señalización NF-kB. Por lo tanto, la distribución relativa de estas topologías de cadena es relevante para una amplia variedad de cuestiones biológicas.

El uso de espectrometría de masas (EM) es de particular beneficio para el análisis de topología de cadena de ubiquitina, ya que no depende de interacciones basadas en anticuerpos o basadas en afinidad^7,8, muchas de las cuales tienen una especificidad limitada y no diferencian entre los distintos tipos de cadena. Una posibilidad de detección diferente es el uso de mutantes de ubiquitina genéticamente modificados. Aquí, una lisina específica se intercambia por arginina, que no puede soportar la modificación por ubiquitina. La falta de formación de cadena de ubiquitina en la proteína del sustrato se interpreta entonces como evidencia de una topología específica⁹.

La identificación basada en EM de proteínas ubiquitinadas se basa en el hecho de que la C-terminus de ubiquitina contiene un residuo de arginina en la posición 74 que es reconocido por la trippsina durante la preparación proteótica de las muestras para el análisis de EM, separando el doble glicina C-terminal. Este GlyGly (-GG) permanece unido al grupo ε-amino de los residuos de lisina de la proteína del sustrato. Para el análisis de topología de ubiquitina, la modificación se produce en uno de los siete residuos de lisina de ubiquitina. Esto crea un conjunto de siete péptidos clave que llevan un residuo de lisina modificado por GG, específico para cada una de las topologías (Figura 2). Por ejemplo, con la topología K06, la lisina en la posición 6 en la secuencia de aminoácidos estará protegida de la digestión tríptica con una modificación -GG de 114 Da añadida a esta lisina.

La identificación de péptidos predeterminados específicos por EM se conoce como proteómica dirigida, o más específicamente, adquisición de péptidos dirigidos¹⁰. Se han desarrollado dos métodos dependiendo del rendimiento del espectrómetro de masas que se está utilizando. Estos son monitoreo de reacción seleccionado (SRM), también llamado monitoreo de reacción múltiple (MRM), y monitoreo de reacción paralelo (PRM). SRM implica la selección de transiciones que consisten en el precursor m/z y el producto iónico m/z. Por el contrario, PRM requiere sólo el precursor m/z. Después de la selección, se realiza un análisis completo de la encuesta de los iones del producto. Esto tiene la ventaja de que no es necesaria ninguna selección de iones de producto adecuados para la cuantificación en el espectrómetro de masa específico antes de la medición¹¹. Tanto SRM como PRM pueden, dependiendo del instrumento, ser programados. La programación es la práctica de asignar una ventana de tiempo durante la cual se incluirá un ión determinado para su análisis, ya que los péptidos se eluden en los momentos de retención definidos del sistema cromatógráfico. Reducir el número de iones que se interroguen en un momento dado aumenta la frecuencia de interrogatorio de esos iones programados en ese momento, mejorando así la precisión de los datos.

En general, la aplicación de proteómica dirigida para la topología de ubiquitina es la misma que cualquier otro experimento proteómico dirigido. Sin embargo, dos diferencias clave son importantes: En primer lugar, debe considerarse la estabilidad de las cadenas de ubiquitina. Hay múltiples enzimas desubiquitinantes potentes (DUB) que degradan rápidamente las cadenas sobre la lisis celular. Los proteases específicos de la ubiquitina se dividen en dos categorías, las tioesteras y las metaloproteases. La mayoría de las ubiquitina-hidrolasas son tioesteras y transportan un residuo de cisteína en su centro activo. Al alquilar estos residuos de cisteína, se pueden desactivar. Como tal, el uso de búferes de estabilización de ubiquitina que contienen agentes alquilantes, como N-ethylmaleimide (NEM), y productos químicos altamente desnaturalizadores, y mantener las muestras frías es vital para un análisis exitoso. En segundo lugar, a diferencia de otros experimentos dirigidos, la elección del péptido es fija. En un experimento dirigido típico, se puede seleccionar un péptido proteotípico para un buen rendimiento cromatómico e ionización. Para algunos péptidos de características de topología como K48 estas propiedades son buenas, mientras que para otros, son menos deseables. Por ejemplo, la cromatografía K33 en una configuración típica en fase inversa es deficiente debido a la formación de un perfil de elución estirado, y las malas propiedades de ionización del péptido K27 reducen su visibilidad en MS^12.

