JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعرض هذه المقالة إجراءات تجريبية لتقييم ضعف الذاكرة في فئران الصرع الناجمة عن البيلوكاربين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الآليات الفسيولوجية المرضية للتدهور المعرفي المرتبط بالصرع ، والتي تعد واحدة من أكثر الأمراض المصاحبة شيوعًا في الصرع.

Abstract

الضعف الإدراكي هو واحد من الأمراض المصاحبة الأكثر شيوعا في الصرع الفص الصدغي. وللحد من التدهور المعرفي المرتبط بالصرع في نموذج الحيوان للصرع، قمنا بتوليد فئران الصرع المزمنة التي عولجت بالبيلوكاربين. نحن نقدم بروتوكولا لثلاثة اختبارات سلوكية مختلفة باستخدام هذه الفئران الصرع: موقع الكائن رواية (NL)، التعرف على الكائن رواية (NO)، وفصل نمط (PS) اختبارات لتقييم التعلم والذاكرة للأماكن والكائنات والسياقات، على التوالي. نحن نشرح كيفية تعيين الجهاز السلوكي وتوفير الإجراءات التجريبية لاختبارات NL و NO و PS بعد اختبار ميداني مفتوح يقيس أنشطة الحيوانات الحركية القاعدية. كما أننا نصف المزايا التقنية لاختبارات NL و NO و PS فيما يتعلق بالاختبارات السلوكية الأخرى لتقييم وظيفة الذاكرة في الفئران الصرع. وأخيرا، فإننا نناقش الأسباب والحلول المحتملة للفئران الصرع فشل لجعل 30 ق من اتصال جيد مع الكائنات خلال جلسات التعرّف، وهي خطوة حاسمة لنجاح اختبارات الذاكرة. وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول معلومات مفصلة حول كيفية تقييم ضعف الذاكرة المرتبطة بالصرع باستخدام الفئران. NL، NO، وPS الاختبارات هي بسيطة وفعالة الاختبارات التي هي مناسبة لتقييم أنواع مختلفة من الذاكرة في الفئران الصرع.

Introduction

الصرع هو اضطراب مزمن يتميز بالنوبات المتكررة العفوية1،2،3. لأن النوبات المتكررة يمكن أن تسبب تشوهات هيكلية ووظيفية في الدماغ1,2,3, يمكن أن يساهم نشاط النوبات غير الطبيعي في الخلل المعرفي ، والذي يعد واحدًا من أكثرالأمراضالمصاحبة للصرع 4،5،6. على عكس أحداث النوبات المزمنة ، والتي هي عابرة ولحظة ، يمكن أن تستمر العاهات الإدراكية طوال حياة مرضى الصرع ، مما يؤدي إلى تدهور نوعية حياتهم. لذلك ، من المهم فهم الآليات الفسيولوجية المرضية للتدهور المعرفي المرتبط بالصرع.

وقد استخدمت نماذج الحيوانات التجريبية المختلفة من الصرع لإثبات العجز في التعلم والذاكرة المرتبطة الصرع المزمن7،8،9،10،11،12. على سبيل المثال ، تم استخدام متاهة مياه موريس ، وتكييف الخوف السياقي ، ولوحة الثقب ، وموقع الكائن الجديد (NL) ، واختبارات التعرف على الكائن الجديدة (NO) في كثير من الأحيان لتقييم خلل الذاكرة في صرع الفص الصدغي (TLE). نظرًا لأن قرن آمون هو أحد المناطق الأساسية التي يظهر فيها TLE علم الأمراض ، فإن الاختبارات السلوكية التي يمكنها تقييم وظيفة الذاكرة المعتمدة على قرن آمون غالبًا ما يتم اختيارها بشكل تفضيلي. ومع ذلك، بالنظر إلى أن النوبات يمكن أن تحفز تكوين الأعصاب فرس النهر المنحرف والمساهمة في التدهور المعرفي المرتبطة بالصرع10، النماذج السلوكية لاختبار وظيفة الخلايا العصبية الوليدة (أي فصل النمط المكاني ، PS)8،13 يمكن أن توفر أيضًا معلومات قيمة حول الآليات الخلوية لضعف الذاكرة في الصرع.

في هذه المقالة، ونحن نظهر بطارية من اختبارات الذاكرة، NL، لا، وPS، للفئران الصرع. الاختبارات بسيطة ويمكن الوصول إليها بسهولة ولا تتطلب نظام متطور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ووافقت لجنة الأخلاقيات التابعة للجامعة الكاثوليكية الكورية على جميع الإجراءات التجريبية، ونفذت وفقا للمعاهد الوطنية للدليل الصحي لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 80-23).

