נוק-דאון מותנה משולב ואסא היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד גן הקשורים לגזע של תאי גזע נגזר סרטן הקיבה נגזר

Summary

בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.

Abstract

תאי גזע סרטניים (CSCs) מעורבים חניכה גידול, התפתחות והישנות לאחר הטיפול, והפכו למרכז תשומת הלב של מחקרים רבים בעשורים האחרונים. לכן, חשוב לפתח שיטות לחקור את התפקיד של גנים מרכזיים המעורבים גזע תאים סרטניים. סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר של סרטן. תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) נחשבים השורש של נסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. הבנת ביולוגיה GCSCs נדרש כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים ממוקדים ובסופו של דבר כדי להפחית את התמותה בקרב חולים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.

Introduction

סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר ומוות של סרטן¹. למרות ההתקדמות בניתוח משולב, כימותרפיה והקרנות בטיפול GC, הפרוגנוזה נשארת עניה שיעור ההישרדות של חמש שנים הוא עדיין נמוך מאוד². הישנות וגרורות הן הסיבות העיקריות לגרום למוות שלאחר הטיפול.

תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת קבוצה של תאים סרטניים בעלי היכולת לחדש את עצמו וליצור את תריסות התא השונות לשחזר את הגידול^3. CSCs הם האמינו להיות אחראי על נסיגה סרטן גרורות בשל היכולות שלהם של התחדשות עצמית ותזיטת גידולים חדשים, כמו גם ההתנגדות שלהם כימותרפיה מסורתית- ורדיותרפיות^4. לכן, מיקוד CSCs וחיסול של CSCs לספק פוטנציאל מרגש כדי לשפר את הטיפול ולהפחית את התמותה של חולי סרטן.

CSCs כבר מבודדים מסוגים רבים של גידולים מוצקים⁵. בשנת 2009, תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) מבודדים קווי תאים סרטניים קיבה אנושיים תוארו במקור על ידי Takaishi ואח^'6. חן ועמיתיו זיהו לראשונה ומטוהרים GCSCs מ אדנוקרצינומה קיבה אנושית (GAC) רקמות גידול⁷. ממצאים אלה לא רק מספקים הזדמנות ללמוד ביולוגיה GCSCs, אלא גם לספק חשיבות קלינית רבה.

מאפיין מסוים של CSCs הוא היכולת שלהם ליצור כדור⁸. תאים בודדים מצופה בתנאים לא דביקים בצפיפות נמוכה, ורק התאים בעלי התחדשות עצמית יכולים לגדול לתוך אשכול מוצק וכורי הנקרא כדור. לכן, ההתווייה של היווצרות הכדור נחשבה ל-assay תקן הזהב ונעשה בה שימוש נרחב להערכת פוטנציאל החידוש העצמי של תאי גזע במבחנה.

הפרעות RNA (RNAi) הוא כלי מחקר רב עוצמה כדי ללמוד את תפקוד הגנים על ידי נוק-דאון של גן מסוים⁹. עם זאת, טכנולוגיות נוק-דאון גנים יציבים לטווח ארוך יש מגבלות מסוימות, כגון האתגר של חקר הפונקציה של גן חיוני להישרדות תאים. מערכות RNAi מותנות יכולות להיות שימושיות לרישום של הגנים הרצויים באופן זמני ו/או מבוקר מיוחד על ידי ניהול של סוכן גורם. מערכות טטרציקלין (Tet)-inducible הן אחת ממערכות RNAi המותנות הנפוצות ביותר^10. מערכות Tet-inducible יכול לגרום השתקת גנים היעד על ידי שליטה הביטוי של shRNA בתוספת של גורם אקסוגני (דוקסיציקלין עדיף, דוקס). ניתן לחלק את מערכות Tet-inducible לשני סוגים: מערכות Tet-On או Tet-Off. ניתן להדליק את הביטוי shRNA (Tet-On) או לכבות (Tet-Off) בנוכחות ה-inducer. במערכת Tet-ON ללא גורם, המדכא Tet (TetR) התבטא באופן קבוע כקושר לרצף הרכיב המגיב של Tet (TRE) המכיל יחצ"ן התלוי ב-Tet Pol III לביטוי shRNA, ובכך מדחיק את הביטוי של shRNA. בעוד עם תוספת של Dox, TetR מבודד מן היזם המגיב Tet Pol III תלוי. זה מקל על הביטוי של shRNA ומוביל לחיסול גנים.

הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מערכת shRNA טטרציקלין-בלתי ניתן להושר ומערכת היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את הפונקציה של clusterin ב GCSCs נגזר המטופל. Clusterin זוהה כמוקולת מפתח רומן לשמירה על הגזע והישרדות של GCSCs^{במחקר קודם 11}. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי ללמוד את ההשפעות של clusterin ב-GCSCs התחדשות עצמית. מתודולוגיה זו ישימה גם על סוגים אחרים של תאי גזע סרטניים.

Protocol

כל הניסויים באמצעות תאי גזע סרטן קיבה נגזר המטופל המתוארים בכאן אושרו על ידי הוועדה האתית המקומית⁷.

1. סרטן הקיבה תרבות תאי גזע

1. הכנת GCSCs תרבות מלאה בינונית
   1. להכין GCSCs תרבות מלאה בינוני על ידי הוספת טרי DME / F12 בינוני עם המרכיבים החיוניים הבאים: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% אינסולין / Transferrin / נתרן סלניט, 0.2% גלוקוז, 0.5% B27, 1% גלוטמקס, 1% חומצת אמינו לא חיונית, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0.75 מ"ג/מ"ל NaHCO_3,10 μM thioglycerol, 100 IU/mL פניצילין ו 100 μg/mL סטרפטומיצין. סינון ועיקור באמצעות מסנן 0.22 μm.
      הערה: GCSCs להשלים תרבות בינוני מומלץ לאחסן רצוי לא יותר משבועיים ב 4 °C.
2. שחזור של GCSCs ותרבות
   הערה: GCSCs הושגו כדלקמן: דגימות גידול היו נתונים לדיסוציאציה מכנית ואנזימטית. מתלים תא יחיד הושגו על ידי סינון עם רשת ניילון מתלים מפוזרים היטב. התאים הסרטניים וכתוצאה מכך היו תרבותיים GCSCs תרבות מלאה בינוני, וכמה תאים גדלו כדי ליצור ספירות. ספירות אלה היו נתון לאחר מכן דיסוציאציה אנזימטית, GCSCs ניתן להשיג על ידי מיון cytofluorometric של אוכלוסיית התא מוכתם סמני CD44/CD54. הפרוטוקול המפורט ומחשבים פונקציונליים של GCSCs דווחו^7.
   1. GCSCs חם מראש להשלים את החברה תרבות ב 37 ° C עבור לא יותר מ 30 דקות.
   2. להפשיר GCSCs מאחסון חנקן נוזלי ולהפשיר במהירות cryovials באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ממשיכים לערבב את הבקבוקונים עד שכל התוכן נמס לחלוטין.
      הערה: הפשיר תאים קפואים במהירות (<1 דקות) באמבט מים של 37°C.
   3. העבר את כל התוכן של cryovials לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של GCSCs תרבות מלאה מדיום. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב RT.
   4. לשאוף את supernatant בזהירות להשעות את גלולת התא ב 10 מ"ל של GCSCs טרי להשלים בינוני. לוח מתלה התא בצלחת פטרי 100 מ"מ. דגירה את הצלחת ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום שלם טרי ביום השלישי.
3. תת-תרבות של גידולים GCSCs
   הערה: GCSCs של מרכז גידולים יש רק מספיק חומרים מזינים לפני גודל הספירות גדל עד 80-100 μm קוטר. לאחר חשוך ונמוך שפירות שבירה מופיעים (על 6 ימים של תרבות), יש צורך תת תרבות הגידולים.
   1. לנער את המנה בעדינות ולהעביר את GCSCs גידולים תרבית מדיום (המדיום ואת הגידולים שאינם דבקים) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל. עבור נפחים בינוניים גדולים יותר, ייתכן שיהיה צורך בצינורות צנטריפוגה גדולים יותר.
   2. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ולהיפטר בזהירות של supernatant. לאחר צנטריפוגה, כדור לא לבן יהיה גלוי.
   3. הוסף 2 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה תא כדי לתבל מחדש את הכדור עבור דיסוציאציה מכנית ואנזימטית ב 37 °C. בעדינות צינור למעלה ומטה 10 פעמים כל 2-3 דקות בהליך העיכול כדי לשבור את הספירות לגזרים עד הגידולים מפוזרים לתוך מתלה תא יחיד. תהליך דיסוציאציה כולל זה מומלץ להיות פחות מ- 15 דקות.
      הערה: בצע בדיקה חזותית מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שלא נותרו ספירות גדולות או אגרגטים של תאים.
   4. הוסף 10 מ"ל של GCSCs מחממים מראש טריים מלאים תרבות בינונית (5 x את הנפח של פתרון הניתוק של התא) כדי לסיים את תהליך העיכול צנטריפוגה ב 800 x g ב RT במשך 5 דקות.
   5. בטל את supernatant ולתחות מחדש את התאים עם 1 מ"ל של GCSCs חם מראש טרי תרבות מלאה מדיום. זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת פטרי חדשה 100 מ"מ עם 10 מ"ל של GCSCs חם מראש טרי תרבות מלאה מדיום ותחבולות ב 37 °C, 5% CO₂.
   6. להתרבות גידולים refeed לאחר 3 ימים על ידי הוספת 5 מ"ל של טרי מראש חם מדיום שלם. לאחר 6 ימים, מעבר תאים כאשר גידולים לגדול עד 80-100 μm קוטר.
4. הקפאה של GCSCs
   הערה: אין לחסוך בהקפאה תאי GCSCs על-ידי הוספת ספירות בינוניות לגידולים ישירות. גידולים GCSCs צריך להיות מעוכל לתאים בודדים, כך סוכן מגן תא יכול להיכנס לכל תא כדי להבטיח אחסון יציב לטווח ארוך של תאים. ודאו שהתאים במצב בריא וללא זיהום.
   1. גידולים במבחני הבגרות של הקציר. צנטריפוגה ב-600 x גרם ל-5 דקות.
   2. בטל את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של פתרון דיסוציאציה תא לנתק גידולים GCSCs ב 37 °C. לסיים את תהליך העיכול על ידי הוספת 10 מ"ל של GCSCs להשלים את התרבות בינונית.
   3. צנטריפוגה ב- 800 x g למשך 5 דקות ולאסוף GCSCs יחיד.
   4. השעו בעדינות GCSCs עם מדיום הקפאה ללא סרום. הריכוז הסופי המומלץ הוא 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   5. לחלק את מתלה התא ב 1 מ"ל aliquots לתוך בקבוקונים קריוגניים מסומנים.
   6. מיד מניחים את ההקפאה המכילה את התאים בתא isopropanol ולאחסן אותם ב -80 °C. מעבירים את הבקבוקונים לחנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך.

2. הדור של קווי GCSCs נוק-דאון בלתי ניתן לכך

התראה: לנטיוירוסים רקומביננטיים הוגדרו כאורגניזמים ברמה 2 על ידי המכון הלאומי לבריאות והמרכז לבקרת מחלות. עבודה הכוללת lentivirus דורשת תחזוקה של מתקן Biosafety רמה 2, בהתחשב בכך supernatants ויראלי המיוצר על ידי מערכות עדנוויראליות אלה יכול להכיל וירוס רקומביננטי שעלול להיות מסוכן.