En este protocolo, describimos cómo realizar la evaluación de topología de ubiquitina de una muestra biológica por PRM. Los datos de ejemplo para el procedimiento se presentan utilizando una perturbación del proteasoma utilizando el tratamiento inhibidor de MG-132 en varios tipos de células diferentes.

Protocolo

1. Preparación de un estándar de péptido pesado

1. Dependiendo del proveedor y la calidad de los péptidos pesados comprados, los péptidos pesados tendrán que diluirse. Este protocolo utilizó las secuencias de péptidos notificadas en la Tabla 1,con el aminoácido C-terminal modificado a lisina⁽¹³C₆¹⁵N₂-lisina) o arginina (¹³C₆¹⁵N₄-arginina).
   1. Mezcle los péptidos pesados, diluyendo la mezcla con acetonitrilo (ACN) al 50% para crear una mezcla de péptidos con cada péptido a 10 μM.
   2. Crea alícuotas de la mezcla de péptidos y guárdalos a -80 °C.

2. Preparación de muestras

1. Lisis de muestra
   NOTA: La estabilidad de las cadenas de ubiquitina debe considerarse durante la preparación de la muestra. Mantenga las muestras biológicas y los tampones refrigerados a 4 °C y agregue muestras al búfer de estabilización de ubiquitina lo más rápido posible.
   1. Preparar una solución de 1 M NH₄HCO₃ (bicarbonato de amonio) en agua y ajustar el pH a 8 usando 1 M NaOH.
   2. Preparar una solución de 200 mM N-etillmaleimida (NEM) en agua.
   3. Preparar el búfer de estabilización de ubiquitina utilizando 8 M urea en 50 mM NH₄HCO₃/10 mM NEM. El búfer de estabilización de Ubiquitina debe prepararse constantemente cada vez.
      NOTA: Una solución de 5 ml de urea de 8 M requerirá considerablemente menos de 5 ml de agua dada la expansión del agua cuando se encuentra en una solución saturada con urea.
      PRECAUCIÓN: No prepare el búfer por encima de 50 °C debido a la tendencia de la urea a formar poliurea a altas temperaturas.
   4. Resuspend la muestra biológica que se investigará en el búfer de estabilización de ubiquitina con el objetivo de 0,5 μg/μL de proteína y lisa las células con un método adecuado para la muestra. Se utilizó un método de sonicación que consta de tres pulsos de 10 s con un sonificador SFX 150 Branson establecido en un 70% de intensidad con roturas de 10 s en hielo entre cada pulso, para las líneas celulares de este protocolo.
   5. Muestra de centrífuga a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa.
   6. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de unión a proteínas bajas y frescas. Las muestras se pueden almacenar a -20 °C en este punto si es necesario.
2. Preparación de muestras y controles
   1. Si las muestras están congeladas, mezcle (por ejemplo, con un termomixer) mientras se descongelan para disolver rápidamente la urea.
      PRECAUCIÓN: No utilice temperaturas superiores a 50 °C debido a la tendencia de la urea a formar poliurea a altas temperaturas.
   2. Muestra de centrífuga a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa.
   3. Transfiera 20 μg de muestra a un tubo de microcentrífuga de baja unión fresco y ajuste el volumen a 50 μL con un búfer de estabilización de ubiquitina.
   4. Cree un control negativo utilizando un volumen normalizado de búfer de estabilización de ubiquitina (50 μL). En esta muestra, no debe estar presente ninguna versión ligera de cada péptido, lo que permite observar cualquier contaminación lumínica derivada de los péptidos pesados. Este control negativo también se utilizó para la programación del tiempo de retención del PRM descrito en la sección 3.1.
