JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, pilokarpin kaynaklı epileptik farelerde hafıza bozukluklarının değerlendirilmesi için deneysel prosedürler sunmaktadır. Bu protokol, epilepside en sık görülen komorbiditelerden biri olan epilepsi ile ilişkili kognitif gerilemenin patofizyolojik mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Özet

Kognitif bozukluk temporal lob epilepsisinde en sık görülen komorbiditelerden biridir. Epilepsi bir hayvan modeliepilepsi ilişkili bilişsel gerileme özetlemek için, biz pilocarpine tedavi kronik epileptik fareler üretti. Bu epileptik fareleri kullanarak üç farklı davranış testi için bir protokol sayılmaktadır: sırasıyla yerler, nesneler ve bağlamlar için öğrenme ve belleği değerlendirmek için yeni nesne konumu (NL), yeni nesne tanıma (NO) ve desen ayırma (PS) testleri. Hayvanların bazal lokomotor aktivitelerini ölçen açık alan testini takiben davranışsal aygıtın nasıl ayarlanılacağını ve NL, NO ve PS testleri için deneysel prosedürlerin nasıl sağlanılacağını açıklıyoruz. Ayrıca, epileptik farelerde bellek işlevini değerlendirmek için diğer davranışsal testlere ilişkin OLARAK NL, NO ve PS testlerinin teknik avantajlarını da açıklıyoruz. Son olarak, başarılı bellek testleri için kritik bir adım olan alışım oturumları sırasında nesnelerle 30 s iyi temas kuramayan epileptik farelerin olası nedenleri ve çözümlerini tartışıyoruz. Böylece, bu protokol fareler kullanarak epilepsi ile ilişkili bellek bozukluklarının nasıl değerlendirildiği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. NL, NO ve PS testleri epileptik farelerde bellek farklı türde değerlendirilmesi için uygun basit, verimli tahliller vardır.

Giriş

Epilepsi spontan tekrarlayan nöbetler ile karakterize kronik bir hastalıktır1,2,3. Tekrarlayan nöbetler beyinde yapısal ve fonksiyonel anormalliklere neden olabileceğinden1,2,3, anormal nöbet aktivitesi bilişsel işlev bozukluğuna katkıda bulunabilir, en sık görülen epilepsi ilişkili komorbiditelerden biridir4,5,6. Geçici ve anlık olan kronik nöbet olaylarının aksine, bilişsel bozukluklar epileptik hastaların yaşamları boyunca devam ederek yaşam kalitelerini bozabilir. Bu nedenle epilepsi ile ilişkili bilişsel gerilemenin patofizyolojik mekanizmalarını anlamak önemlidir.

Epilepsi çeşitli deneysel hayvan modelleri kronik epilepsi,,7,8,9,10,11,12ile ilişkili öğrenme ve hafıza açıklarını göstermek için kullanılmıştır. Örneğin, Morris su labirent, bağlamsal korku klima, delik-board, yeni nesne konumu (NL) ve yeni nesne tanıma (NO) testleri sık sık temporal lob epilepsi (TLE) bellek disfonksiyon değerlendirmek için kullanılmıştır. Hipokampus TLE'nin patoloji gösterdiği birincil bölgelerden biri olduğundan, hipokampusa bağlı bellek fonksiyonunu değerlendirebilen davranıştestleri genellikle tercihen seçilir. Ancak, nöbetler anormal hipokampal nörogenezi neden olabilir ve epilepsi ilişkili bilişsel gerileme katkıda bulunabilir göz önüne alındığında10, dentate yenidoğan nöronal fonksiyon test etmek için davranışsal paradigmalar (yani, mekansal desen ayırma, PS)8,13 de epilepsi hafıza bozukluklarının hücresel mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Bu makalede, epileptik fareler için bir dizi bellek testi, NL, NO ve PS'yi gösteriyoruz. Testler basit ve kolay erişilebilir ve gelişmiş bir sistem gerektirmez.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Kore Katolik Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Laboratuvar Hayvanları Nın Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüleri Rehberi (NIH Yayınları No. 80-23) uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. Yeni nesne konum testi (NL)

