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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo presenta procedure sperimentali per valutare i disturbi della memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi patofisiologici del declino cognitivo associato all'epilessia, che è una delle comorbidità più comuni nell'epilessia.

Abstract

La compromissione cognitiva è una delle comorbidità più comuni nell'epilessia del lobo temporale. Per ricapitolare il declino cognitivo associato all'epilessia associata all'epilessia in un modello animale di epilessia, abbiamo generato topi epilettici cronici trattati con pilocarpina. Presentiamo un protocollo per tre diversi test comportamentali utilizzando questi mouse epilettici: nuova posizione dell'oggetto (NL), nuovi test di riconoscimento degli oggetti (NO) e di separazione dei modelli (PS) per valutare rispettivamente l'apprendimento e la memoria per luoghi, oggetti e contesti. Spieghiamo come impostare l'apparato comportamentale e fornire procedure sperimentali per i test NL, NO e PS a seguito di un test sul campo aperto che misura le attività locomotorie basali degli animali. Descriviamo anche i vantaggi tecnici dei test NL, NO e PS rispetto ad altri test comportamentali per la valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici. Infine, discutiamo delle possibili cause e soluzioni per i topi epilettici che non riescono a fare 30 s di buon contatto con gli oggetti durante le sessioni di familiarizzazione, che è un passaggio critico per il successo dei test di memoria. Pertanto, questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come valutare le compromissione di memoria associate all'epilessia utilizzando i topi. I test NL, NO e PS sono semplici, saggi efficienti che sono appropriati per la valutazione di diversi tipi di memoria nei topi epilettici.

Introduzione

L'epilessia è un disturbo cronico caratterizzato da convulsioni ricorrenti spontanee1,2,3. Poiché le crisi ripetitive possono causare anomalie strutturali e funzionali nel cervello1,2,3, un'attività convulsiva anomala può contribuire alla disfunzione cognitiva, che è una delle comorbidità associate all'epilessia più comuni4,5,6. Contrariamente agli eventi convulsioni cronici, che sono transitori e momentanei, i disturbi cognitivi possono persistere durante la vita dei pazienti epilettici, deteriorando la loro qualità di vita. Pertanto, è importante comprendere i meccanismi patofisiologici del declino cognitivo associato all'epilessia.

Vari modelli animali sperimentali di epilessia sono stati utilizzati per dimostrare i deficit di apprendimento e memoria associati all'epilessia cronica7,8,9,,10,11,12. Ad esempio, il labirinto d'acqua Morris, il condizionamento contestuale della paura, la posizione degli oggetti (NL) e i nuovi test di riconoscimento degli oggetti (NO) sono stati spesso utilizzati per valutare la disfunzione della memoria nell'epilessia del lobo temporale (TLE). Poiché l'ippocampo è una delle regioni primarie in cui il TLE mostra patologia, i test comportamentali che possono valutare la funzione di memoria dipendente dall'ippocampo sono spesso selezionati preferibilmente. Tuttavia, dato che le convulsioni possono indurre neurogenesi ippocampale aberrante e contribuire al declino cognitivo associato all'epilessia10, i paradigmi comportamentali per testare la funzione neuronale neonatale (cioè, la separazione del modello spaziale,PS) 8,13 possono anche fornire informazioni preziose sui meccanismi cellulari delle compromissione della memoria nell'epilessia.

In questo articolo, dimostriamo una batteria di test di memoria, NL, NO, e PS, per topi epilettici. I test sono semplici e facilmente accessibili e non richiedono un sistema sofisticato.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università Cattolica della Corea e sono state eseguite in conformità con i National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications N. 80-23).

1. Test di posizione dell'oggetto nuovo (NL)

  1. Preparare i topi epilettici C57BL/6 o transgenici 4–6 settimane dopo l'iniezione di pilocarpina.
    NOTA: Le crisi acutati sono state indotte dall'iniezione di pilocarpina intraperitoneale (IP), seguendo il protocollo descritto nel nostro precedente rapporto14.
  2. Trasferire i topi epilettici dalla sala di riproduzione alla sala dei comportamenti un giorno prima dell'inizio dei test comportamentali. Lasciare che i topi si abittano per almeno 12 h durante la notte.
  3. Nella sala dei comportamenti, separare i singoli topi in nuove gabbie per alloggiamento singolo. Scrivere le informazioni per ogni animale sulla scheda gabbia e tenere gli animali nelle stesse gabbie durante i test comportamentali. Più gabbie possono essere trasferite simultaneamente utilizzando un carrello.
  4. Il giorno successivo, inizia 3 giorni di sessioni di assuefazione (H1-H3) al mattino presto. Acclimatare gli animali alla luce bassa nelle loro gabbie di casa per almeno 30 min.
  5. Preparare una casella di campo aperta con dimensioni esterne di 44 x 44 x 31 cm e dimensioni interne di dimensioni 43 x 43 x 30,5 cm. Il giorno 1 dell'assuefazione (H1), posizionare un illuminometro al centro della scatola di campo aperto e regolare l'illuminazione a 60 lux.
  6. Spruzzare il pavimento e le pareti della scatola aperta con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta pulito per rimuovere possibili spunti olfattivi. Quindi attendere almeno 1 min fino a quando l'alcol residuo si è asciugato completamente.
  7. Valutare l'attività locomotoria di ogni mouse eseguendo un test sul campo aperto.
    1. Per registrare e monitorare il comportamento di ogni mouse sperimentale, utilizzare il software di monitoraggio video del comportamento animale (vedere Tabella dei materiali).
    2. Una volta aperto il software di tracciamento video, calibrare le dimensioni della scatola del campo aperto. Quindi, impostare la zona per il rilevamento. Imposta 3 s di latenza e 15 min di tempo di acquisizione per evitare di tracciare le mani di uno sperimentatore. Inserire le informazioni su ogni topo sperimentale (gruppo, sesso, età, ecc.).
    3. Quindi, posizionare delicatamente un mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete. Fare questo posizionandolo sul coperchio della gabbia per ridurre al minimo lo stress e l'ansia associati alla movimentazione. Quindi, rilasciare il mouse vicino al muro della casella di campo aperto che è il più lontano da dove gli oggetti saranno durante la sessione di familiarizzazione (passaggio 1.9.3.).
      NOTA: Una volta che il mouse è nella casella del campo aperto, il software di monitoraggio del mouse lo rileverà automaticamente e avvierà la registrazione. Per un tracciamento ottimale dell'esplorazione, la telecamera può essere posizionata direttamente sopra la casella di campo aperta.
    4. Dopo 15 min di registrazione, riportare l'animale nella sua gabbia di casa posizionandolo sul coperchio della gabbia. Pulire la scatola a campo aperto con 70% spray etanolo e pulire con un tovagliolo di carta pulito tra una prova e l'altra. Ripristinare la luce intensa e misurare la distanza totale dell'animale spostato utilizzando il software di monitoraggio video secondo le istruzioni del produttore.
      1. Aprire il software di tracciamento video e le clip video. Quindi, fare clic su Analisi per calcolare la distanza totale spostata in base alla calibrazione delle dimensioni della casella del campo aperto.
  8. Il giorno 2 e il giorno 3, eseguire le sessioni di assuefazione (H2, H3) ripetendo i passaggi da 1.3 a 1.7.
  9. Il giorno 4, eseguire la sessione di familiarizzazione (F1).
    1. Nella luce fioca, posizionare ogni mouse nel campo aperto vuoto per 3 min. Dopo quella breve riavversione, riporta l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare due oggetti identici (bambole di gomma, oggetto A) nell'arena campo aperto 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperto, di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione di F1 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuovere il mouse dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
    5. Dopo che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola con 70% spray etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
  10. Il giorno 5, eseguire la sessione di test NL.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area aperta del campo per una riassenza di 3 min. Quindi riportare l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Sposta un oggetto (bambola di gomma, oggetto A) nella posizione diagonale, a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare l'oggetto con nastro a doppio lato. Trasferire il mouse sperimentale sul coperchio della gabbia nell'area aperta del campo e posizionarlo di fronte alla parete della scatola aperta.
      NOTA: controbilanciare la posizione dell'oggetto spostato per ridurre qualsiasi potenziale preferenza innata per una determinata direzione. Ad esempio, modificare la posizione dell'oggetto preferito dalla sessione di familiarizzazione per metà degli animali sperimentali e, per il resto degli animali, spostare l'oggetto meno preferito dalla sessione di familiarizzazione.
    4. Consenti 10 min di esplorazione gratuita e registra con un sistema di tracciamento video. Misurare il tempo impiegato per esplorare ogni oggetto utilizzando due cronometri e calcolare il rapporto di discriminazione come
      figure-protocol-7176
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    5. Afferrare la coda del topo sperimentale e posizionarlo sul coperchio della gabbia per il trasferimento alla sua gabbia di casa. Per 3 giorni (giorni 6-8), lasciate riposare il mouse con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
    6. Una volta che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola con 70% spray etanolo e pulire con un tovagliolo di carta.

2. Nuovo test di riconoscimento degli oggetti (NO)

  1. Il giorno 9, eseguire una sessione di assuefazione di 15 min ripetendo i passaggi da 1,2 a 1,7.
  2. Il giorno 10, eseguire la sessione di familiarizzazione (F1).
    1. Nella luce fioca, posizionare il mouse nel campo aperto vuoto per 3 min. Dopo aver abituato il mouse all'area aperta del campo, riportarlo temporaneamente nella sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo ad asciugare completamente.
    3. Collocare due oggetti identici (50 mL di tubi di plastica riempiti con 40 mL d'acqua, oggetto B) nel campo aperto a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Poiché l'animale è esposto ai due oggetti diversi (tubo di plastica da 50 mL riempito con 40 mL d'acqua, oggetto B; vaso di vetro Coplin, oggetto C) nel test NO, controbilancia l'oggetto durante la sessione di F1. Ad esempio, presentare due oggetti identici (barattoli di vetro Coplin, oggetto C) per la metà degli animali del gruppo.
    5. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione di F1 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuoverlo dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
    6. Dopo che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola con 70% spray etanolo e pulirli con un tovagliolo di carta.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
  3. Il giorno successivo (giorno 11), eseguire la sessione di test NO.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa al campo aperto per una riabitoriera per 3 min, e quindi riportare l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Sostituire un oggetto (50 mL di plastica riempito con 40 mL di acqua, oggetto B) con un altro oggetto (vaso di vetro Coplin, oggetto C) a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Trasferire il mouse sperimentale sul coperchio della gabbia sul campo aperto e posizionarlo di fronte alla parete. Controbilanciare gli oggetti presentati insieme durante il test NO. Ad esempio, sostituire un barattolo coplin di vetro (oggetto C) con un tubo di plastica da 50 mL riempito con 40 mL di acqua (oggetto B) per i topi esposti ai due vasi di vetro Coplin (oggetto C) durante la sessione di familiarizzazione.
      NOTA: È anche possibile eseguire il controbilanciamento della posizione dell'oggetto sostituito per ridurre la potenziale preferenza innata per una determinata direzione. Ad esempio, per ogni coorte di animali esposti all'insieme di due oggetti (oggetto B o oggetto C), modificare l'oggetto preferito nella sessione di familiarizzazione per metà degli animali sperimentali e per il resto degli animali sostituire l'oggetto meno preferito nella sessione di familiarizzazione.
    4. Consentire 10 min di esplorazione gratuita e registrarlo utilizzando un sistema di tracciamento video. Misura il tempo impiegato per esplorare ogni oggetto utilizzando due cronometri e calcola il rapporto di discriminazione.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    5. Afferrare la coda del topo sperimentale e posizionarlo sul coperchio della gabbia per il trasferimento alla sua gabbia di casa. Per 3 giorni (giorni 12-14), lasciate riposare il mouse con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
    6. Una volta che l'animale viene rimosso dalla scatola aperta, pulire accuratamente il pavimento e le pareti della scatola di campo aperto con 70% spray etanolo e pulire con un tovagliolo di carta.

3. Test di separazione dei motivi (PS)

  1. Il giorno 15, eseguire la prima sessione di familiarizzazione (F1) per il test PS.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area di campo aperto per la riassuetazione per 3 min, e poi restituirlo alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare la piastra del pavimento (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con l'ampia griglia (5,5 x 5,5 cm) nella scatola di campo aperta e posizionare due oggetti identici (t-flasks in plastica riempiti con 50 mL di acqua, oggetto D) nel campo aperto a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Poiché l'animale è esposto a due oggetti diversi (t-flask in plastica riempito con 50 mL di acqua, oggetto D; bottiglia di vetro, oggetto E) nel test PS, controbilancia l'oggetto durante le sessioni F1 e F2. Ad esempio, presentare due oggetti identici (bottiglie di vetro, oggetto E) sul pavimento a griglia larga per metà degli animali del gruppo.
    5. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso nell'esplorazione di entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione totale (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione di F1 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuoverlo dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    6. Dopo il completamento della prima sessione di familiarizzazione (F1), pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con 70% spray etanolo e rimuoverli dalla scatola aperta campo.
  2. Il giorno successivo (giorno 16), eseguire la seconda sessione di familiarizzazione (F2) per il test PS.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area di campo aperto per la riassuetazione per 3 min, e quindi riportare l'animale alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con la piastra del pavimento con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare la piastra del pavimento (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con la griglia stretta (2,75 x 2,75 cm) nella scatola del campo aperto e posizionare due oggetti identici (bottiglie di vetro, oggetto E) nel campo aperto a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperta di fronte alla parete più lontana dagli oggetti.
    4. Per controbilanciare, presentare due oggetti identici (t-flasks in plastica riempiti con 50 mL di acqua, oggetto D) sul pavimento griglia stretto.
    5. Consenti l'esplorazione gratuita per 20 min e misura manualmente il tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il topo raggiunge il tempo minimo di esplorazione totale (30 s) per entrambi gli oggetti, fermare la sessione F2 e trasferire l'animale alla sua gabbia di casa. Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 s entro 20 min, rimuoverlo dalla casella del campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    6. Dopo il completamento della seconda sessione di familiarizzazione (F2), pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con 70% spray etanolo e rimuoverli dalla scatola aperta campo.
  3. Il giorno successivo (giorno 17), eseguire la sessione di test PS.
    1. Trasferire il mouse dalla sua gabbia di casa all'area di campo aperto per la riassuetazione per 3 min, e poi restituirlo alla sua gabbia di casa.
    2. Durante l'assuefazione, pulire accuratamente gli oggetti e la piastra del pavimento con la piastra del pavimento con il 70% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta. Attendere almeno 1 min per l'alcol residuo per asciugare completamente.
    3. Posizionare la piastra con la griglia stretta (2,75 x 2,75 cm) nella scatola di campo aperta e posizionare due oggetti diversi (t-flask di plastica riempito con 50 mL di acqua, oggetto D; bottiglia di vetro, oggetto E) sulla piastra del pavimento a 5 cm di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppio lato. Trasferire il mouse sperimentale sul coperchio della gabbia nell'area aperta del campo e posizionarlo di fronte alla parete.
    4. Controbilanciare gli oggetti presentati insieme durante il test PS. Ad esempio, posizionare ogni oggetto (oggetto D, oggetto E) sul pavimento della griglia stretto per rendere l'oggetto E un oggetto nuovo in questo contesto. Controbilanciare la posizione dell'oggetto D o dell'oggetto E (un nuovo oggetto sul modello a pavimento stretto) può anche essere eseguito per ridurre il potenziale di una preferenza innata per una certa direzione. Ad esempio, sostituire l'oggetto preferito dalla seconda sessione di familiarizzazione per metà degli animali sperimentali e per il resto degli animali, sostituire l'oggetto meno preferito dalla seconda sessione di familiarizzazione.
    5. Consentire 10 min di esplorazione gratuita e registrare utilizzando un sistema di tracciamento video. Misura il tempo impiegato per esplorare ogni oggetto utilizzando due cronometri e calcola il rapporto di discriminazione.
      NOTA: Misurare il momento in cui il mouse tocca gli oggetti con i baffi, il muso o le zampe anteriori. Non quantificare come tempo esplorativa i comportamenti in cui il muso dell'animale non punta verso l'oggetto, ad esempio seduto sull'oggetto, passando per l'oggetto o appoggiato con l'estremità posteriore rivolta verso l'oggetto.
    6. Afferrare la coda del topo sperimentale e posizionarlo sul coperchio della gabbia per il trasferimento alla sua gabbia di casa.

4. Colorazione viola Cresyl

  1. Dopo aver completato tutti i test comportamentali, anestesizzare l'animale iniettando un cocktail (4:0.5) di ketamina (50 mg/mL) e xylazina (23,3 mg/mL) sciolta in salina a una dose di 110 mL/kg di peso corporeo (IP; 1 mL di siringa). Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di una risposta a un pizzico di punta.
  2. Una volta che l'animale è profondamente anetizzato, eseguire perfusione transcardiale con 4% paraformaldeide per fissare il cervello15.
  3. Dopo che la perfusione transcardiale è terminata, decapitare l'animale con un paio di forbici15. Quindi, rimuovere il cranio utilizzando un paio di forbici iride per esporre il cervello. Dopo che il cervello è isolato, suffisso in 4% paraformaldeide durante la notte, seguito da crioprotezione nel 30% di saccarosio in 0,01 M di salina tampone di fosfato.
  4. Fare sezioni coronali (30 m) dal cervello snap-congelato utilizzando un criostato.
  5. Montare i tessuti cerebrali sui vetrini ed eseguire una serie di passaggi di idratazione dal 100% di etanolo all'acqua del rubinetto lavando per 3 min in sequenza nel 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanolo.
  6. Incubare i vetrini di tessuto in soluzione di callina cresila 0.1% per 15 min.
  7. Rimuovere la colorazione eccessiva immergendo i vetrini dei tessuti nel 95% di etanolo/0,1% di acido acetico glaciale, quindi disidratare i tessuti con soluzioni di 100% etanolo, 50% di etanolo/50% xilene e 100% xilene.
  8. Coverslip i vetrini del tessuto utilizzando un supporto di montaggio xilene disponibile in commercio.

Risultati

Nella figura 1è illustrato un programma sperimentale generale e la configurazione per la valutazione della funzione cognitiva. Sei settimane dopo l'introduzione di crisi acute indotta da pilocarpina, i topi sono stati sottoposti ai test NL, NO e PS in ordine separato da periodi di riposo di 3 giorni tra i test (Figura 1A). Per il test NL, due oggetti identici sono stati inseriti nel campo aperto durante la sessione di familiarizzazione (F1) e il giorno successi...

Discussione

Questo lavoro descrive le procedure sperimentali per valutare la funzione cognitiva nei topi con epilessia cronica. Molti diversi paradigmi di test comportamentali vengono utilizzati per valutare le funzioni di apprendimento e memoria nei topi18. Il labirinto dell'acqua Morris, il labirinto del braccio radiale, il labirinto Y, il condizionamento contestuale della paura e i test basati su oggetti sono i test comportamentali più utilizzati e forniscono risultati affidabili. Tra questi, i test NL, N...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo il dottor Jae-Min Lee per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A0000167).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml syringeSung-shimUse with the 26 or 30 gauge needle
70% EthanolDuksanUN1170Spray to clean the box and objects
black curtainFor avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violetSigmaC5042For Cresyl violet staining
cryotomeLeicaE21040041For tissue sectioning
double-sided sticky tapeFor the firm placement of the objects
DPX mounting mediumSigma06522
ethanol seriesDuksanUN1170Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometerTES Electrical Electronic Corp.1334AFor the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unitThermocare#W-1
ketamine hydrochlorideYuhan7003Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lampLungoP13A-0422-WW-04Lighting for the behavioral test room
objectsRubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field boxLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towelYuhan-Kimberly47201Use to dry open field box and objects
paraformaldehydeMerck Millipore104005Make 4% solution
pilocarpine hydrochlorideSigmaP6503
rulerUse to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrateSigmaS2250Make 10X stock
Smart system 3.0PanlabVideo tracking system
stopwatchJunsoJS-307For the measurement of explorative activities of mice
sucroseSigmaS9378For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate saltSigmaT2528Make 10X stock
video camera (CCD camera)VisionVCE56HQ-12Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xyleneDuksanUN1307For Cresyl violet staining

Riferimenti

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
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