   5. También se creó un control positivo con búfer de estabilización de ubiquitina y la adición de tipos de cadena disponibles comercialmente al volumen normalizado de búfer de estabilización de ubiquitina (50 μL). Comúnmente, K63, K48 y M1 están disponibles. En los resultados representativos se utilizaron 20 ng de K48, K63 y M1.
3. Reducción, alquilación y digestión
   1. Preparar una solución de bicarbonato de amonio de 50 mM (NH₄HCO₃₎en agua y ajustar la muestra a pH = 8 con 1 M NaOH.
   2. Un cultivo de E. coli cultivado en caldo LB fue centrifugado 5.000 x g durante 5 minutos para formar un pellet, que luego fue lavado 2 veces con PBS antes de la resuspensión en el búfer de estabilización de ubiquitina a 5 μg/μL.
   3. Agregue 1 μg de E. coli lysate a cada muestra y control. Este protocolo utiliza E. coli (DH10B), pero se puede utilizar cualquier lisato complejo sin ubiquitina. Tenga en cuenta que la ubiquitina es común a todos los eucariotas.
      NOTA: El uso de una matriz de lisato de E. coli reduce la pérdida de péptidos debido a la adhesión inespecífica a los utensilios de plástico. Esto es particularmente notable en el control negativo o muestras con un contenido limitado de proteínas y tiene un fuerte impacto en la observación de K63^12.
   4. Preparar una solución de 500 mM tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en agua de grado MS (TTT se puede utilizar como alternativa).
   5. Reduzca las muestras y controles mediante la adición de TCEP a una concentración final de 50 mM. Vórtice brevemente antes de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Si se utiliza TDT, la temperatura debe elevarse a 50 °C.
      PRECAUCIÓN: No utilice temperaturas superiores a 50 °C debido a la tendencia de la urea a formar poliurea a altas temperaturas.
   6. Preparar una solución de cloroacetamida de 550 mM (CAA) en NH₄HCO₃. Almacenar en la oscuridad.
   7. Alquile las muestras y controles añadiendo CAA a una concentración final de 55 mM. Vórtice brevemente antes de incubar durante 20 minutos en RT en la oscuridad.
      NOTA: Caa se utiliza en lugar de iodoacetamida como agente de reducción para disminuir la probabilidad de una doble modificación carbamidometil (114.0429) en un residuo de lisina que se confunde con una modificación -GG (114.0429)¹³.
   8. Agregue la LysC de endopeptidasa a las muestras a una relación de 1:25 (w/w) con el contenido de proteínas. Incubar durante 3 h a 37 °C.
   9. Diluir las muestras y controles con 200 μL de 50 mM NH₄HCO₃ pH = 8 (1:5 v/v).
   10. Agregue trippsina a las muestras a 1:25 w/w de relación con el contenido de proteínas. Incubar durante 12 h a 37 °C.
   11. Agregue un 10% de solución de ácido fórmico (FA) en agua de grado MS a una relación v/v de 1:10 a cada muestra y muestra de control. Compruebe que el pH es <3) antes de la limpieza C₁₈ y agregue más ácido fórmico si es necesario.
   12. A cada muestra y control añadir 0,5 μL del estándar de péptido pesado creado en la sección 1.
4. Limpieza de péptidos
   1. Varios fabricantes ofrecen puntas o placas de limpieza C_18. Siga las instrucciones del fabricante para el producto utilizado y péptidos elutados secos en una centrífuga de vacío, listos para el análisis de EM.

3. Análisis por LC-MS/MS

1. Ejecute el análisis inicial de PRM en el estándar de péptido pesado de una manera no programada.
   1. Resuspend las muestras secas en 10 μL de amortiguador de carga de EM 2% ACN/0.05% ácido trifluoroacético (TFA).
   2. Equipe un HPLC con una columna analítica C₁₈ de fase inversa (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 cuentas Å C₁₈₎ diseñada para nanoflujo MS. Formar gradientes lineales intercambiando agua de grado MS complementada con 0.1% FA con ACN que contenga 0.1% FA. Aquí se utilizó una columna trampa de sacrificio (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 cuentas Å C₁₈₎ para preservar la vida útil de la columna analítica, pero no es necesario.
   3. Acopla la salida de la columna analítica a una fuente nanoESI en un espectrómetro de masa de alta resolución.
   4. Utilice un método proteómico dirigido adecuado para el espectrómetro de masas. Por ejemplo, en un Q-Exactive más un método de dos experimentos, entre una EM completa y un experimento PRM. Para el experimento Full MS, se utilizó una resolución de 120.000 con un objetivo de AGC de 1e6 y 240 ms como TI máxima. Para el experimento PRM, se utilizó el mismo objetivo AGC y ti máximo con una resolución más baja de 60.000 y una ventana de aislamiento de 1,2 m/z.
   5. Inyecte 200 ng del control negativo en la columna analítica utilizando el autoamplificador HPLC. Aplique un degradado lineal a la muestra en la columna analítica aumentando la concentración acn del 2 al 25% durante un período de ~45 min.
      NOTA: La concentración de 25% de ACN es menor de lo habitual para la proteómica debido a la baja naturaleza hidrófila de los péptidos típicos de la topología-característica de la ubiquitina. Si se van a cuantificar otros péptidos, se puede desear una mayor concentración de ACN para lograr una buena separación del objetivo.
   6. Analice los resultados de la ejecución de programación como se describe en la sección 4.2 para crear una lista de inclusión programada.
2. Análisis de las muestras
   1. Ejecute los ejemplos restantes como se describe para la programación en 3.1 aparte del uso de la lista de inclusión programada creada en la sección 4.2.
      NOTA: Un espacio en blanco debe ejecutarse después del control positivo para asegurarse de que no se detecta ningún arrastre de la ejecución anterior en muestras posteriores.

4. Análisis de software

1. Cree una lista de inclusión del formato adecuado para la EM utilizada. Este protocolo utilizaba el software de código abierto Skyline (versión 19.1.0.193) (https://skyline.ms), que ofrece soporte y ayuda bien documentados. Se puede crear una lista de inclusión para varios espectrómetros de masas mediante la instalación de lista de aislamiento de exportación.
   1. Abra un nuevo documento skyline.
   2. Seleccione modificaciones de isótopos pesados según corresponda a péptidos de alta tecnología-característica. En Configuración| Configuración del péptido en la pestaña Modificación, haga clic en el campo nombre para ver la posible modificación. La selección se basa en el estado isotópico de los péptidos pesados comprados. En este ejemplo, se utilizaron péptidos sintéticos que llevaban lisina pesada⁽¹³C₆¹⁵N₂-lisina) o una arginina pesada⁽¹³C₆¹⁵N₄-arginina) en la terminal C. Las etiquetas apropiadas serían: "Etiqueta:13C(6)15N(2) (C-term K)" y "Etiqueta:13C(6)15N(4) (C-term R)".
   3. Seleccione Configuración| Transición. En la ficha Filtro se incluyen Cargos precursores 2, 3, 4.
   4. Inserte péptidos seleccionando Editar| Insertar| Péptidos.
   5. Rellene los campos relevantes, incluida la secuencia de péptidos de carácter topológico y un nombre proteico (por ejemplo, "Cadena-K63").
   6. Expanda cada péptido que se muestra ahora en el panel Objetivos. Elimine los estados de cargo no deseados. El estado de carga preferido y la energía de colisión, que pueden diferir en función del espectrómetro de masa utilizado, para cada péptido de topología-característica se muestra en la Tabla 1.
   7. Para cada péptido topología-característica (excepto M1 donde se incluye el GG en la secuencia) haga clic con el botón derecho en la secuencia y seleccione Modificar. Agregue un GG como una modificación estructural haciendo clic en el campo de nombre y seleccionando <Mostrar todo... > antes de seleccionar "GlyGly (K)".
   8. Exporte la lista de aislamiento Archivo| Exportación| Lista de aislamiento, seleccione el tipo de instrumento y establezca el tipo de método en Estándar. Al seleccionar Aceptar, se abrirá un mensaje para guardar un archivo *.csv que se puede usar para crear un método PRM.
2. Cree una lista de inclusión programada basada en una ejecución de programación de péptidos pesados que se explica aquí utilizando el software Skyline de código abierto.
   1. Cree una lista de destino como se describe en la sección 4.1.
   2. Importe la ejecución de programación en 3.1 seleccionando Archivo| ¿Importación| Resultados.
   3. Revise las identificaciones. La señal pesada para cada péptido es observable haciendo clic en la masa para cada entrada de péptido pesado. El reconocimiento correcto del pico a menudo se determina automáticamente, pero el software puede requerir curación manual seleccionando el pico mediante el clic y arrastre bajo el eje X.
   4. Los tiempos de retención seleccionados para las variantes pesadas también se aplican a las versiones de luz, creando así una programación para el PRM. La ventana de programación se puede modificar en Configuración| Configuración del péptido mediante la pestaña Predicción, cambiando la ventana de tiempo.
   5. Ahora se puede exportar una lista de inclusión programada mediante Archivo| Exportación| Lista de aislamiento y selección del tipo de instrumento adecuado y el tipo de método de configuración en Scheduled.
3. Analice los datos.
   1. Importe los ejemplos de la misma manera que para el análisis de ejecución de programación en la sección 4.2.
   2. Después de la importación completa de todas las muestras, se recomienda la curación de transiciones. Este es el proceso mediante el cual se eliminan las transiciones con interferencias o relaciones señal-ruido deficientes. En la figura 4se muestra un ejemplo de cromatograma antes y después de la curación.
   3. Los datos ahora se pueden exportar haciendo clic con el botón derecho en los gráficos relevantes y seleccionando Copiar datos o seleccionando Archivo| Exportación| Resultados.

Resultados

Para demostrar el uso de un análisis de cadena de ubiquitina por PRM, se seleccionaron tres líneas celulares: una línea de células de melanoma de ratón B16, y las dos líneas celulares humanas comunes A549 (células epiteliales basales adenocarcinomicas alveolar) y HeLa (células cancerosas cervicales). Estos cultivos crecieron a fase midexponential en medios apropiados antes de ser tratados con 0, 10 o 100 mM MG-132 durante 4 h antes de la cosecha. MG-132 es un inhibidor del proteasoma que previene la degradación ...

Discusión

El análisis del estado de ubiquitina dentro de un proteoma es de creciente importancia para una amplia variedad de cuestiones biológicas. La descripción del estado de ubiquitinación de una muestra debe centrarse no sólo en el perfil de las proteínas que se ubicuan, sino también en la topología de dicha ubiquitinación. La evaluación de esta topología por EM dirigida, como se describe aquí, tiene un papel en una amplia gama de investigaciones biológicas.

Debe entenderse que el proto...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN)	Merck	100029
Ammonium bicarbonate (ABC)	Fluka	9830
Centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA)	Sigma	22790
Eppendorf LoBind	Eppendorf	22431081
Formic acid (FA)	Thermo Fisher Scientific	85178
Heavy Peptides	JPT Peptide Technologies
HPLC	Dionex	Ulitimate 3000
LC Column	Thermo Fisher Scientific	160321
Lys C	Wako	125-05061
Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM)	ACROS Organics	156100050
Positive Control Chain K48	Boston Biochem	UC-240
Positive Control Chain K63	Boston Biochem	UC-340-100
Positive Control Chain M1	Boston Biochem	UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S5881
Sonifier	Branson sonifier	SFX 150
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigam	T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific	77720
Trypsin	Promega	V1511A
Urea	Sigma	51456
Waters μElution C18 plates	Waters	186002318