  1. Pileptik C57BL/6 veya transgenik fareleri pilokarpin enjeksiyonundan 4-6 hafta sonra hazırlayın.
    NOT: Akut nöbetler intraperitoneal (IP) pilokarpin enjeksiyonu ile indüklenmiş, önceki raporumuzda ayrıntılı olarak belirtilen protokol14.
  2. Epileptik fareleri davranış testleri başlamadan bir gün önce üreme odasından davranış odasına aktarın. Farelerin bir gecede en az 12 saat alışmasını bekleyin.
  3. Davranış odasında, tek bir konut için yeni kafesler halinde ayrı fareler. Kafes kartına her hayvan için bilgi yazın ve davranışsal test boyunca aynı kafeslerde hayvanları tutmak. Birden fazla kafes aynı anda bir sepet kullanılarak transfer edilebilir.
  4. Ertesi gün, erken sabah alışkanlık oturumları (H1-H3) 3 gün başlar. En az 30 dakika boyunca ev kafeslerinde düşük ışık için hayvanlar acclimate.
  5. 44 x 44 x 31 cm dış ebatları ve 43 x 43 x 30,5 cm iç boyutlarında açık alan kutusu hazırlayın. Alışkanlık (H1) gün 1 günü, açık alan kutusunun ortasına bir illuminometre yerleştirin ve 60 lux illuminance ayarlayın.
  6. Sprey zemin ve duvarlar açık alan kutusunun% 70 etanol ile ve temiz bir kağıt havlu ile olası koku ipuçları kaldırmak için aşağı silin. Sonra kalan alkol tamamen kuruyana kadar en az 1 dakika bekleyin.
  7. Açık alan testi yaparak her farenin lokomotor aktivitesini değerlendirin.
    1. Her deneysel farenin davranışını kaydetmek ve izlemek için hayvan davranışı video izleme yazılımını kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Video izleme yazılımı açıldıktan sonra, açık alan kutusunun boyutunu kalibre edin. Ardından, izleme için bölgeyi ayarlayın. Bir deneycinin ellerini izlememek için 3 s gecikme süresi ve 15 dakika satın alma süresi ayarlayın. Her deneysel fare (grup, cinsiyet, yaş, vb) hakkında bilgi ekleyin.
    3. Daha sonra, duvara bakan açık alan kutusuna deneysel bir fareyi nazikçe yerleştirin. Taşıma ile ilişkili stres ve anksiyete en aza indirmek için kafes kapağı üzerine yerleştirerek bunu yapın. Daha sonra, fareyi, nesnelerin alışma oturumu sırasında (adım 1.9.3.) olacağı yerden en uzak olan açık alan kutusunun duvarına yakın bırakın.
      NOT: Fare açık alan kutusuna girdiğinde, fare izleme yazılımı otomatik olarak algılar ve kaydetmeye başlar. Keşif en iyi izleme için, kamera doğrudan açık alan kutusunun üzerine yerleştirilebilir.
    4. 15 dk kayıttan sonra, hayvanı kafes kapağına koyarak kafesine geri döndürün. Açık alan kutusunu %70 etanol spreyi ile temizleyin ve denemeler arasında temiz bir kağıt havlu yla silin. Parlak ışığı geri yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre video izleme yazılımı kullanarak hayvanın toplam mesafesini ölçün.
      1. Video izleme yazılımını ve video klipleri açın. Ardından, Analysis açık alan kutusu boyutunun kalibrasyonuna bağlı olarak taşınan toplam mesafeyi hesaplamak için Çözümle'yi tıklatın.
  8. 2. gün ve 3.
  9. 4. günde, alışım oturumunu (F1) gerçekleştirin.
    1. Loş ışıkta, her fareyi boş açık alana 3 dakika yerleştirin. Bu kısa bir yeniden yaşama sonra, ev kafesi için hayvan dönün.
    2. Alışma sırasında, iyice% 70 etanol ile nesneleri temizleyin ve bir kağıt havlu ile silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dakika bekleyin.
    3. Bitişik duvarlardan 5 cm uzakta, açık alan arenasına iki özdeş nesneyi (kauçuk bebekler, A nesnesi) yerleştirin. Nesneleri çift taraflı bantla düzeltin. Deneysel fareyi nesnelerden en uzak duvara bakacak şekilde açık alan kutusuna tanıtın.
    4. 20 dakika boyunca ücretsiz keşif izni verin ve iki kronometre kullanarak her iki nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı manuel olarak ölçün. Fare her iki nesne için minimum arama süresine (30 s) ulaştığında, F1 oturumunu durdurun ve hayvanı kafesine aktarın. Fare nesneleri 20 dakika içinde 30 s'lik bir alanda keşfe çıkamazsa, fareyi açık alan kutusundan çıkarın ve başka oturumlardan hariç tasla.
    5. Hayvan açık alan kutusundan çıkarıldıktan sonra, iyice% 70 etanol sprey ile kutunun zemin ve duvarları temizleyin ve bir kağıt havlu ile silin.
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
  10. 5. günde, NL test oturumunu gerçekleştirin.
    1. Fareyi kendi kafesinden 3 dakika boyunca yeniden yaşamak için açık alan alanına aktarın. Sonra hayvanı kafesine geri getir.
    2. Alışma sırasında, iyice% 70 etanol ile nesneleri temizleyin ve bir kağıt havlu ile silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dakika bekleyin.
    3. Bitişik duvarlardan 5 cm uzakta, bir nesneyi (kauçuk bebek, A nesnesi) diyagonal konuma taşıyın. Nesneyi çift taraflı bantla düzeltin. Kafes kapağındaki deneysel fareyi açık alan alanına aktarın ve açık alan kutusunun duvarına yerleştirin.
      NOT: Belirli bir yöne yönelik olası doğuştan gelen tercihi azaltmak için taşınan nesnenin konumunu dengeleme. Örneğin, tercih edilen nesnenin konumunu deney hayvanlarının yarısı için tanımlama oturumundan değiştirin ve hayvanların geri kalanı için daha az tercih edilen nesneyi tanıma oturumundan taşıyın.
    4. Bir video izleme sistemi ile ücretsiz keşif ve kayıt 10 dakika izin verin. Her nesneyi iki kronometre kullanarak keşfetmek için harcanan zamanı ölçün ve ayrımcılık oranını
      figure-protocol-5832
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
    5. Deneysel farenin kuyruğunu yakalayın ve ev kafesine aktarmak için kafes kapağına yerleştirin. 3 gün boyunca (gün 6-8), fare yiyecek ve su ücretsiz erişim ile dinlenme sağlar.
    6. Hayvan açık alan kutusundan çıkarıldıktan sonra, iyice% 70 etanol sprey ile kutunun zemin ve duvarları temizleyin ve bir kağıt havlu ile aşağı silin.

