Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции

Резюме

Этот метод описывает оценку глобальных изменений в топологии цепи убиквитина. Оценка проводится с помощью подхода, основанного на масс-спектрометрии, целенаправленной протеомики.

Аннотация

Оценка глобального профиля топологий убиквитиных цепочек в протеоме представляет интерес для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Протокол, изложенный здесь, использует модификацию диглицина (-GG), оставленную после триптического пищеварения убиквитина, включенного в цепочку. Путем количественной оценки этих топологически-характерных пептидов можно определить относительное изобилие каждой топологии цепи убиквитина. Сообщается о шагах, необходимых для количественной оценки этих пептидов путем параллельного мониторинга реакции с учетом стабилизации убиквитиных цепей. Подготовка тяжелых элементов управления, клеточный лиз и пищеварение описаны вместе с соответствующей установкой масс-спектрометра и рабочим процессом анализа данных. Представлен пример набора данных с возмущениями в топологии убиквитина, сопровождаемый примерами того, как оптимизация протокола может повлиять на результаты. Следуя изложенным шагам, пользователь сможет провести глобальную оценку ландшафта топологии убиквитина в их биологическом контексте.

Введение

Тесная регуляции белковой функции и стабильности имеет первостепенное значение, поскольку они являются основными факторами фенотипического контроля биологии. Функция белка построена из двух компонентов: его внутренней полипептидной последовательности и любых посттрансляционных модификаций (ПТМ). Были выявлены различные химические ПТС, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование^1. В 1975 году Гольдштейн и др.^{2 определили небольшой} белок и назвали его убиквитином из-за его вездесущей природы. Убиквитин оказался важным в деградации белка³. Однако с тех пор было установлено, что функция убиквитина как сигнальной молекулы выходит далеко за рамки регуляции белковой стабильности. Убиквитин сигнализации участвует в широком спектре других биологических функций, таких как стабилизация белка, аутофагия, контроль клеточного цикла, и торговля^{белками 4}.

В то время как другие ПТМ, как правило, двоичные (т.е. белок изменяется или остается неизмененным) для данного сайта, убиквитин может модифицировать белок как мономер, так и как полимерную цепь, при этом сам убиквитин прикрепляется. Кроме того, эта цепочка полиубикитинации может развиваться в нескольких топологиях с убиквититацией предыдущего убиквитина, прикрепляемого к одному из^{восьми мест связи 5,6.} Убиквитин передается многоступенчатым энзиматический процесс (Рисунок 1), где C-терминус убиквитина связан с одним из семи остатков лизина (K06, K11, K27, K29, K33, K48, или K63) или N-терминал предыдущего убиквитина (называется M1 или линейной убиквитина)^5. Эта топология цепи является ключом к судьбе белка в модификации. Например, модификация с цепочкой K48 или K11 приводит к деградации модифицированного белка у протеасомы, в то время как линейная цепь необходима для активации сигнализации NF-kB. Таким образом, относительное распределение этих цепных топологий имеет отношение к широкому кругу биологических вопросов.

Использование масс-спектрометрии (MS) имеет особое значение для анализа топологии цепи убиквитина, поскольку она не зависит от антител на основе или сродства на^{основе взаимодействий 7,8}, многие из которых имеют ограниченную специфичность и не различают различные типы цепи. Другая возможность обнаружения использует генетически модифицированных мутантов убиквитина. Здесь на аргинин обменивается специфический лизин, который не может поддерживать модификацию убиквитином. Отсутствие образования цепи убиквитина на субстратовый белок затем интерпретируется как доказательство для конкретной топологии⁹.

MS-идентификация убиквитинированных белков основана на том факте, что C-терминус убиквитина содержит остатки аргинина в положении 74, который распознается трипсином во время протеолитического приготовления образцов для анализа MS, отделяя C-терминальный двойной глицин. Этот GlyGly (-GG) остается ε к группе аминокислот лизина остатков субстрата белка. Для анализа топологии убиквитина, модификация происходит на одном из семи остатков лизина убиквитина. Это создает набор из семи ключевых пептидов, которые несут остатки лизина, который изменяется GG, специфичный для каждой из топологий(рисунок 2). Например, с K06 топологии, лизин на позиции 6 на аминокислотной последовательности будут защищены от триптического пищеварения с -GG модификации 114 Da добавил к этому лизин.

Идентификация конкретных предопределенных пептидов MS называется целевой протеомией, или, более конкретно, целевым приобретением пептида^10. В зависимости от производительности используемого масс-спектрометра разработаны два метода. Это отдельный мониторинг реакции (SRM), также называемый множественным мониторингом реакции (MRM), и параллельный мониторинг реакции (PRM). SRM включает в себя выбор переходов, состоящий из прекурсора m/z и продукта ион m/z. И наоборот, PRM требует только прекурсора m/z. После выбора выполняется полное обследование ионов продукта. Это имеет то преимущество, что никакой выбор соответствующих ионов продукта для количественной оценки на конкретный масс-спектрометр не требуется до^{измерения 11}. И SRM, и PRM могут, в зависимости от инструмента, быть запланированы. Планирование – это практика присвоения тайм-окну, в течение которого определенный ион будет включен для анализа, так как пептиды eluting в определенное время удержания из хроматографической системы. Сокращение числа ионов, допрашиваемых в любой момент времени, увеличивает частоту допросов тех ионов, которые были запланированы в то время, тем самым повышая точность данных.

В целом, применение целевой протеомики для убиквитин топологии такой же, как и любой другой целенаправленный эксперимент протеомика. Однако важны два ключевых отличия: во-первых, необходимо учитывать стабильность убиквитиных цепей. Существует несколько мощных деубикитинирующих ферментов (ДУБ), которые быстро деградируют цепи при клеточномлизе. Протеазы, специфичные для убиквитина, подразнятся на две категории: тиоэстеразы и металлопротеазы. Большинство убиквитин-гидролазы являются тиоэстеразы и нести остатки цистеина в их активном центре. Путем alkylating этот остаток цистеин, они могут быть инактивированы. Таким образом, использование буферов стабилизации убиквитина, содержащих алкилатные агенты, такие как N-этилмалеимид (NEM), и высоко денатурированных химических веществ, и сохранение образцов охлажденными имеет жизненно важное значение для успешного анализа. Во-вторых, в отличие от других целевых экспериментов, выбор пептида фиксируется. В типичном целевом эксперименте протеотипический пептид может быть выбран для хорошей хроматографической и ионизации. Для некоторых топологически-характерных пептидов, таких как K48 эти свойства хороши, в то время как для других, они менее желательны. Например, хроматография K33 в типичной установке обратной фазы плоха из-за формирования растянутого профиля элюции, а плохие свойства ионизации пептида K27 снижают его видимость на MS^12.

В этом протоколе мы описываем, как выполнить туплологическую оценку убиквитина биологического образца PRM. Примерные данные для процедуры представлены с использованием возмущения протеасомы с помощью ингибитора MG-132 лечения в нескольких различных типов клеток.

протокол

1. Подготовка тяжелого пептидного стандарта

1. В зависимости от поставщика и качества закупаемых тяжелых пептидов, тяжелые пептиды необходимо будет разбавить. Этот протокол использовал пептидные последовательности, о которые сообщалось в таблице 1,с аминокислотой C-терминала, модифицированной в лизин (¹³C₆¹⁵N₂-lysine) или аргинином (¹³C₆¹⁵N₄-аргинин).
   1. Смешайте тяжелые пептиды, разбавляя смесь 50% ацетонитрилом (ACN), чтобы создать пептидную смесь с каждым пептидом при 10 МКМ.
   2. Создайте алициты пептидной смеси и храните при -80 градусов по Цельсию.

2. Пример подготовки

1. Образец лиза
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильность убиквитин цепи должны быть рассмотрены во время подготовки образца. Храните биологические образцы и буферы охлажденными при 4 градусах Цельсия и добавляйте образцы в буфер стабилизации убиквитина как можно быстрее.
   1. Приготовьте раствор 1 M NH₄HCO_{3 (бикарбонат} аммония) в воде и отрегулируйте рН до 8 с помощью 1 M NaOH.
   2. Приготовьте раствор 200 мМ Н-этилмалимид (NEM) в воде.
   3. Подготовка буфера стабилизации убиквитина с использованием 8 М мочевины в 50 мМ NH₄HCO₃/10 мМ. Буфер стабилизации убиквитина должен быть подготовлен только что каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мл раствор 8 М мочевины потребует значительно меньше, чем 5 мл воды, учитывая расширение воды, когда в насыщенном растворе с мочевиной.
      ВНИМАНИЕ: Не подготовь буфер выше 50 градусов по Цельсию из-за тенденции мочевины к формированию полиуреи при высоких температурах.
   4. Повторное распространение биологического образца для исследования в буфере стабилизации убиквитина, направленном на 0,5 мкг/ОЛ белка и обледенеть клетки с помощью соответствующего метода для образца. Метод sonication consist of 3 10 s ИМПы ульс с sonifier SFX 150 Branson установленный на интенсивности 70% с 10 s проломами на льду между каждым ИМПом ульс, был использован для линий клетки в этом протоколе.
   5. Образец центрифуги при 18 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия в центрифуге столешницы.
   6. Передача супернатанта в свежую низко белку связывания микроцентрифуг трубки. Образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в этот момент, если это необходимо.
2. Подготовка образцов и элементов управления
   1. Если образцы заморожены, перемешайте (например, с термомиксером), пока они разморожены, чтобы быстро растворить мочевину.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте температуру выше 50 градусов по Цельсию из-за тенденции мочевины к формированию полиуреи при высоких температурах.
   2. Образец центрифуги при 18 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия в центрифуге столешницы.
   3. Перенесите 20 мкг образца в свежую низкообязательную микроцентрифугную трубку и отрегулируйте объем до 50 мкл с буфером стабилизации убиквитина.
   4. Создайте отрицательный контроль с использованием нормализованного объема буфера стабилизации убиквитина (50 МКЛ). В этом образце не должно присутствовать светлая версия каждого пептида, позволяющая засовывь любое световое загрязнение, возникающее в результате шипа в тяжелых пептидов. Этот отрицательный контроль был также использован для планирования времени удержания PRM, описанного в разделе 3.1.
   5. Был также создан положительный контроль с буфером стабилизации убиквитина и добавлением коммерчески доступных типов цепочек к нормализованного объема буфера стабилизации убиквитина (50 МЛ). Обычно доступны K63, K48 и M1. В репрезентативных результатах было использовано 20 нг K48, K63 и M1.
3. Сокращение, алкиляция и пищеварение
   1. Приготовьте раствор бикарбоната аммония 50 мМ (NH₄HCO₃₎в воде и отрегулируйте образец до рН 8 с 1 М НаОХ.
   2. Культура кишечной палочки, выращенная в бульоне LB, была центрифугирована 5000 х г в течение 5 мин для формирования гранулы, которая затем промылась 2x с PBS перед повторной ссадины в буфере стабилизации убиквитина на уровне 5 мкг/Л.
   3. Добавьте 1 мкг лизата кишечной палочки к каждому образцу и контролю. Этот протокол использует кишечную палочку (DH10B), но любой сложный лизат без убиквитина может быть использован. Обратите внимание, что убиквитин является общим для всех эукариот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование матрицы лизата кишечной палочки уменьшает потерю пептидов из-за неспецифической притонации к пластиковым изделиям. Это особенно заметно в отрицательном контроле или образцах с ограниченным содержанием белка и оказывает сильное влияние на наблюдение K63¹².
   4. Подготовка раствора 500 мМ трис (2-карбоксетил)фосфин (TCEP) в воде класса MS (DTT может быть использован в качестве альтернативы).
   5. Уменьшите образцы и элементы управления путем добавления TCEP к окончательной концентрации 50 мМ. Вихрь кратко перед инкубацией в течение 30 минут при комнатной температуре (RT). При использовании DTT температура должна быть повышена до 50 градусов по Цельсию.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте температуру выше 50 градусов по Цельсию из-за тенденции мочевины к формированию полиуреи при высоких температурах.
   6. Подготовка раствора хлороацетамида 550 мМ (CAA) в NH₄HCO₃. Хранить в темноте.
   7. Алкилат образцов и элементов управления, добавив CAA к окончательной концентрации 55 мМ. Vortex кратко перед инкубацией в течение 20 минут на RT в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CAA используется вместо iodoacetamide в качестве агента сокращения, чтобы уменьшить вероятность двойной модификации карбамидометил (114,0429) на остатке лизина ошибочно принимают за -GG модификации (114,0429)¹³.
   8. Добавьте эндопптидазу LysC к образцам в соотношении 1:25 (w/w) к содержанию белка. Инкубационный для 3 ч при 37 градусах Цельсия.
   9. Разбавить образцы и элементы управления с 200 йл 50 мМ NH₄HCO₃ рН 8 (1:5 v/v).
   10. Добавить трипсин в образцы в соотношении 1:25 ж/в к содержанию белка. Инкубационный для 12 ч при 37 градусах Цельсия.
   11. Добавьте 10% раствора формической кислоты (FA) в воду класса MS при соотношении 1:10 v/v к каждому образцу и контролю образца. Проверьте, что рН является lt;3) до очистки C_{18 и} добавить больше мимической кислоты, если это необходимо.
   12. К каждому образцу и контролю добавить 0,5 МКЛ тяжелого пептидного стандарта, созданного в разделе 1.
4. Очистка пептида
   1. Некоторые производители предлагают C_{18 очистки} советы или пластины. Следуйте инструкциям производителя для используемого продукта, и сухие эластиированные пептиды в вакуумной центрифуге, готовые к анализу MS.

3. Анализ LC-MS/MS

1. Выполнить первоначальный анализ PRM по тяжелому пептидного стандарта в незапланированной форме.
   1. Повторное высохшей пробы в 10 йл буфера загрузки MS 2% ACN/0.05% трифтороацевая кислота (TFA).
   2. Оборудуй HPLC с аналитической колонкой C_{18 обратной} фазы (75 мкм х 15 см, 2 мкм 100 й С_{18 бусин),} предназначенной для нанопотока MS. Форма линейных градиентов обмена MS класса воды дополнен 0,1% FA с ACN, содержащий 0,1% FA. Для сохранения жизни аналитической колонки здесь использовалась колонка жертвенной ловушки (75 мкм х 2 см, 3_{мкм, 100 й С 18 бусин),} чтобы сохранить жизнь аналитической колонки, но не требуется.
   3. Привязать выход аналитической колонки к источнику наноэЭ на масс-спектрометре высокого разрешения.
   4. Используйте соответствующий целевой метод протеомика для масс-спектрометра. Например, на методе «К-Exactive плюс два эксперимента» цикл между Full MS и экспериментом PRM. Для эксперимента Full MS использовалось разрешение 120 000 с целью AGC 1e6 и 240 мс в качестве максимального ИТ. Для эксперимента PRM использовалась та же цель AGC и максимальная ИТ с более низким разрешением 60 000 и изоляционные окна 1,2 м/з.
   5. Ввись 200 нг отрицательного контроля в аналитическую колонку с помощью автоамплеера HPLC. Примените линейный градиент к выборке на аналитической колонке, увеличив концентрацию ACN с 2 до 25% в течение 45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ACN на 25% ниже, чем обычно для протеомики, из-за низкой гидрофильной природы типичных убиквитин топологически-характерных пептидов. Если другие пептиды должны быть количественно, более высокая концентрация ACN может быть желательно для достижения хорошей цели разделения.
   6. Проанализируйте результаты запуска планирования, описанные в разделе 4.2, чтобы создать запланированный список включений.
2. Анализ образцов
   1. Вы запустите оставшиеся образцы, описанные для планирования в 3.1, кроме использования запланированного списка включения, созданного в разделе 4.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробел должен быть запущен после положительного контроля, чтобы гарантировать, что перенос от предыдущего запуска не обнаруживается в последующих образцах.

4. Анализ программного обеспечения

1. Создайте список включения соответствующего форматирования для используемого MS. В этом протоколе использовалось программное обеспечение с открытым исходным кодом Skyline (версия 19.1.0.193) (https://skyline.ms), которое предлагает хорошо документированную поддержку и помощь. Список включения может быть создан для нескольких масс-спектрометров с использованием объекта изоляции экспорта.
   1. Откройте новый документ Skyline.
   2. Выберите тяжелые изотопные модификации, соответствующие тяжелым топологически характерным пептидам. В настройках| Пептид Настройки под вкладкой Модификация, нажмите на поле имени, чтобы увидеть потенциальную модификацию. Отбор основан на изотопном состоянии закупаемых тяжелых пептидов. В этом примере использовались синтетические пептиды, несущие либо тяжелый лизин (¹³C₆¹⁵N₂-лизин) или тяжелый аргинин (¹³C₆¹⁵N₄-аргинин) в C-термине. Соответствующие надписи будут: "Label:13C(6)15N(2) (C-термин K)" и "Label:13C(6)15N(4) (C-термин R)".
   3. Выберите настройки| Переход. Под вкладкой Фильтр включают Прекурсор сборы 2, 3, 4.
   4. Вставьте пептиды, выбрав Редактировать| Вставка| Пептиды.
   5. Заполните соответствующие области, включая топологию-характерную пептидную последовательность и белковое название (например, "Цепь-K63").
   6. Расширьте каждый пептид, показанный в панели Targets. Удалить нежелательные состояния заряда. Предпочтительное состояние заряда и энергия столкновения, которая может отличаться в зависимости от используемого масс-спектрометра, для каждого топологико-характерного пептида показана в таблице 1.
   7. Для каждого топологии характерный пептид (за исключением M1, где GG включен в последовательность) право нажмите на последовательность и выберите Modify. Добавить GG в качестве структурной модификации, нажав на поле имени и выбрав lt;Показать все... перед выбором "GlyGly (K)".
   8. Экспорт изоляционный список файл| Экспорт| Изоляционныйсписок, выберите тип инструмента и установите тип метода на стандарт. Выбор OK откроет подсказку для сохранения файла .csv, который может быть использован для создания метода PRM.
2. Создайте запланированный список включения на основе тяжелого пептидного планирования запуска объяснил здесь с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом Skyline.
   1. Создайте целевой список, описанный в разделе 4.1.
   2. Импортируем запуск расписания в 3.1, выбрав файл| Импорт| Результаты.
   3. Просмотрите идентификацию. Тяжелый сигнал для каждого пептида наблюдается, нажав на массу для каждого тяжелого пептида вступления. Правильное распознавание пика часто определяется автоматически, но программное обеспечение может потребовать ручного кураторства, выбрав пик с помощью щелчка мыши и перетащить под x-оси.
   4. Время удержания, выбранное для тяжелых вариантов, также применяется к световым версиям, создавая тем самым график для PRM. Окно планирования может быть изменено в соответствии с настройками| Настройки пептида с помощью вкладки Прогноз, изменяя окно времени.
   5. Запланированный список включения теперь можно экспортировать с помощью файла| Экспорт| Изоляционный список и выбор соответствующего типа инструмента и тип метода настройки в запланированный.
3. Анализируйте данные.
   1. Импорт образцов таким же образом, как и для анализа планирования запуска в разделе 4.2.
   2. После полного импорта всех образцов рекомендуется кураторизация переходов. Это процесс, с помощью которого удаляются переходы с помехами или плохими соотношениями сигнала к шуму. Пример хроматограммы до и после кураторства показан на рисунке 4.
   3. Теперь данные можно экспортировать либо путем правого нажатия на соответствующие графики и выбора данных копирования, либо путем выбора файла| Экспорт| Результаты.

Результаты

Чтобы продемонстрировать использование анализа цепи убиквитина PRM, были отобраны три клеточные линии: линия клеток мыши меланомы B16 и две общие линии клеток человека A549 (аденокарциномические альвеолярные базальные эпителиальные клетки) и HeLa (раковые клетки шейки матки). Эти культуры вы...

Обсуждение

Анализ состояния убиквитина в протеоме имеет все большее значение для широкого спектра биологических вопросов. Описание состояния убиквитина образца должно быть сосредоточено не только на профиле убиквитинированных белков, но и на топологии такого убиквитина. Оценка этой топологии ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN)	Merck	100029
Ammonium bicarbonate (ABC)	Fluka	9830
Centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA)	Sigma	22790
Eppendorf LoBind	Eppendorf	22431081
Formic acid (FA)	Thermo Fisher Scientific	85178
Heavy Peptides	JPT Peptide Technologies
HPLC	Dionex	Ulitimate 3000
LC Column	Thermo Fisher Scientific	160321
Lys C	Wako	125-05061
Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM)	ACROS Organics	156100050
Positive Control Chain K48	Boston Biochem	UC-240
Positive Control Chain K63	Boston Biochem	UC-340-100
Positive Control Chain M1	Boston Biochem	UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S5881
Sonifier	Branson sonifier	SFX 150
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigam	T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific	77720
Trypsin	Promega	V1511A
Urea	Sigma	51456
Waters μElution C18 plates	Waters	186002318