1. דור חלקיקי לונטיוירוס
   1. סינתזה 2 וקטורים lentiviral נושאת shRNA בלתי ניתן להוכחה מיקוד אשכולות אנושיים וקטור לנטי ויראלי שליטה ללא מיקוד (GV307) מ GeneChem מבוסס על העיצוב של טבלה 1 (וקטור GV307 מכיל: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
   2. זרע 4 x 10⁶ 293T עדנטי-ויראלי תאי אריזה לתוך 100 מ"מ פטרי צלחת עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום שורי עובר.
   3. דגירה 293T תאים לילה ב 37 °C, 5% CO₂. ודא כי צפיפות תא 293T הוא על 50-80% confluent יום הטרנס-פקציה.
   4. הביאו את הנסיוב המופחת לטמפרטורת החדר והכנו את צינור A וצינור B כמתואר בטבלה 2.
   5. העברת צינור A לתוך צינור B, לערבב היטב, דגירה את המתחם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין תסביכי ה-DNA שומנים.
   6. הסר 5 מ"ל של מדיום, לפני הוספת קומפלקס שומנים-DNA, משאיר סך של 5 מ"ל.
   7. מוסיפים 5 מ"ל של תסביך שומנים-דנ"א לצלחת התרבות בעדינות ומערבבים בעדינות את המנה כדי להפיץ את המתחם.
      הערה: לחלק בזהירות נוזל על קיר הצלחת כדי למנוע הפרעה 293T תאים.
   8. דגירה צלחת תרבות עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂.
   9. לאחר 24 שעות לאחר הטרנס-קדם-פעולה, הסר בזהירות את אמצעי הטרנס-פנדיטורי והחלף בעדינות ב-10 מ"ל של DMEM חם מראש בתוספת 10% FBS. דגירה ל-24 ש' ב-37°C, 5% CO₂.
      הערה: יש לטפל בכל הסופרנטנטים והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
   10. כ-48 שעות לאחר הטרנס-תעבורה, קציר 10 מ"ל של נטי-וירוס המכילים על.על.
       הערה: יש לטפל בכל כלי תרבות התאים וטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
   11. לסנן את supernatant lentiviral באמצעות מסנן נקבוביות 0.45 μm כדי להסיר פסולת תאית.
       הערה: יש לטפל בכל המסננים והמזרקים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
   12. מעבירים את הסופרנט המובהר למכל סטרילי, מוסיפים את Lenti-X Concentrator (נפח של 1/3 של סופרנט מובהר) לערבב על ידי היפוך עדין.
   13. דגירה תערובת ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
   14. דגימות צנטריפוגות ב-1,500 x גרם למשך 45 דקות ב-4°C. לאחר צנטריפוגה, וכדור מחוץ ללבן יהיה גלוי. בזהירות להסיר supernatant, לדאוג לא להפריע את הכדור.
       הערה: יש לטפל בכל הסופרנטנטים והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
   15. בעדינות respenpened את הכדור ב 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS כמו מניות וירוס, לאחסן ב -80 ° C.
2. יצירת קווי תאים יציבים הנגועים
   1. זרע 6 x 10⁶ GCSCs לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ עם 10 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂ (70-80% confluence לפני הזיהום).
   2. שאיפה המדיום בצלחת, להוסיף את חלקיקי lentiviral מרוכז מדולל עם 4 מ"ל של DMEM שלם בינוני המכיל ריאגנט פוליברן (5 μg / מ"ל) לתוך המנה. דגירה ל-18 ש' ב-37°C, 5% CO₂.
      הערה: הריכוז האופטימלי של פוליברן תלוי בסוג התא, ייתכן שיהיה צורך לבדוק בריכוזים שונים כדי להחליט על הריכוזים היעילים. אחרת, זה יכול להיות נקבע אמפירי, בדרך כלל בטווח של 2-10 μg / מ"ל. יש לטפל בכל הצינורות והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
   3. שנה את המדיום, החלף ב- 10 מ"ל DMEM ב- 10% FBS בינוני ותדגירה למשך 24 שעות ב- 37°C, 5% CO₂.
      הערה: יש לטפל בכל המדיום והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה.
   4. לשאוף את supernatant עם פסולת תא, להחליף עם DMEM טרי בתוספת 10% FBS בינוני המכיל puromycin (2.5 μg / מ"ל) דגירה עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂. לאחר מכן להחליף DMEM טרי בתוספת 10% FBS בינוני המכיל puromycin (5 μg / מ"ל) דגירה ב 37 ° C, 5% CO_{2 עבור} 24 שעות נוספות.
   5. לשטוף את GCSCs דבק פעמיים עם 5 מ"ל של DPBS ללא סידן ומגנזיום.
   6. נתק GCSCs עם 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה תאים חם מראש דגירה 2-3 דקות ב 37 ° C.
   7. הוסף 5 מ"ל של GCSCs מחממים מראש טריים תרבות מלאה בינונית מתלה התא.
   8. לחלק 3 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל (צינור A) עבור cryopreserving התאים, ואת השני 3 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל (צינור B) עבור גורם על ידי דוקסיציקלין.
   9. צנטריפוגה צינור A וצינור B ב 800 x g עבור 5 דקות.
   10. תוסתה מחדש את הגלולה של צינור A עם 1 מ"ל של מדיום הקפאה ללא סרום, להעביר את הבקבוקון ל -80 מעלות צלזיוס בן לילה, ולהסיר אותו לאחסון חנקן נוזלי.
   11. לשאוף את supernatant ולזעוס מחדש את התאים של צינור B ב 1 מ"ל של GCSCs חם מראש טרי להשלים תרבות בינונית. זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת פטרי חדשה 100 מ"מ של 10 מ"ל טרי GCSCs מחממים מראש תרבות מלאה בינוני עם דוקסיציקלין (דוקס) (2.5 μg / מ"ל) דגירה עבור 48 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂.
       הערה: הריכוז האופטימלי של Dox עשוי להשתנות בין קווי התא. כל קו תא צריך להיבדק בריכוזי Dox שונים כדי להחליט את הריכוזים היעילים עבור KD ועל רעילות על התאים.
   12. אשר דיכוי יציב של clusterin בGCSCs על ידי כתמים מערביים.

3. היווצרות כדור

1. הפשיר את קווי GCSCs נוק-אאוט קפואים (ראה שלב 1.2).
2. לקבוע צפיפות תא בת קיימא של מדגם 10 μL באמצעות מונה תא אוטומטי.
3. כוונן את עוצמת הקול עם GCSCs חימום מראש תרבות מלאה בינוני כדי להשיג ריכוז של 2 x 10⁴ תאים קיימא / מ"ל.
4. לחלק לתוך 3 חדש 96-באר אולטרה-גם-קובץ-נמוך-קובץ תרבות צלחת בארות (0.1 מ"ל / גם) כל קבוצה.
5. דגירה התאים ב אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO₂. היווצרות כדור צריכה להתרחש בתוך 3-10 ימים. לפקח ולתקליט את ההדמיה של היווצרות גידולים כל 2 ימים.
   הערה: המדיום אינו מומלץ להשתנות במקרה של הפרעה כלשהי של היווצרות גידולים. גידולים אלה צריכים להיות נבדלים בקלות מתאים בודדים ומצטברים.
6. לקבוע תוצאות היווצרות גידולים על ידי הערכת הגדלים של גידולים שנוצרו באמצעות תוכנת הדמיה.

תוצאות

תאי גזע סרטן הקיבה אדנוקרצינומה קיבה אנושית העיקרית היו תרבותיים במדיום תרבות ללא סרום. לאחר 6 ימים, התאים התרחבו מהפנוטיפ היחיד הדומה לתא (איור 1א') כדי ליצור ספירות גדולות (איור 1ב').

כדי ל...

Discussion

GC הוא הגורם המוביל השלישי למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם. GCSCs הם קריטיים בנסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. באמצעות GCSCs מחולים בסרטן הקיבה יאפשר לנו לחקור את נקודת התורפה שלהם ולפתח את תרופות מיקוד לטיפול של חולי GC.

היווצרות כדור assay היא שיטה שימושית כדי לבחון את פוטנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1