2. Yeni nesne tanıma testi (NO)

  1. 9. günde, 1.2-1.7 adımlarını tekrarlayarak 15 dk'lık bir alışma seansı gerçekleştirin.
  2. 10. günde, alışım oturumunu (F1) gerçekleştirin.
    1. Loş ışıkta fareyi boş açık alana 3 dakika yerleştirin. Fareyi açık alan alanına yeniden habituating sonra, geçici olarak ev kafesine geri dönün.
    2. Alışma sırasında, iyice% 70 etanol ile nesneleri temizleyin ve bir kağıt havlu ile silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dk bekleyin.
    3. Bitişik duvarlardan 5 cm uzaktaki açık alana iki özdeş nesne (40 mL su, B nesnesi ile doldurulmuş 50 mL plastik boru) yerleştirin. Nesneleri çift taraflı bantla düzeltin. Deneysel fareyi nesnelerden en uzak duvara bakan açık alan kutusuna tanıtı.
    4. Hayvan, NO testinde iki farklı nesneye (40 mL su, B nesnesi; cam Coplin kavanozu, C nesnesi ile doldurulmuş 50 mL plastik tüp) maruz kaldığında, F1 seansı sırasında nesneyi dengeleyin. Örneğin, gruptaki hayvanların yarısı için iki özdeş nesne (cam Coplin kavanozları, C nesnesi) bulunur.
    5. 20 dakika boyunca ücretsiz keşif izni verin ve iki kronometre kullanarak her iki nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı manuel olarak ölçün. Fare her iki nesne için minimum arama süresine (30 s) ulaştığında, F1 oturumunu durdurun ve hayvanı kafesine aktarın. Fare nesneleri 20 dakika içinde 30 s'lik bir alanda keşfe çıkamazsa, açık alan kutusundan çıkarın ve başka oturumlardan hariç taslanın.
    6. Hayvan açık alan kutusundan çıkarıldıktan sonra, iyice% 70 etanol sprey ile kutunun zemin ve duvarları temizleyin ve bir kağıt havlu ile silin.
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
  3. Ertesi gün (11. gün) NO test oturumunu gerçekleştirin.
    1. Fareyi 3 dakika boyunca yeniden yaşamak için ev kafesinden açık alana aktarın ve hayvanı ev kafesine geri döndürün.
    2. Alışma sırasında, iyice% 70 etanol ile nesneleri temizleyin ve bir kağıt havlu ile silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dakika bekleyin.
    3. Bir nesneyi (40 mL su ile doldurulmuş 50 mL plastik tüp, B nesnesi) bitişik duvarlardan 5 cm uzakta başka bir nesneyle (cam Coplin kavanozu, C nesnesi) değiştirin. Nesneleri çift taraflı bantla düzeltin. Kafes kapağındaki deneysel fareyi açık alana aktarın ve duvara doğru yerleştirin. NO testi sırasında birlikte sunulan nesneleri dengeleyin. Örneğin, bir cam Coplin kavanozunu (C nesnesi) iki cam Coplin kavanozuna (C nesnesi) maruz kalan fareler için 40 mL su (B nesnesi) ile dolu 50 mL plastik bir tüple değiştirin.
      NOT: Değiştirilen nesnenin konumunu dengeleme, belirli bir yöne yönelik potansiyel doğuştan gelen tercihini azaltmak için de gerçekleştirilebilir. Örneğin, iki nesne kümesine (B veya nesne C) maruz kalan hayvanların her kohort için, deney hayvanlarının yarısı için tanıma oturumunda tercih edilen nesneyi değiştirin ve hayvanların geri kalanı için, tanıma oturumunda daha az tercih edilen nesneyi değiştirin.
    4. Ücretsiz keşif 10 dakika izin verin ve bir video izleme sistemi kullanarak kaydedin. İki kronometre kullanarak her nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı ölçün ve ayrımcılık oranını hesaplayın.
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
    5. Deneysel farenin kuyruğunu yakalayın ve ev kafesine aktarmak için kafes kapağına yerleştirin. 3 gün boyunca (gün 12-14), fare yiyecek ve su ücretsiz erişim ile dinlenme sağlar.
    6. Hayvan açık alan kutusundan çıkarıldıktan sonra, %70 etanol spreyi ile açık alan kutusunun zeminini ve duvarlarını iyice temizleyin ve kağıt havluyla silin.

3. Desen ayırma testi (PS)

  1. 15. günde, PS testi için ilk alışma oturumunu (F1) gerçekleştirin.
    1. Fareyi 3 dakika boyunca yeniden yaşamak için ev kafesinden açık alan alanına aktarın ve ardından ev kafesine geri döndürün.
    2. Alışma sırasında, nesneleri ve ızgaralı zemin plakasını %70 etanol ile iyice temizleyin ve kağıt havlu yla silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dakika bekleyin.
    3. Taban plakasını (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) geniş ızgaralı (5,5 x 5,5 cm) açık alan kutusuna yerleştirin ve bitişik duvarlardan 5 cm uzaktaki açık alana 5cm uzaklıkta ki açık alana iki özdeş nesneyi (50 mL su ile doldurulmuş plastik T-şişeler, D nesnesi) yerleştirin. Nesneleri çift taraflı bantla düzeltin. Deneysel fareyi nesnelerden en uzak duvara bakan açık alan kutusuna tanıtı.
    4. Hayvan, PS testinde iki farklı nesneye (50 mL su, D nesnesi; cam şişe, nesne E) doldurulmuş plastik T-şişesine maruz kaldığında, F1 ve F2 seansları sırasında nesneyi dengeler. Örneğin, gruptaki hayvanların yarısı için geniş ızgara zemininde iki özdeş nesne (cam şişeler, Nesne E) bulunur.
    5. 20 dakika boyunca ücretsiz keşif lere izin verin ve iki kronometre kullanarak her iki nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı el ile ölçün. Fare her iki nesne için minimum arama süresi toplamına (30 s) ulaştığında, F1 oturumunu durdurun ve hayvanı kafesine aktarın. Fare nesneleri 20 dakika içinde 30 s'lik bir alanda keşfe çıkamazsa, açık alan kutusundan çıkarın ve başka oturumlardan hariç taslanın.
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
    6. İlk alışım seansını (F1) tamamladıktan sonra, nesneleri ve zemin plakasını %70 etanol spreyi ile iyice temizleyin ve açık alan kutusundan çıkarın.
  2. Ertesi gün (16. gün) PS testi için ikinci alışma oturumunu (F2) gerçekleştirin.
    1. Fareyi 3 dakika boyunca yeniden yaşamak için ev kafesinden açık alan alanına aktarın ve hayvanı ev kafesine geri döndürün.
    2. Alışma sırasında, nesneleri ve ızgaralı zemin plakasını %70 etanol ile iyice temizleyin ve kağıt havlu yla silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dakika bekleyin.
    3. Taban plakasını (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) dar ızgaralı (2,75 x 2,75 cm) açık alan kutusuna yerleştirin ve bitişik duvarlardan 5 cm uzaktaki açık alana iki özdeş nesne (cam şişe, nesne E) yerleştirin. Nesneleri çift taraflı bantla düzeltin. Deneysel fareyi nesnelerden en uzak duvara bakan açık alan kutusuna tanıtı.
    4. Dengeleme için, dar ızgara zemininde iki özdeş nesne (50 mL su ile doldurulmuş plastik T-şişeler, D nesnesi) bulundurun.
    5. 20 dakika boyunca ücretsiz keşif izni verin ve iki kronometre kullanarak her iki nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı manuel olarak ölçün. Fare her iki nesne için minimum arama süresi toplamına (30 s) ulaştığında, F2 oturumunu durdurun ve hayvanı kafesine aktarın. Fare nesneleri 20 dakika içinde 30 s'lik bir alanda keşfe çıkamazsa, açık alan kutusundan çıkarın ve başka oturumlardan hariç taslanın.
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
    6. İkinci alışım oturumu (F2) tamamlandıktan sonra, nesneleri ve zemin plakasını %70 etanol spreyi ile iyice temizleyin ve açık alan kutusundan çıkarın.
  3. Ertesi gün (17. gün) PS test oturumunu gerçekleştirin.
    1. Fareyi 3 dakika boyunca yeniden yaşamak için ev kafesinden açık alan alanına aktarın ve ardından ev kafesine geri döndürün.
    2. Alışma sırasında, nesneleri ve ızgaralı zemin plakasını %70 etanol ile iyice temizleyin ve kağıt havlu yla silin. Kalan alkolün tamamen kuruması için en az 1 dakika bekleyin.
    3. Dar ızgaralı zemin plakasını açık alan kutusuna (2,75 x 2,75 cm) yerleştirin ve bitişik duvarlardan 5 cm uzaklıktaki zemin plakasına iki farklı nesne (50 mL su, d nesnesi; cam şişe, nesne E) ile doldurulmuş iki farklı nesneyi yerleştirin. Nesneleri çift taraflı bantla düzeltin. Kafes kapağındaki deneysel fareyi açık alan alanına aktarın ve duvara doğru yerleştirin.
    4. PS testi sırasında birlikte sunulan nesneleri dengeleyin. Örneğin, e nesnesini bu bağlamda yeni bir nesne yapmak için her nesneyi (D nesnesi, E nesnesi) dar ızgara zeminine yerleştirin. Belirli bir yön için doğuştan gelen bir tercih potansiyelini azaltmak için D nesnesinin veya E nesnesinin (dar zemin desenindeki yeni bir nesne) konumunu dengeleme işlemi de yapılabilir. Örneğin, deney hayvanlarının yarısı için ikinci alıştanca oturumdan tercih edilen nesneyi değiştirin ve hayvanların geri kalanı için ikinci alıştanki oturumdaki daha az tercih edilen nesneyi değiştirin.
    5. Bir video izleme sistemi kullanarak ücretsiz keşif ve kayıt 10 dakika izin verin. İki kronometre kullanarak her nesneyi keşfetmek için harcanan zamanı ölçün ve ayrımcılık oranını hesaplayın.
      NOT: Farenin nesnelere bıyıkları, baldırı veya ön pençeleriyle dokunduğu zamanı ölçün. Hayvanın ekninin nesneye doğru oturma, nesnenin yanından geçme veya nesneyi işaret eden arka ucuyla dinlenme gibi nesneye işaret etmediği davranışları araştırmacı bir zaman olarak ölçün.
    6. Deneysel farenin kuyruğunu yakalayın ve ev kafesine aktarmak için kafes kapağına yerleştirin.