1. اختبار موقع كائن الرواية (NL)

  1. إعداد الصرع C57BL/6 أو الفئران المعدلة وراثيا 4-6 أسابيع بعد حقن البيلوكاربين.
    ملاحظة: تم المضبوطات الحادة الناجمة عن حقن البيلوكاربين داخل البيريتانية (IP) ، بعد البروتوكول المفصل في تقريرنا السابق14.
  2. نقل الفئران الصرع من غرفة التربية إلى غرفة السلوك قبل يوم واحد من بدء الاختبارات السلوكية. السماح للفئران لتعود لمدة 12 ساعة على الأقل بين عشية وضحاها.
  3. في غرفة السلوك، فصل الفئران الفردية في أقفاص جديدة للسكن واحد. اكتب المعلومات لكل الحيوان على بطاقة القفص وإبقاء الحيوانات في نفس الأقفاص طوال الاختبار السلوكي. يمكن نقل أقفاص متعددة في وقت واحد باستخدام عربة.
  4. في اليوم التالي، ابدأ 3 أيام من جلسات الاعتياد (H1-H3) في الصباح الباكر. تكييف الحيوانات إلى الضوء المنخفض في أقفاصمنازلهم لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  5. إعداد مربع حقل مفتوح بأبعاد خارجية 44 × 44 × 31 سم وأبعاد داخلية 43 × 43 × 30.5 سم. في اليوم الأول من الاعتياد (H1)، ضع مقياس الكنومينومتر في وسط مربع الحقل المفتوح وقم بضبط الوضوء إلى 60 لوكس.
  6. رش الكلمة والجدران من مربع حقل مفتوح مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية نظيفة لإزالة الإشارات الشمية المحتملة. ثم انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقية تماما.
  7. تقييم النشاط الحركي لكل فأرة من خلال إجراء اختبار حقل مفتوح.
    1. لتسجيل وتتبع سلوك كل ماوس تجريبي، استخدم برنامج تتبع فيديو سلوك الحيوان (انظر جدول المواد).
    2. بمجرد فتح برنامج تتبع الفيديو، قم بمعايرة حجم مربع الحقل المفتوح. ثم قم بتعيين المنطقة للتتبع. تعيين 3 ق من الكمون و 15 دقيقة من وقت الاستحواذ لتجنب تتبع أيدي المجرب. إدراج المعلومات حول كل ماوس تجريبي (المجموعة والجنس والعمر وما إلى ذلك).
    3. ثم ضع ماوسًا تجريبيًا برفق في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار. القيام بذلك عن طريق وضعه على غطاء القفص للحد من التعامل مع الإجهاد والقلق المرتبطة. ثم قم بتحرير الماوس بالقرب من جدار مربع الحقل المفتوح الذي هو الأبعد عن المكان الذي ستكون فيه الكائنات أثناء جلسة تعريف (الخطوة 1.9.3.).
      ملاحظة: بمجرد أن يكون الماوس في مربع الحقل المفتوح، سيقوم برنامج تتبع الماوس باكتشافه تلقائيًا وبدء التسجيل. للتتبع الأمثل للاستكشاف ، يمكن وضع الكاميرا مباشرة فوق مربع الحقل المفتوح.
    4. بعد 15 دقيقة من التسجيل، أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي عن طريق وضعه على غطاء القفص. تنظيف مربع حقل مفتوح مع رذاذ الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية نظيفة بين التجارب. استعادة الضوء الساطع وقياس المسافة الإجمالية للالحيوان انتقلت باستخدام برنامج تتبع الفيديو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. افتح برنامج تتبع الفيديو ومقاطع الفيديو. ثم انقر فوق تحليل لحساب المسافة الإجمالية التي تم نقلها استنادًا إلى معايرة حجم مربع الحقل المفتوح.
  8. في اليوم الثاني واليوم الثالث، قم بإجراء جلسات الاعتياد (H2، H3) من خلال تكرار الخطوات من 1.3 إلى 1.7.
  9. في اليوم 4، قم بإجراء جلسة تعريف (F1).
    1. في الضوء الخافت، ضع كل فأرة في الحقل المفتوح الفارغ لمدة 3 دقيقة. بعد ذلك إعادة التأهيل القصير، أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسحها إلى أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع جسمين متطابقين (دمى مطاطية، كائن A) في ساحة الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح، التي تواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. السماح للاستكشاف مجانا لمدة 20 دقيقة وقياس يدويا الوقت الذي يقضيه استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف (30 ق) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F1 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالة الماوس من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
    5. بعد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح، تنظيف الأرض وجدران الصندوق بدقة مع رذاذ الإيثانول 70٪ ومسحها بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
  10. في اليوم 5، قم بإجراء جلسة اختبار NL.
    1. نقل الماوس من قفص المنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة. ثم أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسحها إلى أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. نقل كائن واحد (دمية مطاطية، كائن A) إلى موقف قطري، 5 سم بعيدا عن الجدران المجاورة. إصلاح الكائن مع الشريط على الوجهين. نقل الماوس التجريبي على غطاء قفصها إلى منطقة الحقل المفتوح ووضعه في مواجهة جدار مربع الحقل المفتوح.
      ملاحظة: موازنة موقع الكائن انتقلت لتقليل أي تفضيل فطري محتمل لاتجاه معين. على سبيل المثال، قم بتغيير موقع الكائن المفضل من جلسة تعريف لنصف الحيوانات التجريبية، وبالنسبة لبقية الحيوانات، قم بنقل الكائن الأقل تفضيلًا من جلسة تعريف.
    4. السماح 10 دقيقة من الاستكشاف الحر وتسجيل مع نظام تتبع الفيديو. قياس الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام ساعتي توقيت وحساب نسبة التمييز كـ
      figure-protocol-5288
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    5. الاستيلاء على ذيل الماوس التجريبي ووضعه على غطاء قفصلنقلها إلى القفص المنزلي. لمدة 3 أيام (أيام 6-8)، والسماح للفأر بقية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
    6. بمجرد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح ، قم بتنظيف الأرض وجدران الصندوق تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ ومسحه بمنشفة ورقية.

