Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Özet

Bu protokolde, clusterin'in hasta kaynaklı GCSC'lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Özet

Kanser kök hücreleri (CSCs) tedavi sonrası tümör inisiyasyonu, gelişme ve nüks karıştığı, ve son yıllarda birçok çalışmaların ilgi odağı haline gelmiştir. Bu nedenle, kanser hücresi köklüğü ile ilgili önemli genlerin rolünü araştırmak için yöntemler geliştirmek önemlidir. Mide kanseri (GC) en yaygın ve ölümlü kanser türlerinden biridir. Mide kanseri kök hücreleri (GCSCs) mide kanseri nüks kök olduğu düşünülmektedir, metastaz ve ilaç direnci. Hedeflenen tedavilerin gelişimini ilerletmek ve sonunda hastalar arasında mortaliteyi azaltmak için GCSCs biyolojisinin anlaşılması gerekmektedir. Bu protokolde, clusterin'in hasta kaynaklı GCSC'lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Mide kanseri (GC) kanserlerin en yaygın ve mortal tiplerinden biridir^1. Kombine cerrahi, kemoterapi ve Radyoterapi GC tedavisinde gelişmelere rağmen, prognoz kötü kalır ve beş yıllık sağkalım oranı hala çok^düşük2 . Tedavi sonrası ölümlerin başlıca nedenleri nüks ve metastazdır.

Kanser kök hücreleri (CSCs) kendini yenilemek ve tümör yeniden farklı hücre soyları oluşturmak yeteneğine sahip kanser hücrelerinin bir alt kümesidir³. CSCs kanser nüks ve metastaz nedeniyle kendi kendini yenileme ve tohumlama yeni tümörler kendi yetenekleri nedeniyle sorumlu olduğuna inanılmaktadır, yanı sıra geleneksel kemoterapi onların direnci- ve radyoterapiler⁴. Bu nedenle, CSCs hedefleme ve CSCs ortadan kaldırılması tedaviyi iyileştirmek ve kanser hastalarının mortalitesini azaltmak için heyecan verici bir potansiyel sağlar.

CSC'ler birçok tipsolid tümörden izole edilmiştir^5. 2009 yılında, mide kanseri kök hücreleri (GCSCs) insan mide kanseri hücre hatları izole başlangıçta Takaishi ve ark.⁶tarafından tanımlanmıştır . Chen ve meslektaşları öncelikle tespit ve insan mide adenokarsinomu (GAC) tümör dokularından GCSCs saflaştırılmış⁷. Bu bulgular sadece GCSCbiyoloji eğitimi için bir fırsat sağlamakla kalmamış, aynı zamanda büyük klinik önem de sağlamaktadır.

CSC'lerin belirli bir özelliği küre⁸oluşturma kapasiteleridir. Tek hücreler düşük yoğunlukta nonadherent koşullarda kaplanır ve sadece kendini yenileme ile sahip hücreler bir küre denilen katı, küresel küme haline büyüyebilir. Bu nedenle küre oluşumu tetkik altın standart test olarak kabul edilmiş ve kök hücre kendini yenileme potansiyelini in vitro olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır.

RNA girişim (RNAi) belirli bir gen⁹nakavt tarafından gen fonksiyonu çalışma için güçlü bir araştırma aracıdır. Ancak, uzun vadeli istikrarlı gen nakavt teknolojileri, hücre hayatta kalmak için gerekli olan bir genin işlevini keşfetmek meydan okuma gibi bazı sınırlamalar var. Koşullu RNAi sistemleri, indükleyici bir ajanın uygulanması ile istenilen genlerin zamansal ve/veya özel kontrollü bir şekilde küçültülmesi için yararlı olabilir. Tetrasiklin (Tet)-indüklenebilir sistemler en yaygın olarak kullanılan koşullu RNAi sistemlerinden biridir¹⁰. Tet-inducible sistemleri bir eksojen indükleyici eklenmesi üzerine shRNA ekspresyonu kontrol ederek hedef gen susturma neden olabilir (tercihen doksisiklin, Dox). Tet-indüklenebilir sistemler iki tipe ayrılabilir: Tet-On veya Tet-Off sistemleri. shRNA ifadesi indükleyicinin varlığında (Tet-Açık) veya kapatılabilir (Tet-Off). Bir indükleyici olmadan Tet-ON sisteminde, kurucu olarak ifade edilen Tet bastırıcı (TetR) shRNA ekspresyonu için Tet duyarlı Pol III bağımlı promotör içeren Tet duyarlı eleman (TRE) dizisine bağlanır, böylece shRNA ifadesini bastırır. Dox'un eklenmesiyle, TetR Tet duyarlı Pol III bağımlı organizatöründen uzak bir şekilde tecrit edilir. Bu shRNA ifadesini kolaylaştırır ve gen nakavt yol açar.

Burada açıklanan protokol, hasta kaynaklı GCSC'lerde kümenin işlevini incelemek için fonksiyonel tetrasiklin indüklenebilir shRNA sistemi ve uyarlanmış küre oluşumu testini kullanır. Clusterin, bir önceki çalışmada GCSC'lerin köklüğünü ve sağkalımını korumak için yeni bir anahtar molekül olarak tanımlanmıştır¹¹. Açıklanan protokolü, GCSC'lerde kümenin kendi kendini yenilemedeki etkilerini incelemek için kullanırız. Bu metodoloji kanser kök hücrelerinin diğer türleri için de geçerlidir.

Protokol

Burada tanımlanan hasta kaynaklı mide kanseri kök hücreleri kullanılarak yapılan tüm deneyler yerel etik komite tarafından onaylanmıştır^7.

1. Mide kanseri kök hücre kültürü

1. GCSC'lerin komple kültür ortamının hazırlanması
   1. Aşağıdaki temel malzemelerle taze DME/F12 ortamı ekleyerek GCSC'lerin tam kültür ortamını hazırlayın: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, %1 İnsülin/Transferrin/Sodyum selenit, %0.2 glikoz, %0.5 B27, %1 Glutamax, %1 uçucu olmayan amino asit, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0.75 mg/mL NaHCO_3,10 μM tiyogliserol, 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisinc. Filtre ve 0,22 μm filtre kullanarak sterilize.
      NOT: GCSC'lerin tam kültür ortamının tercihen 4 °C'de en fazla iki hafta saklanmış olması tavsiye edilir.
2. GCSC'lerin ve kültürün geri kazanımı
   NOT: GCSC'ler aşağıdaki gibi elde edildi: Tümör örnekleri mekanik ve enzimatik dissosiyaasyona tabi tutuldu. Tek hücreli süspansiyonlar iyi dağılmış süspansiyon naylon net ile filtreleme ile elde edildi. Ortaya çıkan kanser hücreleri GCSCs Complete Culture Medium'da kültürlendi ve bazı hücreler küreler oluşturdu. Bu küreler daha sonra enzimatik dissosilasyona tabi tutuldu ve CD44/CD54 belirteçleri ile boyanmış hücre popülasyonunun sitoflorometrik sıralaması ile GCSC'ler elde edilebilir. GCSC'lerin ayrıntılı protokolü ve fonksiyonel tahlilleri⁷olarak bildirilmiştir.
   1. Pre-warm GCSCs en fazla 30 dakika için 37 °C'de tam kültür ortamı.
   2. 37 °C'lik su banyosunda sıvı nitrojen deposundan GCSC'leri çözün ve cryovial'ları hızla eritin. Tüm içerik tamamen eriyene kadar şişeleri döndürmeye devam edin.
      NOT: 37 °C'lik su banyosunda dondurulmuş hücreleri hızla (<1 dk) eritin.
   3. Cryovials'ın tüm içeriğini 10 mL GCSC içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. RT'de 5 dk için 800 x g'da santrifüj.
   4. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 10 mL taze GCSC'lerde tam orta sürede askıya alın. Hücre süspansiyonuna 100 mm Petri kabında plaka koyun. Plakayı %5 CO₂ kuluçka makinesinde 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve üçüncü gün 5 mL taze tam orta ekleyin.
3. GCSCs tümörkürelerinin alt kültürü
   NOT: Tümörküre merkezinin GCSC'leri, küre lerin büyüklüğü 80-100 m'ye kadar çıkmadan önce sadece yeterli besin maddesi içerir. Karanlık ve düşük kırılma küreleri ortaya çıktıktan sonra (yaklaşık 6 günlük kültür), tümör kürelerinin alt kültüre alınması gerekir.
   1. Tabağı hafifçe çalkalayın ve GCSCs tümörküre kültür ortamını (orta ve non-yapışık tümörküreler) steril 15 mL santrifüj tüpe aktarın. Daha büyük orta hacimler için daha büyük santrifüj tüpler gerekebilir.
   2. 5 dk için 600 x g santrifüj ve dikkatle supernatant bertaraf. Santrifüjden sonra beyaz olmayan bir pelet görünür olacaktır.
   3. 37 °C'de mekanik ve enzimatik dissosiyasasyon için peleti yeniden askıya almak için 2 mL hücre dissociation çözeltisi ekleyin. Tümör küreleri tek hücreli süspansiyona dağılana kadar küreleri ayırmak için sindirim işleminde her 2-3 dakikada 10'da 10'ar kez yukarı ve aşağı borular kurun. Bu toplam dissosyon işleminin 15 dk'dan az olması önerilir.
      NOT: Büyük kürelerin veya hücre agregalarının kolmadığını doğrulamak için mikroskop altında görsel bir denetim yapın.
   4. Sindirim prosedürünü sona erdirmek için 10 mL taze önceden ısıtılmış GCSC'ler komple kültür ortamını (hücre dekolmanı çözeltisinin hacmi5 kat) ekleyin ve 5 dakika boyunca RT'de 800 x g'da santrifüj yapın.
   5. Supernatant atın ve taze önceden ısıtılmış GCSCs tam kültür orta 1 mL ile hücreleri yeniden askıya. 10 mL taze önceden ısıtılmış GCSC'ler ile yeni bir 100 mm Petri kabına uygun sayıda hücre tohumlayın kültür ortamını tamamlayın ve 37 °C,%5 CO_2'dekuluçkaya yatırın.
   6. 3 gün sonra 5 mL taze önceden ısıtılmış komple orta ekleyerek tümör küreleri yeniden besleyin. 6 gün sonra tümör kürelerinin çapı 80-100 m'ye kadar çıktığı hücreler eve kadar büyür.
4. GCSC'lerin Kriyopreservation
   NOT: Doğrudan tümör kürelerine orta ekleyerek GCSCs hücrelerini kriyokorunmuş etmeyin. GCSCs tümörküreler tek hücrelere sindirilmelidir böylece hücre koruyucu ajan hücrelerin uzun vadeli istikrarlı depolama sağlamak için her hücre girin olabilir. Hücrelerin sağlıklı durumda ve kontaminasyon olmadan olduğundan emin olun.
   1. Hasat GCSCs tümörküreler. Santrifüj 600 x g 5 dk.
   2. Süpernatant atın ve 37 °C'de GCSCs tümörferos ayrıştırmak için hücre ayrışma çözeltisi 2 mL ekleyin. 10 mL GCSC'lik tam kültür ortamı ekleyerek sindirim işlemini sonlandırın.
   3. 5 dk için 800 x g santrifüj ve tek GCSCtoplamak.
   4. Serumsuz kriyoteksif ortama sahip GCSC'leri hafifçe askıya alın. Önerilen son konsantrasyon 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ hücre/mL'dir.
   5. Hücre süspansiyonuna 1 mL aliquots cinsinden işaretli kriyojenik şişeler halinde dağıtın.
   6. Hücreleri içeren cryovialleri hemen bir isopropanol haznesinde yerleştirin ve -80 °C'de saklayın. Uzun süreli depolama için ertesi gün şişeleri sıvı nitrojene aktarın.

2. Indüklanabilir nakavt GCSCs hatlarının üretimi

DİkKAT: Rekombinant lentivirüsler Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Hastalık Kontrol Merkezi tarafından Düzey 2 organizmalar olarak belirlenmiştir. Lentivirus içeren çalışmalar, bu lentiviral sistemler tarafından üretilen viral supernatants potansiyel olarak tehlikeli rekombinant virüs içerebilir göz önüne alındığında, bir Biyogüvenlik Düzey 2 tesisin in bakım gerektirir.

1. Lentivirüs partiküllerinin üretimi
   1. Tablo 1 (GV307 vektörü içerir: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin) tasarımına dayalı GeneChem'den insan kümesini ve hedefsiz bir kontrol lentiviral vektörü (GV307) hedefleyen indükleyici shRNA taşıyan 2 lentiviral vektörü sentezleyin.
   2. Tohum 4 x 10⁶ 293T lenti-viral ambalaj hücreleri 100 mm Petri kabına 10 mL DMEM ile % 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir.
   3. Kuluçka 293T hücreleri bir gecede 37 °C, 5% CO₂. 293T hücre yoğunluğunun transfeksiyon gününü %50-80 oranında olduğundan emin olun.
   4. Azaltılmış serum ortamını oda sıcaklığına getirin ve Tablo 2'deaçıklandığı gibi Tüp A ve Tüp B'yi hazırlayın.
   5. Tüp A'yı Tüp B'ye aktarın, iyice karıştırın ve lipid-DNA komplekslerini hazırlamak için 20 dakika oda sıcaklığında kompleksleri kuluçkaya yatırın.
   6. Lipid-DNA kompleksi eklemeden önce 5 mL orta yı çıkarın ve toplam 5 mL bırakarak.
   7. Kültür çanak dropwise içine lipid-DNA kompleksi 5 mL ekleyin ve yavaşça karmaşık dağıtmak için çanak girdap.
      NOT: 293T hücreleri rahatsız önlemek için dikkatle bulaşık duvarına sıvı dağıtmak.
   8. 37 °C'de 24 saat, %5 CO_2'dekuluçka kültür yemeği .
   9. Transfeksiyon sonrası 24 saat sonra transfeksiyon ortamını dikkatlice çıkarın ve %10 FBS ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış DMEM'in 10 mL'si ile nazikçe değiştirin. 37 °C'de 24 saat kuluçka, %5 CO₂.
      NOT: Tüm supernatant ve ipuçları bertaraf edilmeden önce% 10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
   10. Transfeksiyon sonrası yaklaşık 48 saat sonra 10 mL merceksi içeren süpernatant hasat edin.
       NOT: Tüm hücre kültürü damarları ve uçları imha edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
   11. Hücresel enkazı temizlemek için 0,45 m'lik gözenek filtresi kullanarak lentiviral supernatant'ı filtreleyin.
       NOT: Tüm filtreler ve şırıngalar imha edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
   12. Transfer steril bir konteyner için supernatant açıklık, Lenti-X Concentrator (1/ 3 hacim açıklık supernatant) nazik inversiyon tarafından karıştırmak ekleyin.
   13. Bir gecede 4 °C'de kuluçka karışımı.
   14. 4 °C'de 45 dk için 1.500 x g santrifüj örnekleri. Santrifüjden sonra ve beyaz olmayan pelet görünür olacaktır. Peleti rahatsız etmemeye özen terek supernatant'ı dikkatlice çıkarın.
       NOT: Tüm supernatant ve ipuçları bertaraf edilmeden önce% 10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
   15. 1 mL DMEM'de virüs stoku olarak %10 FBS ile desteklenen peleti -80 °C'de yavaşça yeniden askıya alın.
2. Kararlı transfected hücre hatlarının üretimi
   1. Tohum 6 x 10⁶ GCSCs 100 mm Petri çanak içine 10 mL DMEM ile 10% FBS ile takviye 10% FBS için 24 h için 37 °C, 5% CO₂ (70-80% enfeksiyon önce birleştiği).
   2. Çanak içinde orta aspire, çanak içine polibren reaktif (5 g/mL) içeren tam DMEM orta 4 mL seyreltilmiş konsantre lentiviral parçacıklar ekleyin. 37 °C'de 18 saat kuluçka, %5 CO₂.
      NOT: Polibrenin optimal konsantrasyonu hücre tipine bağlıdır ve etkili konsantrasyonlara karar vermek için farklı konsantrasyonlarda test edilmesi gerekebilir. Aksi takdirde, ampirik olarak belirlenebilir, genellikle 2-10 μg/mL aralığında. Tüm tüpler ve ipuçları bertaraf edilmeden önce% 10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
   3. Orta yı değiştirin, %10 FBS orta ile 10 mL DMEM değiştirin ve 37 °C'de 24 saat, %5 CO_2'dekuluçkaya yatırın.
      NOT: Tüm ortam ve uçlar imha edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
   4. Hücre enkazı ile supernatant aspire, taze DMEM ile takviye 10% FBS orta puromisin içeren (2.5 g/mL) ve kuluçka için 24 saat için 37 °C, 5% CO₂. Daha sonra puromisin (5 g/mL) içeren %10 FBS ortamı ve 37 °C,%5 CO 2 ilave 24 saat için %5 CO_2'de kuluçkaya yatırılan taze DMEM'i değiştirin.
   5. Yapışkan GCSC'leri kalsiyum ve magnezyum olmadan 5 mL DPBS ile iki kez durula.
   6. 1 mL önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma çözeltisi ile GCSC'leri ayrıştırın ve 37 °C'de 2-3 dk kuluçkaya yatırın.
   7. Hücre süspansiyonuna 5 mL taze önceden ısıtılmış GCSC'yi tam kültür ortamı ekleyin.
   8. Hücreleri kriyokoruma için 15 mL'lik santrifüj tüpüne (tüp A) 3 mL, doksisiklin ile indükleme için ise 15 mL santrifüj tüpüne (tüp B) dağıtın.
   9. Santrifüj tüp A ve tüp B 800 x g 5 dk için.
   10. 1 mL serumsuz kriyoleelektrik ortama sahip A tüpünün peletini yeniden askıya alın, şişeyi bir gecede -80 °C'ye aktarın ve sıvı nitrojen deposuna çıkarın.
   11. Supernatant aspire ve taze önceden ısıtılmış GCSCs tam kültür ortamı 1 mL içinde tüp B hücreleri resuspend. 10 mL taze önceden ısıtılmış GCSCs yeni bir 100 mm Petri çanak içine uygun sayıda hücre tohum doksisiklin ile tam kültür orta (Dox) (2.5 g/mL) ve kuluçka için 48 h için 37 °C, 5% CO₂.
       NOT: Dox optimal konsantrasyonhücre hatları arasında değişebilir. Her hücre hattı KD için etkili konsantrasyonları ve hücreler üzerinde toksisite için karar vermek için farklı Dox konsantrasyonlarında test edilmelidir.
   12. GcsC'lerde kümelerin batı lekeleme ile kararlı baskılarını doğrulayın.

3. Küre oluşumu tetkiki

1. Dondurulmuş indükedilemez nakavt GCSCs satırlarını eritin (bkz. adım 1.2).
2. Otomatik Hücre Sayacı kullanarak 10 μL'lik bir numunenin uygulanabilir hücre yoğunluğunu belirleyin.
3. Önceden ısıtılmış GCSC'ler ile hacmi 2 x 10⁴ canlı hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için kültür ortamını tamamlayın.
4. Her gruba 3 yeni 96-iyi ultra-düşük bağlı kültür plakası kuyusu (0,1 mL/iyi) dağıtın.
5. Hücreleri 37 °C'de %5 CO₂ile bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Küre oluşumu 3-10 gün içinde meydana gelmelidir. Her 2 günde bir tümörküre oluşumunun görselleşmesini izleyin ve kaydedin.
   NOT: Tümör küreoluşumunda herhangi bir bozulma olması durumunda ortamın değiştirilmesi önerilmez. Bu tümör küreler tek ve birleştirilmiş hücrelerden kolayca ayırt edilmelidir.
6. Görüntüleme yazılımı kullanarak oluşan tümörkürelerin boyutlarını değerlendirerek tümörküre oluşumu sonuçlarını belirleyin.

Sonuçlar

Primer insan gastrik adenokarsinommide mide kanseri kök hücreleri serumsuz kültür ortamında kültürlendi. 6 gün sonra hücreler tek hücre benzeri fenotipten(Şekil 1A)geniş küreler oluşturacak şekilde genişledi (Şekil 1B).

GCSC'lerde kümenin işlevini değerlendirmek için, yukarıda açıklanan protokole göre kümelere ...

Tartışmalar

GC dünya çapında kansere bağlı ölüm üçüncü önde gelen nedenidir. Mide kanseri nüks, metastaz ve ilaç direncinde GCSC'ler kritik öneme karşıdır. Mide kanseri hastalarınDan GCSC'ler kullanmak zayıf noktalarını keşfetmemizi ve GC hastalarının tedavisi için hedef edici ilaçları geliştirmemizi sağlayacaktır.

Küre oluşumu teşpinin in vitro kanser kök hücre kendini yenileme potansiyelini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Sonuçlar, tohumlanmış tek hücre s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1