4. Cresyl menekşe boyama

  1. Tüm davranış testlerini tamamladıktan sonra, 110 mL/kg vücut ağırlığı (IP; 1 mL şırınga; 26 G iğne) dozda salinde çözünmüş ketamin (50 mg/mL) ve ksilazin (23.3 mg/mL) bir kokteyl (4:0.5) enjekte ederek hayvan anestezik. Bir parmak sıkışması bir yanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
  2. Hayvan derinden anestezi edildikten sonra, beyni düzeltmek için %4 paraformaldehit ile transkardiyal perfüzyon yapın15.
  3. Transkardiyal perfüzyon bittikten sonra, bir makas15bir çift ile hayvan ın kafasını kesmek . Sonra, beyni ortaya çıkarmak için bir çift iris makas kullanarak kafatasını çıkarın. Beyin izole edildikten sonra, bir gecede %4 paraformaldehit, ardından 0.01 M fosfat tamponlu tuzluda %30 sakarozda kriyokoruma.
  4. Bir kriyostat kullanarak dondurulmuş beyinden koronal kesitler (30 μm) yapın.
  5. Slaytlar üzerinde beyin dokuları monte ve% 100, % 95,% 90, % 80, etanol% 70 sırayla 3 dakika yıkayarak musluk suyu için% 100 etanol hidrasyon adımları bir dizi gerçekleştirin.
  6. 15 dakika boyunca% 0.1 cresyl menekşe çözeltisi doku slaytlar inkübün.
  7. % 95 etanol / 0.1% buzul asetik asit doku slaytlar batırarak aşırı leke kaldırın, ve sonra% 100 etanol,% 50 etanol/ 50% ksilen ve% 100 ksilen çözeltileri ile dokuları dehydrate.
  8. Coverslip doku slaytlar ticari olarak kullanılabilir ksilen montaj ortamı kullanarak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Genel bir deneysel program ve bilişsel fonksiyonun değerlendirilmesi için kurulum Şekil 1'degösterilmiştir. Pilokarinin neden olduğu akut nöbetlerin başlamasından altı hafta sonra, fareler nl, NO ve PS testlerine tabi tutuldu ve bu sırada testler arasında 3 günlük dinlenme süreleri ayrılmıştır(Şekil 1A). NL testi için, tanıma oturumu (F1) sırasında açık alana iki özdeş nesne yerleştirildi ve ertesi gün bir nesne yeni bir konuma ta?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada kronik epilepsisi olan farelerde bilişsel fonksiyonun değerlendirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmaktadır. Farelerde öğrenme ve hafıza fonksiyonlarını değerlendirmek için birçok farklı davranışsal test paradigması kullanılmaktadır18. Morris su labirenti, radyal kol labirenti, Y-labirent, bağlamsal korku klima, ve nesne tabanlı testler en sık kullanılan davranış testleri ve güvenilir sonuçlar sağlar. Bunlar arasında, NL, NO, ve PS testleri epil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Dr. Jae-Min Lee'ye teknik desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kore hükümeti tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibeleri (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml syringeSung-shimUse with the 26 or 30 gauge needle
70% EthanolDuksanUN1170Spray to clean the box and objects
black curtainFor avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violetSigmaC5042For Cresyl violet staining
cryotomeLeicaE21040041For tissue sectioning
double-sided sticky tapeFor the firm placement of the objects
DPX mounting mediumSigma06522
ethanol seriesDuksanUN1170Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometerTES Electrical Electronic Corp.1334AFor the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unitThermocare#W-1
ketamine hydrochlorideYuhan7003Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lampLungoP13A-0422-WW-04Lighting for the behavioral test room
objectsRubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field boxLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towelYuhan-Kimberly47201Use to dry open field box and objects
paraformaldehydeMerck Millipore104005Make 4% solution
pilocarpine hydrochlorideSigmaP6503
rulerUse to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrateSigmaS2250Make 10X stock
Smart system 3.0PanlabVideo tracking system
stopwatchJunsoJS-307For the measurement of explorative activities of mice
sucroseSigmaS9378For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate saltSigmaT2528Make 10X stock
video camera (CCD camera)VisionVCE56HQ-12Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xyleneDuksanUN1307For Cresyl violet staining

Referanslar

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

DavranSay 160yeni nesne konum testiyeni nesne tan ma testidesen ay rma testiuzamsal bellekbilidavran testipilokarpinepilepsifare

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır