Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Résumé

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Résumé

L’évaluation du profil global des topologies de chaîne d’ubiquitine dans un protéome est d’intérêt pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Le protocole décrit ici tire parti de la modification de la di-glycine (-GG) laissée après la digestion tryptique de l’ubiquitine incorporée dans une chaîne. En quantifiant ces peptides caractéristiques de la topologie, l’abondance relative de chaque topologie de la chaîne d’ubiquitine peut être déterminée. Les étapes nécessaires pour quantifier ces peptides par une expérience parallèle de surveillance des réactions sont signalées en tenant compte de la stabilisation des chaînes d’ubiquitine. La préparation des contrôles lourds, la lyse cellulaire, et la digestion sont décrites avec la configuration appropriée de spectromètre de masse et le flux de travail d’analyse de données. Un exemple de données avec des perturbations dans la topologie de l’ubiquitine est présenté, accompagné d’exemples de la façon dont l’optimisation du protocole peut affecter les résultats. En suivant les étapes décrites, un utilisateur sera en mesure d’effectuer une évaluation globale du paysage de topologie ubiquitine dans leur contexte biologique.

Introduction

La régulation étroite de la fonction et de la stabilité des protéines est d’une importance primordiale, car ils sont les principaux moteurs du contrôle phénotypique de la biologie. La fonction d’une protéine est construite à partir de deux composants : sa séquence intrinsèque de polypeptide et toutes les modifications posttranslationnelles (MPT). Divers M PTM chimiques ont été identifiés, y compris la glycosylation, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation¹. En 1975, Goldstein et coll.² ont identifié une petite protéine et l’ont nommée ubiquitine en raison de sa nature omniprésente. L’ubiquitine s’est trouvée importante dans la dégradation de^{protéine 3.} Cependant, depuis lors, il a été établi que la fonction de l’ubiquitine en tant que molécule de signalisation s’étend bien au-delà de la régulation de la stabilité des protéines. La signalisation d’ubiquitine est impliquée dans un large éventail d’autres fonctions biologiques, telles que la stabilisation de protéine, l’autophagie, le contrôle de cycle cellulaire, et le trafic de^{protéine 4.}

Alors que d’autres MNP sont généralement binaires (c.-à-d. que la protéine est modifiée ou non modifiée) pour un site donné, l’ubiquitine peut modifier une protéine à la fois comme monomère ou comme chaîne polymérique, l’ubiquitine ci-jointe étant elle-même ubiquitinée. En outre, cette chaîne de polyubiquitination peut se développer dans plusieurs topologies avec l’ubiquitination de l’ubiquitine précédente s’attachant à l’un des huit sites de^{liaison 5,6}. L’ubiquitine est transférée par un processus enzymatique en plusieurs étapes (figure 1) où le C-terminus d’ubiquitine est relié à l’un de ses sept résidus de lysine (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou au terminal N de l’ubiquitine précédente (appelée ubiquitination M1 ou linéaire)^5,6. Cette topologie de chaîne est la clé du sort de la protéine en cours de modification. Par exemple, la modification avec une chaîne liée au K48 ou au K11 entraîne la dégradation de la protéine modifiée au protéasome, tandis qu’une chaîne linéaire est nécessaire pour l’activation de la signalisation NF-kB. Ainsi, la répartition relative de ces topologies de chaîne est pertinente à une grande variété de questions biologiques.

L’utilisation de la spectrométrie de masse (SP) est particulièrement bénéfique pour l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine car elle ne dépend pas d’interactions basées sur les anticorps ou les affinités^7,8, dont beaucoup ont une spécificité limitée et ne font pas de distinction entre les différents types de chaînes. Une autre possibilité de détection est d’utiliser des mutants ubiquitine génétiquement modifiés. Ici, une lysine spécifique est échangée contre de l’arginine, qui ne peut pas soutenir la modification par l’ubiquitine. L’absence de formation de chaîne d’ubiquitine sur la protéine de substrat est alors interprétée comme évidence pour une topologie spécifique^9.

L’identification basée sur la SP des protéines ubiquitinées est basée sur le fait que le C-terminus d’ubiquitine contient un résidu d’arginine dans la position 74 qui est reconnu par la trypsine pendant la préparation protéolytique des échantillons pour l’analyse de la SP, séparant la double glycine du terminal C. Ce GlyGly (-GG) reste attaché au groupe ε-aminé du résidu de lysine de la protéine de substrat. Pour l’analyse de topologie d’ubiquitine, la modification se produit sur l’un des sept résidus de lysine de l’ubiquitine. Cela crée un ensemble de sept peptides clés qui transportent un résidu de lysine qui est modifié par GG, spécifique pour chacune des topologies (Figure 2). Par exemple, avec la topologie K06, la lysine à la position 6 sur la séquence des acides aminés sera protégée de la digestion tryptique avec une modification de -GG de 114 Da ajoutée à cette lysine.

L’identification de peptides prédéterminés spécifiques par la SP est appelée protéomique ciblée, ou plus précisément acquisition ciblée de peptides¹⁰. Deux méthodes ont été développées en fonction des performances du spectromètre de masse utilisé. Il s’agit d’une surveillance des réactions sélectionnée (GRS), également appelée surveillance des réactions multiples (MRM) et de la surveillance parallèle des réactions (PRM). SRM implique la sélection des transitions composées du précurseur m/z et de l’ion produit m/z. Inversement, PRM ne nécessite que le précurseur m/z. Après sélection, une analyse complète des ions du produit est effectuée. Cela a l’avantage qu’aucune sélection d’ions de produit appropriés pour la quantitation sur le spectromètre de masse spécifique n’est nécessaire avant la^{mesure 11}. SRM et PRM peuvent, selon l’instrument, être programmés. La planification est la pratique consistant à attribuer une fenêtre de temps au cours de laquelle un ion particulier sera inclus pour analyse, car les peptides s’échappent à des moments de rétention définis à partir du système chromatographique. La réduction du nombre d’ions interrogés à un moment donné augmente la fréquence des interrogatoires des ions prévus à ce moment-là, améliorant ainsi l’exactitude des données.

En général, l’application de la protéomique ciblée pour la topologie de l’ubiquitine est la même que toute autre expérience protéomique ciblée. Cependant, deux différences clés sont importantes : premièrement, la stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en considération. Il existe de multiples enzymes déubiquitines puissantes (DUB) qui dégradent rapidement les chaînes lors de la lyse cellulaire. Les protéases spécifiques à l’ubiquitine se équipent en deux catégories, les thioesterases et les métalloproteases. La plupart des ubiquitine-hydrolases sont des thioesterases et portent un résidu de cystéine dans leur centre actif. En alkylating ce résidu de cystéine, ils peuvent être inactivés. En tant que tel, l’utilisation de tampons de stabilisation de l’ubiquitine contenant des agents alcalinateurs, comme l’éthylmaleimide N (NEM), et des produits chimiques très dénaturants, et de garder les échantillons réfrigérés est essentielle à une analyse réussie. Deuxièmement, contrairement à d’autres expériences ciblées, le choix du peptide est fixé. Dans une expérience ciblée typique, un peptide protéotypique peut être sélectionné pour une bonne performance chromatographique et ionisation. Pour certains peptides caractéristiques de la topologie tels que K48, ces propriétés sont bonnes, tandis que pour d’autres, elles sont moins souhaitables. Par exemple, la chromatographie K33 dans une configuration typique en phase inverse est pauvre en raison de la formation d’un profil d’élitution étiré, et les faibles propriétés d’ionisation du peptide K27 réduisent sa visibilité par MS¹².

Dans ce protocole, nous décrivons comment effectuer l’évaluation de topologie d’ubiquitine d’un échantillon biologique par PRM. Des données d’exemple pour la procédure sont présentées utilisant une perturbation du protéasome utilisant le traitement inhibiteur de MG-132 dans plusieurs types différents de cellules.

Protocole

1. Préparation d’une norme de peptide lourd

1. Selon le fournisseur et la qualité des peptides lourds achetés, les peptides lourds devront être dilués. Ce protocole utilisait les séquences peptidiques rapportées dans le tableau 1,l’acide aminé c-terminal ayant été modifié en Lysine⁽¹³C₆¹⁵N₂-lysine) ou arginine⁽¹³C₆¹⁵N₄-arginine).
   1. Mélanger les peptides lourds, diluer le mélange avec 50% d’acétylonitrile (ACN) pour créer un mélange de peptide avec chaque peptide à 10 μM.
   2. Créer des aliquots du mélange peptidique et les conserver à -80 °C.

2. Préparation de l’échantillon

1. Exemple de lyse
   REMARQUE : La stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en compte lors de la préparation de l’échantillon. Gardez les échantillons biologiques et les tampons refroidis à 4 °C et ajoutez des échantillons au tampon de stabilisation de l’ubiquitine aussi rapidement que possible.
   1. Préparer une solution de 1 M NH₄HCO₃ (bicarbonate d’ammonium) dans l’eau et ajuster le pH à 8 à l’aide de 1 M NaOH.
   2. Préparer une solution de 200 mM N-éthylmaleimide (NEM) dans l’eau.
   3. Préparer le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à l’aide de 8 M d’urée dans 50 mM NH₄HCO_3/10mM NEM. Le tampon de stabilisation ubiquitine doit être préparé fraîchement à chaque fois.
      REMARQUE : Une solution de 5 mL de 8 M d’urée nécessitera beaucoup moins de 5 mL d’eau étant donné l’expansion de l’eau lorsqu’elle est dans une solution saturée d’urée.
      ATTENTION: Ne préparez pas le tampon au-dessus de 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.
   4. Resuspendez l’échantillon biologique à étudier dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine visant 0,5 μg/μL de protéines et lyse les cellules avec une méthode appropriée pour l’échantillon. Une méthode de sonication composée de trois impulsions de 10 s avec un sonificateur SFX 150 Branson réglé à 70% d’intensité avec 10 ruptures de glace entre chaque impulsion, a été utilisée pour les lignées cellulaires dans ce protocole.
   5. Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.
   6. Transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse à faible teneur en protéines. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade si nécessaire.
2. Préparation de l’échantillon et des contrôles
   1. Si les échantillons sont congelés, mélanger (p. ex., à l’aide d’un thermomixeur) pendant qu’ils sont décongelés pour dissoudre rapidement l’urée.
      ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.
   2. Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.
   3. Transférer 20 μg d’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse fraîchement à faible liaison et ajuster le volume à 50 μL avec tampon de stabilisation de l’ubiquitine.
   4. Créez un contrôle négatif à l’aide d’un volume normalisé de tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Dans cet échantillon, aucune version légère de chaque peptide ne devrait être présente, permettant l’observation de toute contamination légère résultant des peptides lourds spike-in. Ce contrôle négatif a également été utilisé pour la planification du temps de rétention du PRM décrite à l’article 3.1.
   5. Un contrôle positif a également été créé avec le tampon de stabilisation de l’ubiquitine et l’ajout de types de chaîne disponibles dans le commerce au volume normalisé du tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Généralement, K63, K48, et M1 sont disponibles. Dans les résultats représentatifs 20 ng de K48, K63, et M1 ont été utilisés.
3. Réduction, alkylation et digestion
   1. Préparer une solution de bicarbonate d’ammonium de 50 mM (NH₄HCO₃₎dans l’eau et ajuster l’échantillon au pH = 8 avec 1 M NaOH.
   2. Une culture d’E. coli cultivée dans le bouillon LB a été centrifugée 5 000 x g pendant 5 min pour former une pastille, qui a ensuite été lavée 2x avec PBS avant la résuspension dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à 5 μg/μL.
   3. Ajouter 1 μg de lysate E. coli à chaque échantillon et contrôler. Ce protocole utilise E. coli (DH10B), mais tout lysate complexe sans ubiquitine peut être utilisé. Notez que l’ubiquitine est commune à tous les eucaryotes.
      REMARQUE : L’utilisation d’une matrice de lysate E. coli réduit la perte de peptides due à l’adhérence non spécifique aux plastiques. Ceci est particulièrement visible dans le contrôle négatif ou des échantillons avec une teneur limitée en protéines et a un fort impact sur l’observation de K63¹².
   4. Préparer une solution de tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) de 500 mM dans l’eau de qualité SP (la TNT peut être utilisée comme alternative).
   5. Réduire les échantillons et les contrôles par l’ajout du PTCE à une concentration finale de 50 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 30 min à température ambiante (RT). Si la TNT est utilisée, la température doit être élevée à 50 °C.
      ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.
   6. Préparer une solution de chlorocétamide de 550 mM (CAA) en NH₄HCO₃. Stockez dans le noir.
   7. Alkylate les échantillons et les contrôles en ajoutant CAA à une concentration finale de 55 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 20 min à RT dans l’obscurité.
      REMARQUE : Caa est employé au lieu de l’iodoacetamide comme agent de réduction pour diminuer le risque d’une modification double de carbamidomethyl (114.0429) sur un résidu de lysine étant confondu avec une modification de -GG (114.0429)^13.
   8. Ajouter l’endopeptidase LysC aux échantillons à un rapport de 1:25 (w/w) à la teneur en protéines. Incuber pendant 3 h à 37 °C.
   9. Diluer les échantillons et les contrôles avec 200 μL de 50 mM NH₄HCO₃ pH = 8 (1:5 v/v).
   10. Ajouter la trypsine aux échantillons à un rapport de 1:25 w/w à la teneur en protéines. Incuber pendant 12 h à 37 °C.
   11. Ajouter une solution d’acide formique (FA) de 10 % dans l’eau de qualité SP à un rapport v/v de 1:10 à chaque échantillon et contrôler l’échantillon. Vérifiez que le pH est <3) avant le nettoyage C₁₈ et ajouter plus d’acide formique si nécessaire.
   12. À chaque échantillon et contrôle ajouter 0,5 μL de la norme peptidique lourde créée dans la section 1.
4. Nettoyage peptidique
   1. Plusieurs fabricants offrent des conseils ou des assiettes de nettoyage C_18. Suivez les instructions du fabricant pour le produit utilisé, et séchez les peptides élités dans une centrifugeuse sous vide, prête pour l’analyse de la SP.

3. Analyse par LC-MS/MS

1. Exécutez l’analyse prm initiale sur la norme peptidique lourde d’une manière imprévue.
   1. Resuspendez les échantillons séchés dans 10 μL de tampon de chargement de SP 2 % d’acide trifluoroacétique ACN/0,05 % d’acide trifluoroacétique (AFE).
   2. Équipez un HPLC d’une colonne analytique de phase inverse C₁₈ (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 perles Å C₁₈₎ conçue pour les gradients linéaires de nanoflow MS. Formez des gradients linéaires échangeant de l’eau de qualité MS complétée par 0,1 % de FA avec acn contenant 0,1 % de FA. Une colonne de piège sacrificielle (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 perles Å C₁₈₎ pour préserver la durée de vie de la colonne analytique a été utilisée ici, mais n’est pas nécessaire.
   3. Couplez la sortie de la colonne analytique à une source nano-ESI sur un spectromètre de masse haute résolution.
   4. Utilisez une méthode protéomique ciblée appropriée pour le spectromètre de masse. Par exemple, sur un Q-Exactive plus une méthode de deux expériences, cycle entre une SEp complète et une expérience PRM. Pour l’expérience full MS, une résolution de 120 000 avec un objectif AGC de 1e6 et 240 ms comme IT maximum a été utilisée. Pour l’expérience PRM, la même cible AGC et le maximum de TI ont été utilisés avec une résolution inférieure de 60 000 et une fenêtre d’isolement de 1,2 m/z.
   5. Injectez 200 ng de contrôle négatif sur la colonne analytique à l’aide de l’autosampler HPLC. Appliquer un gradient linéaire à l’échantillon sur la colonne analytique, augmentant la concentration d’ACN de 2 à 25 % sur une période d’environ 45 min.
      REMARQUE : La concentration d’ACN de 25 % est plus faible que d’habitude pour la protéomique en raison de la faible nature hydrophilique des peptides typiques caractéristiques de la topologie de l’ubiquitine. Si d’autres peptides doivent être quantifiés, une concentration plus élevée d’ACN peut être souhaitée pour atteindre une bonne séparation de cible.
   6. Analyser les résultats de l’exécutement de planification tel que décrit à la section 4.2 pour créer une liste d’inclusion planifiée.
2. Analyse des échantillons
   1. Exécutez les échantillons restants tels que décrits pour la planification en 3.1 en dehors de l’utilisation de la liste d’inclusion planifiée créée à la section 4.2.
      REMARQUE : Un blanc doit être exécuté après le contrôle positif pour s’assurer qu’aucun report de l’exécuter précédent n’est détecté dans les échantillons ultérieurs.

4. Analyse logicielle

1. Créez une liste d’inclusion de mise en forme appropriée pour la SP utilisée. Ce protocole a utilisé le logiciel open source Skyline (version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), qui offre un soutien et une aide bien documentés. Une liste d’inclusion peut être créée pour plusieurs spectromètres de masse à l’aide de l’installation de liste d’isolement des exportations.
   1. Ouvrez un nouveau document Skyline.
   2. Choisissez des modifications isotopiques lourdes, le cas échéant, aux peptides lourds caractéristiques de la topologie. Dans paramètres| Paramètres peptidique sous l’onglet Modification, cliquez sur le champ nom pour voir la modification potentielle. La sélection est basée sur l’état isotopique des peptides lourds achetés. Dans cet exemple, des peptides synthétiques transportant soit une lysine lourde⁽¹³C₆¹⁵N₂-lysine) soit une arginine lourde⁽¹³C₆¹⁵N₄-arginine) au C-terminus ont été utilisés. Les étiquettes appropriées seraient : « Étiquette : 13C(6)15N(2) (C-term K) » et « Label:13C(6)15N(4) (C-term R) ».
   3. Sélectionnez Paramètres| Transition. Sous l’onglet Filtre comprennent Les charges précurseurs 2, 3, 4.
   4. Insérez des peptides en sélectionnant Edit| Insérez| Peptides.
   5. Remplissez les champs pertinents, y compris la séquence peptidique caractéristique de la topologie et un nom protéique (p. ex., « Chaîne-K63 »).
   6. Élargissez chaque peptide maintenant indiqué dans le panneau Cibles. Supprimez les états de charge non désirés. L’état de charge préféré et l’énergie de collision, qui peuvent différer en fonction du spectromètre de masse utilisé, pour chaque peptide caractéristique de la topologie sont indiqués dans le tableau 1.
   7. Pour chaque peptide caractéristique de la topologie (à l’exception de M1 où le GG est inclus dans la séquence) cliquez à droite sur la séquence et sélectionnez Modifier. Ajouter un GG comme une modification structurelle en cliquant sur le champ de nom et la sélection <Afficher tousles ... > avant de sélectionner "GlyGly (K)« .
   8. Exporter la liste d’isolement Fichier| L’exportation| Liste d’isolement, sélectionnez le type d’instrument, et définissez le type de méthode à la norme. Sélection OK ouvrira une invite pour enregistrer un fichier *.csv qui peut être utilisé pour créer une méthode PRM.
2. Créez une liste d’inclusion planifiée basée sur un lourd processus de planification peptidique expliqué ici à l’aide du logiciel Open source Skyline.
   1. Créez une liste de cibles telle que décrite à la section 4.1.
   2. Importez l’exécutement de planification en 3.1 en sélectionnant le fichier| L’importation| Résultats.
   3. Examinez les pièces d’identité. Le signal lourd pour chaque peptide est observable en cliquant sur la masse pour chaque entrée de peptide lourd. La reconnaissance correcte du pic est souvent déterminée automatiquement, mais le logiciel peut nécessiter une curation manuelle en sélectionnant le pic en utilisant le clic et la traînée sous l’axe x.
   4. Les temps de rétention sélectionnés pour les variantes lourdes sont également appliqués aux versions légères, créant ainsi un calendrier pour le PRM. La fenêtre de planification peut être modifiée sous Paramètres| Paramètres Peptide à l’aide de l’onglet Prédiction, en changeant la fenêtre de temps.
   5. Une liste d’inclusion planifiée peut maintenant être exportée à l’aide de File| L’exportation| Liste d’isolement et sélection du type d’instrument approprié et le type de méthode de réglage à scheduled.
3. Analyser les données.
   1. Importez les échantillons de la même manière que pour l’analyse de l’exécutement de planification à la section 4.2.
   2. Après l’importation complète de tous les échantillons, la curation des transitions est recommandée. Il s’agit du processus par lequel les transitions avec des interférences ou de faibles rapports signal-bruit sont supprimées. Un exemple de chromatogramme avant et après la curation est indiqué dans la figure 4.
   3. Les données peuvent maintenant être exportées soit en cliquant à droite sur les graphiques pertinents et en sélectionnant les données copy, soit en sélectionnant le fichier| L’exportation| Résultats.

Résultats

Pour démontrer l’utilisation d’une analyse de chaîne d’ubiquitine par PRM, trois lignes cellulaires ont été choisies : une ligne de cellule de mélanome de souris B16, et les deux lignes communes de cellules humaines A549 (cellules épithéliales alvéolaires alvéolaires adénocaronomiques) et HeLa (cellules cancéreuses cervicales). Ces cultures sont passée à la phase médiane dans les médias appropriés avant d’être traitées avec 0, 10 ou 100 mM MG-132 pendant 4 h avant la récolte. MG-132 est un inhi...

Discussion

L’analyse de l’état d’ubiquitine dans un protéome est d’une importance croissante pour une grande variété de questions biologiques. La description de l’état d’ubiquitination d’un échantillon doit se concentrer non seulement sur le profil des protéines étant ubiquitinées, mais aussi sur la topologie d’une telle ubiquitination. L’évaluation de cette topologie par SP ciblée, telle que décrite ici, a un rôle à jouer dans un large éventail d’études biologiques.

I...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN)	Merck	100029
Ammonium bicarbonate (ABC)	Fluka	9830
Centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA)	Sigma	22790
Eppendorf LoBind	Eppendorf	22431081
Formic acid (FA)	Thermo Fisher Scientific	85178
Heavy Peptides	JPT Peptide Technologies
HPLC	Dionex	Ulitimate 3000
LC Column	Thermo Fisher Scientific	160321
Lys C	Wako	125-05061
Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM)	ACROS Organics	156100050
Positive Control Chain K48	Boston Biochem	UC-240
Positive Control Chain K63	Boston Biochem	UC-340-100
Positive Control Chain M1	Boston Biochem	UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S5881
Sonifier	Branson sonifier	SFX 150
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigam	T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific	77720
Trypsin	Promega	V1511A
Urea	Sigma	51456
Waters μElution C18 plates	Waters	186002318