2. اختبار التعرف على الكائن رواية (NO)

  1. في اليوم 9، قم بإجراء جلسة اعتياد لمدة 15 دقيقة من خلال تكرار الخطوات 1.2-1.7.
  2. في اليوم 10، قم بإجراء جلسة تعريف (F1).
    1. في ضوء خافت، ضع الماوس في الحقل المفتوح الفارغ لمدة 3 دقيقة. بعد إعادة تأهيل الماوس إلى منطقة الحقل المفتوح ، إعادته مؤقتًا إلى قفصه الأصلي.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع جسمين متطابقين (أنابيب بلاستيكية سعة 50 مل مملوءة بـ 40 مل من الماء، الكائن B) في الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. كما يتعرض الحيوان إلى اثنين من الكائنات المختلفة (50 مل أنبوب بلاستيكي مليئة 40 مل من الماء، الكائن B؛ جرة كوبلين الزجاج، الكائن C) في اختبار NO، موازنة الكائن خلال جلسة F1. على سبيل المثال، تقديم كائنين متطابقة (الجرار كوبلين الزجاج، الكائن C) لنصف الحيوانات في المجموعة.
    5. السماح للاستكشاف مجانا لمدة 20 دقيقة وقياس يدويا الوقت الذي يقضيه استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف (30 ق) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F1 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالته من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
    6. بعد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح، تنظيف الأرض وجدران الصندوق بدقة مع رذاذ الإيثانول 70٪ ومسحها بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
  3. في اليوم التالي (اليوم 11)، قم بإجراء جلسة الاختبار NO.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادة الحيوان إلى قفصالمنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. استبدال كائن واحد (50 مل أنبوب بلاستيكي مليئة 40 مل من الماء، الكائن B) مع كائن آخر (جرة كوبلين الزجاج، كائن C) 5 سم بعيدا عن الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. نقل الماوس التجريبي على غطاء القفص إلى الحقل المفتوح، ووضعه في مواجهة الجدار. موازنة الكائنات المقدمة معًا أثناء اختبار NO. على سبيل المثال، استبدل جرة كوبلين زجاجية واحدة (الكائن C) بأنبوب بلاستيكي سعة 50 مل مملوء ًا بـ 40 مل من الماء (الكائن B) للفئران المعرضة لجرار كوبلين الزجاجية (الكائن C) أثناء جلسة التعرف.
      ملاحظة: يمكن أيضاً إجراء موازنة موقع الكائن استبدال لتقليل تفضيل الفطرية المحتملة لاتجاه معين. على سبيل المثال، لكل مجموعة من الحيوانات المعرضة لمجموعة من كائنين (الكائن B أو الكائن C)، قم بتغيير الكائن المفضل في جلسة التعرف لنصف الحيوانات التجريبية، وبالنسبة لبقية الحيوانات، استبدل الكائن الأقل تفضيلًا في جلسة التعرف.
    4. السماح 10 دقيقة من الاستكشاف المجاني وتسجيله باستخدام نظام تتبع الفيديو. قياس الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام ساعتي توقيت وحساب نسبة التمييز.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    5. الاستيلاء على ذيل الماوس التجريبي ووضعه على غطاء قفص لنقلها إلى القفص المنزلي. لمدة 3 أيام (أيام 12-14)، والسماح للفأر بقية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
    6. بمجرد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح ، قم بتنظيف الأرض وجدران مربع الحقل المفتوح تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ ومسحه بمنشفة ورقية.

3. اختبار فصل النمط (PS)

  1. في اليوم 15، قم بإجراء جلسة تعريف الأول (F1) لاختبار PS.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادته إلى قفص المنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات تماما ولوحة الكلمة متشابكة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع لوحة الأرضية (42.5 × 42.5 × 0.5 سم) مع الشبكة العريضة (5.5 × 5.5 سم) في مربع الحقل المفتوح ووضع جسمين متطابقين (قوارير بلاستيكية مليئة بـ 50 مل من الماء، الكائن D) في الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. كما يتعرض الحيوان إلى اثنين من الكائنات المختلفة (البلاستيك تي قارورة مليئة 50 مل من الماء، الكائن D؛ زجاجة زجاجة، كائن E) في اختبار PS، موازنة الكائن خلال جلسات F1 و F2. على سبيل المثال، تقديم كائنين متطابقين (زجاجات، كائن E) على أرضية الشبكة الواسعة لنصف الحيوانات في المجموعة.
    5. السماح بالاستكشاف المجاني لمدة 20 دقيقة، وقياس الوقت المستغرق يدويًا في استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف الإجمالي (30 s) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F1 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالته من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    6. بعد الانتهاء من جلسة التعرف الأولى (F1) ، قم بتنظيف الكائنات ولوحة الأرضية تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ وإزالتها من مربع الحقل المفتوح.
  2. في اليوم التالي (اليوم 16)، قم بإجراء جلسة تعريف الثانية (F2) لاختبار PS.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادة الحيوان إلى قفصالمنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات تماما ولوحة أرضية متشابكة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع لوحة الأرضية (42.5 × 42.5 × 0.5 سم) مع الشبكة الضيقة (2.75 × 2.75 سم) في مربع الحقل المفتوح ووضع جسمين متطابقين (زجاجات، كائن E) في الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. لموازنة، الحاضر اثنين من الكائنات متطابقة (البلاستيك تي قارورة مليئة 50 مل من الماء، الكائن D) على أرضية الشبكة الضيقة.
    5. السماح للاستكشاف مجانا لمدة 20 دقيقة وقياس يدويا الوقت الذي يقضيه استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف الإجمالي (30 s) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F2 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالته من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    6. بعد الانتهاء من جلسة التعرف الثانية (F2) ، قم بتنظيف الكائنات ولوحة الأرضية تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ وإزالتها من مربع الحقل المفتوح.
  3. في اليوم التالي (اليوم 17)، قم بإجراء جلسة اختبار PS.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادته إلى قفص المنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات تماما ولوحة أرضية متشابكة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع لوحة الأرضية مع الشبكة الضيقة (2.75 × 2.75 سم) في مربع الحقل المفتوح ووضع جسمين مختلفين (قارورة T بلاستيكية مليئة بـ 50 مل من الماء ، الكائن D ؛ زجاجة ، كائن E) على لوحة الأرضية على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. نقل الماوس التجريبي على غطاء القفص إلى منطقة الحقل المفتوح ووضعه في مواجهة الجدار.
    4. موازنة الكائنات التي تم تقديمها معًا أثناء اختبار PS. على سبيل المثال، ضع كل كائن (الكائن D، الكائن E) على أرضية الشبكة الضيقة لجعل الكائن E كائن ًا جديدًا في هذا السياق. ويمكن أيضا موازنة موقع الكائن دال أو الكائن E (كائن جديد على نمط الكلمة الضيقة) أيضا للحد من احتمال تفضيل فطري لاتجاه معين. على سبيل المثال، استبدال الكائن المفضل من جلسة التعرف الثانية لنصف الحيوانات التجريبية، وبالنسبة لبقية الحيوانات، استبدال الكائن الأقل تفضيلاً من جلسة التعرّف الثانية.
    5. السماح 10 دقيقة من الاستكشاف المجاني وتسجيل باستخدام نظام تتبع الفيديو. قياس الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام ساعتي توقيت وحساب نسبة التمييز.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    6. الاستيلاء على ذيل الماوس التجريبي ووضعه على غطاء قفص لنقلها إلى القفص المنزلي.

