JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.

Abstract

وتورط الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في بدء الورم، والتنمية وتكرار بعد العلاج، وأصبحت مركز اهتمام العديد من الدراسات في العقود الماضية. ولذلك، من المهم تطوير أساليب للتحقيق في دور الجينات الرئيسية المشاركة في الخلايا السرطانية الجذعية. سرطان المعدة (GC) هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعاً وفانياً. ويعتقد أن الخلايا الجذعية سرطان المعدة (GCSCs) لتكون جذر الانتكاس سرطان المعدة, الانبثاث ومقاومة المخدرات. هناك حاجة إلى فهم علم الأحياء GCSS لدفع تطوير العلاجات المستهدفة وفي نهاية المطاف للحد من الوفيات بين المرضى. في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.

Introduction

سرطان المعدة (GC) هو واحد من أكثر أنواع السرطانات شيوعاً وفانياً1. على الرغم من التقدم في الجراحة المشتركة, العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي في العلاج GC, التكهن لا يزال ضعيفا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لا يزال منخفضا جدا2. تكرار و الانبثاث هي الأسباب الرئيسية التي تسبب وفيات ما بعد العلاج.

الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية التي تمتلك القدرة على تجديد الذات وتوليد أنساب الخلايا المختلفة التي تعيد تشكيل الورم3. ويعتقد أن CSCs مسؤولة عن الانتكاس السرطان والنقائل بسبب قدراتها على تجديد الذات وبذر الأورام الجديدة، فضلا عن مقاومتها للعلاج الكيميائي التقليدي- والعلاجات الإشعاعية4. ولذلك، فإن استهداف مراكز خدمات الصحة وتكميل الأطفال والقضاء على الإيدز يوفران إمكانات مثيرة لتحسين العلاج والحد من وفيات مرضى السرطان.

وقد تم عزل CSCs من أنواع كثيرة من الأورام الصلبة5. في عام 2009، تم وصف الخلايا الجذعية سرطان المعدة (GCSCs) معزولة عن خطوط خلايا سرطان المعدة البشرية أصلا من قبل Takaishi وآخرون6. شين وزملاؤه أول تحديد ونقاء GCSCs من الغدة الغدة في المعدة البشرية (GAC) أنسجة الورم7. هذه النتائج لا توفر فرصة لدراسة علم الأحياء GCSS فحسب ، بل توفر أيضًا أهمية سريرية كبيرة.

ومن الخصائص الخاصة لCsSCs قدرتها على تشكيل المجال8. يتم وضع مطلي في الخلايا الفردية في ظروف غير مُضَمَّة بكثافة منخفضة، والخلايا التي تمتلكها ذاتية التجديد هي وحدها التي يمكن أن تنمو لتصبح كتلة صلبة كروية تسمى كرة. وهكذا، فإن تحليل تكوين المجال قد اعتبر معيار الذهب والتقييس وتستخدم على نطاق واسع لتقييم الخلايا الجذعية إمكانية التجديد الذاتي في المختبر.

تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو أداة بحثية قوية لدراسة وظيفة الجينات من قبل الضربة القاضية من جين محدد9. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيات الجينية المستقرة على المدى الطويل لها بعض القيود ، مثل التحدي المتمثل في استكشاف وظيفة الجين الضروري لبقاء الخلية. يمكن أن تكون أنظمة RNAi الشرطية مفيدة في التنطي السفلي للجينات المرغوبة بطريقة زمنية و/أو خاصة خاضعة للرقابة من خلال إدارة عامل محفز. وtratecline (التيت)-نظم غير قابلة للانطلاق هي واحدة من أنظمة RNAi الشرطية الأكثر استخداما على نطاق واسع10. يمكن للأنظمة التيت غير القابلة للحث على إسكات الجينات المستهدفة من خلال التحكم في التعبير عن shRNA عند إضافة محفز خارجي (دوكسيسيكلين بشكل تفضيلي ، Dox). يمكن تقسيم أنظمة Tet-inducible إلى نوعين: أنظمة Tet-On أو Tet-Off. يمكن تشغيل التعبير عن shRNA (Tet-On) أو إيقاف تشغيله (Tet-Off) في وجود المستحث. في نظام Tet-ON بدون مستحث، يرتبط مكابر Tet (Tet) (Tet) المعبّر عنه بشكل مكوّن بسلسلة عناصر تيت مستجيبة (TRE) التي تحتوي على مروج معتمد على Pol III مستجيب للتيت للتعبير عن SHRNA، وبالتالي قمع التعبير عن shRNA. في حين أن على إضافة دوكس، يتم عزل TetR بعيدا عن المروج التي تستجيب Tet Pol III. وهذا يسهل التعبير عن shRNA ويؤدي إلى ضربة قاضية الجينات.

البروتوكول الموصوف هنا يستخدم نظام شرنا التتراسيكلين الوظيفية غير القابلة للتكريس ومقايسة تكوين المجال المتكيف لدراسة وظيفة التكتل في GCSCs المشتقة من المريض.11 نستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة آثار التكتل في التجديد الذاتي GCSCs. هذه المنهجية تنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا الجذعية السرطانية.

Protocol

وقد وافقت جميع التجارب باستخدام الخلايا الجذعية السرطان المعدية المستمدة من المريض المذكورة هنا من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية7.

1. سرطان المعدة زراعة الخلايا الجذعية

  1. إعداد GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة
    1. إعداد GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة عن طريق إضافة الطازجة DME / F12 المتوسطة مع المكونات الأساسية التالية: 20 نانوغرام / مل EGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 1٪ الأنسولين / Transferrin / الصوديوم سيلينيت، 0.2٪ الجلوكوز، 0.5٪ B27، 1٪ الجلوتاماكس، 1٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية، 10 ميكرومتر 2-mercaptoethanol، 0.75 ملغ/ مل NaHCO3،10 ميكرومتر thioglycerol، 100 وحدة دولية/ مل بينسيلين و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين. تصفية وتعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: يوصى بـ GCSC كامل الثقافة المتوسطة تخزين يفضل أن لا يزيد عن أسبوعين في 4 درجة مئوية.
  2. استعادة GCSCs والثقافة
    ملاحظة: تم الحصول على GCSCs على النحو التالي: تعرضت عينات الورم للتفكك الميكانيكي والإنزيمي. تم الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التصفية مع شبكة النايلون من التعليق المتناثرة بشكل جيد. تم استزراع الخلايا السرطانية الناتجة في GCSCs كاملة الثقافة المتوسطة، ونمت بعض الخلايا لتشكيل المجالات. ثم تعرضت هذه المجالات للانفصام الأنزيمي، ويمكن الحصول على شهادة الثانوية العامة عن طريق الفرز الخلوي لزنزانات الخلايا الملطخة بعلامات CD44/CD54. وقد تم الإبلاغ عن البروتوكول التفصيلي والتشهين الوظيفي لـ GCSCs7.
    1. قبل دافئ GCSC إكمال ثقافة متوسطة في 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
    2. إزالة الجليد GCSC من تخزين النيتروجين السائل وذوبان اكوام البحر بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. الحفاظ على دوامة قارورة حتى يذوب المحتوى بأكمله تماما.
      ملاحظة: ذوبان الخلايا المجمدة بسرعة (<1 دقيقة) في حمام مائي 37 °C.
    3. نقل محتويات كامل من cryovials إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 مل تحتوي على 10 مل من GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    4. التعرق بعناية وتعليق بيليه الخلية في 10 مل من GCSCs الطازجة المتوسطة كاملة. لوحة تعليق الخلية في طبق بيتري 100 ملم. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة وإضافة 5 مل من المتوسط الطازج الكامل في اليوم الثالث.
  3. ثقافة فرعية من أورام GCSCs
    ملاحظة: GCSCs من مركز أورامpheres فقط لديها ما يكفي من المواد الغذائية قبل حجم المجالات تنمو تصل إلى 80-100 μm في القطر. مرة واحدة في مناطق الانكسار الظلام وانخفاض تظهر (حوالي 6 أيام من الثقافة)، فمن الضروري أن تكون زراعة فرعية في أورام.
    1. يهز الطبق بلطف ونقل استزراع أورام الغلاف العام للأورام الوسيط (المتوسط و الـ أورام غير المنضم) إلى أنبوب طرد مركزي معقمة 15 مل. وبالنسبة للأحجام المتوسطة الأكبر، قد تكون هناك حاجة إلى أنابيب أكبر للطرد المركزي.
    2. جهاز طرد مركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص بعناية من الفائق. بعد الطرد المركزي، ستكون بيليه بيضاء بيضاء مرئية.
    3. إضافة 2 مل من حل تفكك الخلية ل resuspend بيليه للتفكك الميكانيكية والإنزيمية في 37 درجة مئوية. بلطف pipet صعودا وهبوطا 10 مرات كل 2-3 دقيقة في عملية الهضم لكسر مجالات بعيدا حتى يتم تفريق أوراموسفيرس في تعليق خلية واحدة. ويوصى أن تكون عملية الانفصام الكلي هذه أقل من 15 دقيقة.
      ملاحظة: قم بإجراء فحص مرئي تحت المجهر للتأكد من عدم وجود مجالات كبيرة أو مجاميع الخلايا.
    4. إضافة 10 مل من 10 ساخنة 10 10 166 ساخنة جديدة 10 10 g ساخنة GCSCs 10 10 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    5. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا مع 1 مل من جديد قبل تدفئة GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة. بذور عدد مناسب من الخلايا في جديد 100 مم بتري طبق مع 10 مل من الطازجة قبل تدفئة GCSCs الثقافة المتوسطة كاملة واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    6. إعادة تغذية الثقافات أورامفيرس بعد 3 أيام بإضافة 5 مل من الطازجة قبل الدافئة المتوسطة كاملة. بعد 6 أيام، الخلايا مرور عندما تنمو الأورام تصل إلى 80-100 μm في القطر.
  4. الحفظ بالتبريد لـ GCSCs
    ملاحظة: لا cryopreserve خلايا GCSCs عن طريق إضافة متوسطة إلى أوراموسفيرس مباشرة. وينبغي هضم أورام GCSCs في خلايا واحدة بحيث يمكن أن تدخل عامل حماية الخلية كل خلية لضمان التخزين مستقرة على المدى الطويل من الخلايا. تأكد من الخلايا في وضع صحي ودون تلوث.
    1. حصاد GCSCs أورام. جهاز طرد مركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق.
    2. تجاهل supernatant وإضافة 2 مل من حل تفكك الخلية لتفكك الأورام GCSCs في 37 درجة مئوية. إنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 10 مل من GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة.
    3. جهاز طرد مركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق وجمع GCSCs واحد.
    4. تعليق بلطف GCSCs مع المصل خالية من المبرد المتوسط. التركيز النهائي الموصى به هو 5 × 105 - 5 × 106 خلايا / مل.
    5. الاستغناء عن تعليق الخلية في 1 مل aliquots في قارورة المبردة ملحوظ.
    6. ضع على الفور cry التي تحتوي على الخلايا في غرفة ايزوبروبانول وتخزينها في -80 درجة مئوية. نقل قارورة إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي لتخزين على المدى الطويل.

2. توليد خطوط GCSCs غير قابلة للانهيك

تنبيه: تم تعيين فيروسات العدسية المؤتلفة ككائنات من المستوى 2 من قبل المعهد الوطني للصحة ومركز مكافحة الأمراض. ويتطلب العمل الذي يشمل فيروس العدس صيانة مرفق من المستوى 2 للسلامة البيولوجية، بالنظر إلى أن المواد الفيروسية الخارقة التي تنتجها هذه النظم النتوميفيروسية يمكن أن تحتوي على فيروس مأتلف يمكن أن يكون خطرا.

  1. توليد جزيئات فيروس العدس
    1. توليف 2 ناقلات العدسي الفيروسية التي تحمل shRNA غير قابل للتكريس تستهدف التكتل البشري وناقل نقص في فيروسات العدسي غير الموجه (GV307) من GeneChem استناداً إلى تصميم الجدول 1 (يحتوي GV307 vector على: TetIIP-TurboRFP-MCS (MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
    2. البذور 4 × 106 293T العدسي الفيروسية خلايا التعبئة والتغليف في طبق بيتري 100 مم مع 10 مل من DMEM تكملها 10٪ مصل البقرة الجنينية.
    3. احتضان الخلايا 293T بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تأكد من أن كثافة الخلايا 293T حوالي 50-80٪ التقاء يوم من نقل الدم.
    4. جلب متوسطة المصل إلى درجة حرارة الغرفة وانخفاض إعداد أنبوب A وB أنبوب كما هو موضح في الجدول 2.
    5. نقل أنبوب A في أنبوب B، مزيج جيدا، واحتضان المجمعات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعداد مجمعات الدهون والحمض النووي.
    6. إزالة 5 مل من المتوسطة، قبل إضافة مجمع الحمض النووي الدهون، وترك ما مجموعه 5 مل.
    7. إضافة 5 مل من مجمع الدهون والحمض النووي في طبق الثقافة قطرة ودوامة بلطف الطبق لتوزيع المجمع.
      ملاحظة: الاستغناء بعناية السائل ضد جدار الطبق لتجنب مزعج 293T الخلايا.
    8. احتضان طبق الثقافة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    9. بعد 24 ساعة بعد نقل، وإزالة بعناية وسيط transfection واستبدال بلطف مع 10 مل من DMEM قبل الدافئة تكملها مع 10٪ FBS. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: يجب أن تعامل جميع المابير والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
    10. ما يقرب من 48 ساعة بعد transfection، حصاد 10 مل من عظمى التي تحتوي على فيروس العدين.
      ملاحظة: يجب أن تعامل جميع الأوعية ونصائح ثقافة الخلية مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
    11. تصفية عظمى العدسي الفيروسي باستخدام مرشح المسام 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام الخلوي.
      ملاحظة: يجب أن تعامل جميع المرشحات والمحاقن مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
    12. نقل أوضح فائقة لحاوية معقمة، إضافة Concentrator Lenti-X (1/3 حجم من اضح افرنح) لخلطها عن طريق انقلاب لطيف.
    13. احتضان الخليط في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    14. عينات من أجهزة الطرد المركزي عند 1500 x غم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، وبيضاء بيليه ستكون مرئية. إزالة بعناية فائقة، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
      ملاحظة: يجب أن تعامل جميع المابير والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
    15. إعادة بناء بلطف بيليه في 1 مل من DMEM تكمل مع 10٪ FBS كما الأسهم الفيروس، وتخزين في -80 درجة مئوية.
  2. توليد خطوط الخلايا المُصابة بالعدوى المستقرة
    1. البذور 6 × 106 GCSC في طبق بيتري 100 مم مع 10 مل DMEM تكملها 10٪ FBS ل 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 (70-80٪ التقاء قبل العدوى).
    2. اضمّر المتوسطة في الطبق، أضف جزيئات النيدسفيرال المركزة المخففة بـ 4 مل من متوسطة DMEM الكاملة التي تحتوي على كاشف بوليبرين (5 ميكروغرام/مل) في الطبق. احتضان لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: التركيز الأمثل من البوليبرين يعتمد على نوع الخلية، وقد تحتاج إلى أن تكون اختبار في تركيزات مختلفة لتحديد التركيزات الفعالة. وإلا فقد يتم تحديدها تجريبياً، وعادة ما تكون في حدود 2-10 ميكروغرام/مل. يجب أن تعامل جميع الأنابيب والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
    3. تغيير المتوسطة، مع استبدال 10 مل من DMEM مع 10٪ FBS المتوسطة واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: يجب أن تعامل جميع النصائح والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
    4. اضمحلال المكبر مع حطام الخلية، مع استبدال DMEM الطازجة تكمل مع 10٪ FBS المتوسطة التي تحتوي على البوروميسين (2.5 ميكروغرام / مل) واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. ثم استبدال DMEM الطازجة مع 10٪ FBS المتوسطة التي تحتوي على البوسوميسين (5 ميكروغرام / مل) واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 ل 24 ساعة إضافية.
    5. شطف GCSC المتمسك مرتين مع 5 مل من DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
    6. افصل GCSC مع 1 مل من محلول تفكك الخلايا قبل تسخينها واحتضان 2-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. إضافة 5 مل من الطازجة قبل تدفئة GCSCs ثقافة كاملة متوسطة إلى تعليق الخلية.
    8. الاستغناء 3 مل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل (أنبوب A) للتبريد تحفظ الخلايا, وغيرها 3 مل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل (أنبوب B) لحفز من doxycycline.
    9. أنبوب الطرد المركزي A وB أنبوب في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
    10. Resuspend بيليه من أنبوب A مع 1 مل من المصل خالية من المبرد المتوسط، ونقل القارورة إلى -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وإزالتها في تخزين النيتروجين السائل.
    11. التعرق و resuspend خلايا أنبوب B في 1 مل من جديد قبل تدفئة GCSCs الثقافة المتوسطة كاملة. بذور عدد مناسب من الخلايا في جديد 100 ملم بيتري طبق من 10 مل الطازجة قبل تدفئة GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة مع دوكسيسسيكلين (Dox) (2.5 ميكروغرام / مل) واحتضان ل 48 ح في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: قد يختلف التركيز الأمثل لـ Dox بين خطوط الخلايا. وينبغي اختبار كل خط خلية في تركيزات مختلفة دوكس لتحديد التركيزات الفعالة لKD والسمية على الخلايا.
    12. تأكيد القمع المستقر للكسترين في GCSCs عن طريق النشاف الغربية.

3. المجال تشكيل الحسبة

  1. ذوبان خطوط GCSCs غير قابل للذوبان المجمدة (انظر الخطوة 1.2).
  2. تحديد كثافة الخلايا القابلة للتطبيق لعينة 10 ميكرولتر باستخدام عداد الخلايا الآلي.
  3. ضبط مستوى الصوت مع GCSCs قبل الدافئة كاملة ثقافة المتوسطة للحصول على تركيز 2 × 104 خلايا قابلة للحياة / مل.
  4. الاستغناء في 3 جديدة 96-جيدا فائقة منخفضة مرفق لوحة الآبار (0.1 مل / حسنا) كل مجموعة.
  5. احتضان الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. يجب أن يحدث تشكيل المجال في غضون 3-10 أيام. مراقبة وتسجيل التصور من الأورام تشكيل كل 2 أيام.
    ملاحظة: لا ينصح بتغيير الوسيطة في حالة حدوث أي اضطراب في تكوين أورامفير. وينبغي أن تميز هذه الـ"أورام" بسهولة عن الخلايا المفردة والمجمّعة.
  6. تحديد نتائج تكوين أورامفير من خلال تقييم أحجام أورام الفيرات المشكلة باستخدام برامج التصوير.

النتائج

تم زرع الخلايا الجذعية لسرطان المعدة من غدية المعدة البشرية الأولية في وسط الثقافة الخالية من المصل. بعد 6 أيام، توسعت الخلايا من النمط الظاهري الشبيه بالخلايا المفردة(الشكل 1أ)لتشكيل مجالات كبيرة (الشكل 1B).

Discussion

GC هو السبب الرئيسي الثالث للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. GCSCs حاسمة في الانتكاس سرطان المعدة, الانبثاث ومقاومة المخدرات. استخدام GCSCs من مرضى سرطان المعدة سوف تسمح لنا لاستكشاف نقطة ضعفهم وتطوير الأدوية المستهدفة لعلاج مرضى GC.

اختبار تكوين المجال هو وسيلة مفيد...

Disclosures

لم يُعلن عن تضارب المصالح.

Acknowledgements

وقد دعمت هذا العمل من قبل مؤسسة علوم الطبيعة في مقاطعة قوانغدونغ (2018A030310586، 2020A1515010989، مؤسسة البحوث العلمية الطبية لمقاطعة قوانغدونغ (A2019405)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772957)، والعلوم و برنامج التكنولوجيا لمقاطعة قوانغدونغ في الصين (2017B030301016)، ومؤسسة الصناعة وتكنولوجيا المعلومات في شنتشن (20180309100135860).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMilliporeSLGP033RB
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145
2-MercaptoethanolGibco2068586
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3474
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10228
Countess II Automated Cell CounterInvitrogenAMQAX1000
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG6152
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, PyruvateGibco10569044
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, AustraliaGibco10099141
GlutaMAX SupplementGibco35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100XGibco41400045
lentiviral vectorGeneChemGV307
Lenti-X ConcentratorTakara631232
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XGibco11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMilliporeSLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic TubesThermo Scientific5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri DishesThermo Scientific171099
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
Penicillin-Streptomycin, LiquidGibco15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)GeneChempHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)GeneChempHelper 2.0
PolybreneSigma-AldrichH9268
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation MediumZENOAQ11890
StemPro Accutase Cell Dissociation SolutionGibcoA1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5Invitrogen15567027
ZEISS Inverted MicroscopeZEISSAxio Vert.A1

References

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
  3. Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
  4. Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
  5. Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
  6. Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
  7. Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
  8. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  9. Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
  10. Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
  11. Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
  12. Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159stemness

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved