결합된 조건부 녹다운 및 적응된 구체 형성 분석은 환자 유래 위암 줄기 세포의 줄기 관련 유전자를 연구하기 위하여

요약

이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

초록

암 줄기 세포 (CSC)는 종양 개시, 발달 및 치료 후 재발에 연루되어 있으며 지난 수십 년 동안 많은 연구의 관심의 중심이되었습니다. 따라서 암세포 줄기에 관여하는 주요 유전자의 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 위암 (GC)은 암의 가장 일반적이고 필멸의 모형 의 한개입니다. 위암 줄기세포(GCSC)는 위암 재발, 전이 및 약물 내성의 근본원인것으로 생각된다. GCSCs 생물학을 이해하는 것은 표적으로 한 치료의 발달을 발전시키고 결국 환자 중 사망을 감소시키기 위하여 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

서문

위암 (GC)은 암의 가장 일반적이고 필멸의 유형 중 하나입니다^1. 결합된 수술, 화학요법 및 GC 치료에 있는 방사선 요법에 있는 어드밴스에 도 불구하고, 예후는 가난한 남아 있고 5 년 생존율은 아직도 아주 낮은^2입니다. 재발과 전이는 치료 후 사망을 일으키는 주된 이유입니다.

암줄기세포(CSC)는 종양^3을재구성하는 상이한 세포 계보를 자가 갱신하고 생성하는 능력을 가진 암세포의 하위 집합이다. CSC는 자기 갱신 및 파종 새로운 종양의 그들의 기능 때문에 암 재발및 전이에 책임 있는 것으로 믿어진다, 전통적인 화학 요법및 방사선^요법4에그들의 저항뿐만 아니라. 따라서 CSC를 타겟팅하고 CSC를 제거하면 치료를 개선하고 암 환자의 사망률을 줄일 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다.

CSC는 고형 종양^5의많은 모형에서 격리되었습니다. 2009년, 인간 위암 세포로부터 분리된 위암 줄기세포(GCSCs)는 원래 타카이시 외^6에의해 기술되었다. 첸과 동료들은 인간 위 성암(GAC) 종양 조직^{7으로부터}GCSC를 먼저 확인하고 정제하였다. 이 사실 인정은 GCSCs 생물학을 공부하는 기회를 제공할 뿐만 아니라 또한 중대한 임상 중요성을 제공합니다.

CSC의 특정 특성은 구^8을형성하는 능력입니다. 단일 세포는 저밀도에서 비부착 조건에서 도금되며, 자체 갱신을 소유한 세포만이 구라고 불리는 고체, 구형 클러스터로 성장할 수 있다. 따라서, 구형성 분석은 금본위제 분석으로 간주되어 왔으며, 시험관내에서 줄기세포 자가재생 잠재력을 평가하기 위해 널리 사용되고 있다.

RNA 간섭(RNAi)은 특정 유전자^9의녹다운에 의해 유전자 기능을 연구하는 강력한 연구 도구이다. 그러나, 장기 안정유전자 녹다운 기술은 세포 생존에 필수적인 유전자의 기능을 탐구하는 도전과 같은 특정 한계가 있습니다. 조건부 RNAi 시스템은 유도제의 투여에 의한 시간적 및/또는 특수 제어 방식으로 원하는 유전자의 하향 조절에 유용할 수 있다. 테트라사이클린(Tet)-유도 할 수 없는 시스템은 가장 널리 사용되는 조건부 RNAi^{시스템(10)}중 하나입니다. Tet 유도성 시스템은 외인 유도제(우선 독시사이클린, 독스)를 첨가하면 shRNA의 발현을 제어함으로써 표적 유전자 침묵을 유도할 수 있다. Tet-유도 할 수없는 시스템은 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. shRNA의 발현은 유도체의 존재에서 켜지거나 (Tet-Off) 끌 수 있다. 유도체가 없는 Tet-ON 시스템에서, 구성적으로 발현된 Tet 억압기(TetR)는 스텐반응요소(TRE) 서열에 결합하여 shRNA 발현을 위한 테트 반응폴 III 의존성 프로모터를 함유하여 shRNA 발현을 억압한다. Dox가 추가되면 TetR은 Tet 반응폴 III 의존성 프로모터로부터 격리됩니다. 이것은 shRNA의 발현을 용이하게하고 유전자 녹다운으로 이끌어 냅니다.

여기서 설명된 프로토콜은 환자 유래 GCSCs에서 클러스터진의 기능을 연구하기 위해 기능적인 테트라사이클린 유도성 shRNA 시스템과 적응된 구체 형성 분석서를^{채택하였다.} 설명된 프로토콜을 사용하여 GCSC 자체 갱신에서 클러스터진의 효과를 연구합니다. 이 방법론은 암 줄기 세포의 그밖 모형에도 적용됩니다.

프로토콜

본 명세서에 기재된 환자 유래 위암 줄기세포를 이용한 모든 실험은 지역 윤리위원회^7에의해 승인되었다.

1. 위암 줄기 세포 배양

1. GCSC 전체 문화 매체의 준비
   1. 다음과 같은 필수 성분으로 신선한 DME/F12 배지를 추가하여 GCSC 완전 배양 배지 준비: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 인슐린/트랜스퍼린/셀레나이트 나트륨, 0.2% 포도당, 0.5% B27, 글루타맥스 1%, 비필수 아미노산 10μM 2-메르카포에탄올, 0.75 mg/mL NaHCO_3,10μM 티오글리세롤, 100 IU/mL 페니핀 및 mL 페니핀 10. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터및 살균.
      참고: GCSC 완전 배양 배지는 4°C에서 2주 이상 저장되는 것이 바람직하다.
2. GCSC 및 문화 회복
   참고: GCSC는 다음과 같이 수득하였다: 종양 샘플은 기계적 및 효소 해리를 실시하였다. 단세포 현탁액은 잘 흩어져 있는 현탁액으로부터 나일론 그물로 필터링하여 얻어졌다. 결과 암세포는 GCSCs 완전 배양 배지에서 배양되었고, 일부 세포는 구체를 형성하기 위해 성장하였다. 이들 구체는 효소 해리를 거쳐, GCSC는 CD44/CD54 마커로 염색된 세포 집단의 세포플루오로메트릭 분류에 의해 얻어질 수 있다. GCSC의 상세한 프로토콜 및 기능 적⁷분석은 7보고되었습니다.
   1. 사전 웜 GCSC는 30분 이상 37°C에서 배양 배지를 완성합니다.
   2. 액체 질소 저장에서 GCSC를 해동하고 37 °C 수조에서 극저온을 급속히 해동합니다. 전체 내용이 완전히 녹을 때까지 바이알을 계속 소용돌이게 합니다.
      참고: 37°C 수조에서 냉동 세포를 빠르게 해동합니다(&1분)
   3. 극저온의 전체 내용을 10mL의 GCSC 완전 배양 배지를 포함하는 15mL 원심분리기 튜브로 전송한다. RT에서 5 분 동안 800 x g의 원심 분리기.
   4. 수퍼내를 신중하게 흡인시키고 10mL의 신선한 GCSC 완전 배지에서 세포 펠릿을 중단한다. 100mm 페트리 접시에 셀 서스펜션을 접시. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 플레이트를 배양하고 3일째에 5mL의 신선한 완전 배지를 추가합니다.
3. GCSCs 종양스피어의 하위 배양
   참고: 종양스피어 센터의 GCSC는 직경이 80-100 μm까지 자라기 전에 충분한 영양소만 가지고 있습니다. 어둡고 낮은 굴절구가 나타나면 (문화의 약 6 일), 종양 구체를 하위 배양할 필요가있다.
   1. 접시를 부드럽게 흔들고 GCSCs 종양권 배양 배지(배지 및 비부착 종양스피어)를 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 옮킨다. 더 큰 중간 볼륨의 경우 더 큰 원심분리기 튜브가 필요할 수 있습니다.
   2. 원심분리기 는 600 x g에서 5 분 동안 조심스럽게 상류부를 폐기하십시오. 원심분리 후 오프 화이트 펠릿이 보입니다.
   3. 37°C에서 기계적 및 효소 해리를 위해 펠릿을 재일시 중단하기 위해 2mL의 세포 해리 용액을 추가합니다. 종양구가 단일 세포 현탁액으로 분산 될 때까지 구체를 분해하기 위해 소화 절차에서 2-3 분마다 10 배 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 이 총 해리 프로세스는 15분 미만이되는 것이 좋습니다.
      참고: 현미경 으로 육안 검사를 수행하여 큰 구또는 세포 응집체가 남아 있지 않은지 확인합니다.
   4. 신선한 사전 따뜻해지는 GCSC 완전 배양 배지(셀 분리 용액의 5배)를 추가하여 RT에서 800 x g에서 소화 절차와 원심분리기를 5분 동안 종료합니다.
   5. 상체를 버리고 신선한 미리 따뜻워진 GCSC 의 1 mL로 세포를 다시 중단하십시오. 신선한 사전 따뜻워진 GCSC의 10mL와 새로운 100mm 페트리 접시에 적절한 수의 세포를 시드하고 37 °C, 5 % CO_2에서배양 배지를 완성한다.
   6. 3일 후 신선한 사전 데운 완전 배지5mL를 첨가하여 종양권 배양을 재공급한다. 6 일 후, 종양구가 직경 80-100 μm까지 자랄 때 통과 세포.
4. GCSC의 냉동 보존
   참고: 종양구에 직접 배지를 추가하여 GCSCs 세포를 냉동 보존하지 마십시오. GCSCs 종양구는 세포 보호제가 세포의 장기 안정한 저장을 보장하기 위하여 모든 세포를 입력할 수 있도록 단 하나 세포로 소화되어야 합니다. 세포가 건강한 상황에 있고 오염이 없는지 확인하십시오.
   1. GCSCs 종양구를 수확하십시오. 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기.
   2. 상체를 버리고 37°C에서 GCSCs 종양스피어를 해리하기 위해 세포 해리 용액 2mL을 추가한다. 10mL의 GCSC 완전 배양 배지를 추가하여 소화 절차를 종료합니다.
   3. 원심분리기 는 800 x g에서 5 분 동안 단일 GCSC를 수집합니다.
   4. 혈청이 없는 냉동 방부제 배지로 GCSC를 부드럽게 중단합니다. 권장되는 최종 농도는 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ 셀/mL입니다.
   5. 표시된 극저온 바이알로 1 mL 알리쿼트에서 세포 현탁액을 분배합니다.
   6. 즉시 이소프로판올 챔버에 세포를 포함하는 극저온을 배치하고 -80 °C에 저장합니다. 장기 저장을 위해 다음 날 유리병을 액체 질소로 옮깁니다.

2. 유도 할 수없는 녹다운 GCSC 라인의 생성

주의: 재조합 렌티바이러스는 국립 보건 보건 및 질병 통제 센터에 의해 레벨 2 유기체로 지정되었습니다. 렌티바이러스와 관련된 작업은 이러한 렌즈바이러스 시스템에서 생성된 바이러스 슈퍼난츠가 잠재적으로 위험한 재조합 바이러스를 포함할 수 있다는 점을 고려하여 생물안전 수준 2 시설의 유지 관리가 필요합니다.

1. 렌티바이러스 입자생성
   1. 합성 2 렌즈바이러스 벡터는 인간 클러스터인을 대상으로 유도 할 수없는 shRNA를 운반하고 표 1 (GV307 벡터 포함 : TetIIP-터보 RFP-MCS (MIR30)-유비 - TetR-IRES-Puromycin)의 설계에 따라 GeneChem에서 유도 성 shRNA및 비 표적 제어 렌즈바이러스 벡터 (GV307)를 운반한다.
   2. 씨앗 4 x 10⁶ 293T 렌티 바이러스 성 포장 세포100 mm 페트리 접시에 10mL의 DMEM이 10 % 태아 소 세럼으로 보충됩니다.
   3. 37 °C, 5 % CO_2에서하룻밤 동안 293T 세포를 배양한다. 293T 세포 밀도가 약 50-80% 수축되는지 확인하십시오.
   4. 감소된 혈청 매체를 실온으로 가져오고 표 2에설명된 바와 같이 튜브 A와 튜브 B를 준비한다.
   5. 튜브 A를 튜브 B로 옮기고, 잘 섞고, 실온에서 20분 동안 복합체를 배양하여 지질 DNA 복합체를 준비한다.
   6. 지질 DNA 복합체를 추가하기 전에 5mL의 매체를 제거하여 총 5mL를 남깁니다.
   7. 5mL의 지질 DNA 복합체를 배양 접시에 넣고 접시를 부드럽게 소용돌이쳐 복합체를 분배합니다.
      참고: 293T 세포를 방해하지 않도록 접시 벽에 액체를 조심스럽게 분배합니다.
   8. 37 °C에서 24 시간, 5 % CO_2에대한 배양 접시를 배양한다.
   9. 24시간 후 트랜스페션 후, 조심스럽게 트랜스페션 매체를 제거하고 10% FBS로 보충된 10mL의 사전 따뜻하게 DMEM으로 부드럽게 교체하십시오. 37 °C에서 24 시간, 5 % CO_2에대한 인큐베이션.
      참고: 모든 상체와 팁은 폐기 전에 10%의 표백제로 처리해야 합니다.
   10. 약 48 시간 후 변환 후, 수확 10 렌티 바이러스 함유 슈퍼 나티츠의 mL.
       참고: 모든 세포 배양 혈관및 팁은 폐기 전에 10%의 표백제로 처리되어야 합니다.
   11. 세포 이물질을 제거하기 위해 0.45 μm 모공 필터를 사용하여 렌티바이러스 상체를 필터링합니다.
       참고: 모든 필터와 주사기는 폐기 전에 10%의 표백제로 처리해야 합니다.
   12. 멸균 용기에 추가 된 상체를 전송, 렌티-X 농축기 (1/3 명확한 슈퍼 나탄의 볼륨)를 추가 부드러운 반전으로 혼합.
   13. 하룻밤 사이에 4 °C에서 혼합물을 배양하십시오.
   14. 원심분리기 샘플은 4°C에서 45분 동안 1,500 x g에서 샘플링합니다. 원심분리 후, 오프 화이트 펠릿이 보입니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 상복부을 조심스럽게 제거하십시오.
       참고: 모든 상체와 팁은 폐기 전에 10%의 표백제로 처리해야 합니다.
   15. 1mL의 DMEM에서 펠릿을 부드럽게 재일시 중지하여 10% FBS를 바이러스 육수로 보충하고 -80°C에 보관하십시오.
2. 안정적인 전감염 세포주 생성
   1. 종자 6 x 10⁶ GCSC는 100mm 페트리 접시에 10mL DMEM을 37°C에서 24시간 동안 10% FBS로 보충하고, 5% CO_2(감염 전 70-80% 합류).
   2. 접시에 배지를 흡인시키고, 폴리브레인 시약(5 μg/mL)을 함유한 완전한 DMEM 배지의 4mL로 희석된 농축 렌티바이러스 입자를 접시에 첨가한다. 37 °C에서 18 h, 5 % CO_2에대한 인큐베이션.
      참고: 폴리브레인의 최적 농도는 세포 유형에 따라 다르며 효과적인 농도를 결정하기 위해 다른 농도에서 테스트해야 할 수도 있습니다. 그렇지 않으면, 일반적으로 2-10 μg/mL의 범위에서 경험적으로 결정될 수 있다. 모든 튜브와 팁은 폐기 전에 10 %의 표백제로 처리해야합니다.
   3. 배지를 변경하고, 10% FBS 배지로 DMEM 10mL로 교체하고 37°C, 5% CO_2에서24시간 동안 배양한다.
      참고: 모든 매체와 팁은 폐기 전에 10%의 표백제로 처리해야 합니다.
   4. 셀 이물질과 슈퍼나탄을 흡인시키고, 퍼오마이신(2.5 μg/mL)을 함유한 10% FBS 배지로 보충된 신선한 DMEM으로 대체하고, 37°C에서 24시간, 5%_CO2로배양한다. 그런 다음 퍼오마이신(5 μg/mL)을 함유한 10% FBS 배지로 보충된 신선한 DMEM을 교체하고 37°C에서 배양하고, 5%_CO2를 추가로 24시간 동안 교체한다.
   5. 칼슘과 마그네슘없이 DPBS의 5 mL로 두 번 준수 GCSC를 헹구는.
   6. 전침전세포 해리용 1mL로 GCSC를 분리하고 37°C에서 2-3분 배양한다.
   7. 셀 서스펜션에 신선한 사전 따뜻해지는 GCSC 완전 배양 배지 5mL를 추가합니다.
   8. 세포를 보존하기 위한 15mL 원심관(tube A)에 3mL를 분배하고, 다른 3mL은 독시사이클린에 의해 유도하기 위한 15mL 원심관(tube B)으로 분배한다.
   9. 원심분리기 튜브 A와 튜브 B800 x g에서 5 분 동안.
   10. 혈청이 없는 냉동방비 배지1mL로 튜브 A의 펠릿을 회수하고, 바이알을 하룻밤 사이에 -80°C로 옮기고, 액체 질소 저장으로 제거한다.
   11. 초퍼를 흡인시키고 1mL의 새로운 사전 따뜻진 GCSC 완전 배양 배지에서 튜브 B의 세포를 재연한다. 10mL 의 새로운 100mm 페트리 접시에 적절한 수의 세포를 종자 10mL 신선한 사전 따뜻하게 한 GCSC는 독시 사이클린 (Dox) (2.5 μg /mL)를 가진 완전한 배양 배지를 완성하고 37 ° C에서 48 h, 5 % CO_2에서48 h에 대한 배양한다.
       참고: 독스의 최적 농도는 세포주 마다 다를 수 있습니다. 각 세포주 KD에 대 한 효과적인 농도 를 결정 하 고 세포에 독성에 대 한 다른 Dox 농도에서 테스트 해야 합니다.
   12. 서부 블로팅에 의해 GCSCs에서 클러스터진의 안정적인 억압을 확인합니다.

3. 구 형성 분석

1. 동결 유도 가능한 녹다운 GCSC 라인을 해동합니다(1.2단계 참조).
2. 자동 셀 카운터를 사용하여 10 μL 샘플의 실행 가능한 세포 밀도를 결정합니다.
3. 사전 따뜻하게 된 GCSC 완전한 배양 배지로 볼륨을 조정하여 2 x 10⁴ 실행 가능한 셀 /mL의 농도를 얻습니다.
4. 3 개의 새로운 96-잘 초저 부착 배양 플레이트 웰 (0.1 mL/웰) 각 그룹으로 분배합니다.
5. 37°C에서 5% CO_2로인큐베이터에서 세포를 배양한다. 구 형성은 3-10일 이내에 이루어져야 합니다. 2일마다 종양스피어 형성의 시각화를 모니터링하고 기록합니다.
   참고: 종양권 형성의 교란시 배지는 변경되지 않는 것이 좋습니다. 이 종양구는 단 하나 및 집합된 세포에서 쉽게 구별되어야 합니다.
6. 이미징 소프트웨어를 사용하여 형성된 종양구의 크기를 평가하여 종양권 형성 결과를 결정합니다.

결과

1차 인간 위암 줄기세포는 혈청이 없는 배양배지에서 배양되었다. 6일 후, 세포는 단일 세포와 같은 표현형(도1A)에서큰 구체(도1B)를형성하도록 확장하였다.

GCSC에서 클러스터진의 기능을 평가하기 위해 클러스터린및 스크램블에 대한 shRNA 서열은 위에서 설...

토론

GC는 전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인입니다. GCSC는 위암 재발, 전이 및 약물 내성에서 매우 중요합니다. 위암 환자로부터 GCSC를 사용하면 약점을 탐구하고 GC 환자의 치료를위한 표적 약물을 개발할 수 있습니다.

구형성 분석법은 체외에서 암 줄기세포 자가재생 잠재력을 검사하는 유용한 방법이다. 결과는 시드된 단일 세포의 원래 수로 나눈 구체의 백분율로 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1