4. كريسيل تلطيخ البنفسجي

  1. بعد الانتهاء من جميع الاختبارات السلوكية، قم بحقن الحيوان عن طريق حقن كوكتيل (4:0.5) من الكيتامين (50 ملغ/مل) وxylazine (23.3 ملغم/مل) المذابة في المالحة بجرعة 110 مل/كغ من وزن الجسم (IP؛ 1 مل حقنة؛ 26 جم إبرة). تحقق من عمق التخدير من خلال عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم.
  2. مرة واحدة هو عميق في المخدرات الحيوان، وأداء التروية عبر التوربيد مع 4٪ بارافورمالديهايد لإصلاح الدماغ15.
  3. بعد الانتهاء من التطفل عبر القيراط ، قطع رأس الحيوان بزوج من المقص15. ثم، إزالة الجمجمة باستخدام زوج من مقص القزحية لفضح الدماغ. بعد عزل الدماغ, بعد إصلاحه في 4% مظليديهايد بين عشية وضحاها, تليها الحماية من البرد في 30% السكروز في 0.01 M الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة.
  4. جعل المقاطع التاجية (30 ميكرون) من الدماغ المفاجئة المجمدة باستخدام cryostat.
  5. قم بتركيب أنسجة الدماغ على الشرائح وتنفيذ سلسلة من خطوات الترطيب من الإيثانول 100٪ إلى مياه الصنبور عن طريق الغسيل لمدة 3 دقيقة بالتتابع في 100٪، 95٪، 90٪، 80٪، 70٪ الإيثانول.
  6. احتضان شرائح الأنسجة في محلول البنفسج كريسيلي 0.1٪ لمدة 15 دقيقة.
  7. إزالة وصمة عار مفرطة عن طريق غمر شرائح الأنسجة في 95٪ الإيثانول/0.1٪ حمض الخليك الجليدي، ومن ثم تجفيف الأنسجة مع حلول الإيثانول 100٪، 50٪ الإيثانول/50٪ xylene، و 100٪ xylene.
  8. coverslip شرائح الأنسجة باستخدام المتاحة تجاريا xylene تصاعد المتوسطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد جدول زمني عام للتجارب والإعداد لتقييم الوظيفة المعرفية في الشكل 1. بعد ستة أسابيع من إدخال المضبوطات الحادة الناجمة عن البيلوكاربين ، تعرضت الفئران لاختبارات NL و NO و PS في هذا الترتيب مفصولة بفترات راحة لمدة 3 أيام بين الاختبارات(الشكل 1A). بالنسبة لاختبا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا العمل الإجراءات التجريبية لتقييم الوظيفة المعرفية لدى الفئران المصابة بالصرع المزمن. يتم استخدام العديد من نماذج الاختبار السلوكي المختلفة لتقييم وظائف التعلم والذاكرة في الفئران18. متاهة المياه موريس، متاهة الذراع شعاعي، Y-متاهة، تكييف الخوف السياقي، والاختبارات ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونشكر الدكتور جاي مين لي على دعمه التقني. تم دعم هذا العمل من خلال منح المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (NRF-2019R1A2C1003958، NRF-2019K2A9A2A08000167).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml syringeSung-shimUse with the 26 or 30 gauge needle
70% EthanolDuksanUN1170Spray to clean the box and objects
black curtainFor avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violetSigmaC5042For Cresyl violet staining
cryotomeLeicaE21040041For tissue sectioning
double-sided sticky tapeFor the firm placement of the objects
DPX mounting mediumSigma06522
ethanol seriesDuksanUN1170Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometerTES Electrical Electronic Corp.1334AFor the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unitThermocare#W-1
ketamine hydrochlorideYuhan7003Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lampLungoP13A-0422-WW-04Lighting for the behavioral test room
objectsRubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field boxLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towelYuhan-Kimberly47201Use to dry open field box and objects
paraformaldehydeMerck Millipore104005Make 4% solution
pilocarpine hydrochlorideSigmaP6503
rulerUse to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrateSigmaS2250Make 10X stock
Smart system 3.0PanlabVideo tracking system
stopwatchJunsoJS-307For the measurement of explorative activities of mice
sucroseSigmaS9378For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate saltSigmaT2528Make 10X stock
video camera (CCD camera)VisionVCE56HQ-12Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xyleneDuksanUN1307For Cresyl violet staining

References

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 pilocarpine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved