JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تطبيق التوسع في الشفرة الوراثية لإدخال حمض أميني غير طبيعي يحمل مجموعة وظيفية بيولوجيا على بروتين حامل في موقع محدد. كما تستخدم وظيفة بيولوجياً في اقتران انتقائي للموقع من مستضد الكربوهيدرات لتوفير لقاح جليكوكونجوجيت متجانس.

Abstract

التوسع في الشفرة الوراثية هو أداة قوية لإدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAAs) في البروتينات لتعديل خصائصها، لدراسة أو إنشاء وظائف بروتينية جديدة أو الحصول على البروتين المتقارن. وقد برز وقف قمع كودون، ولا سيما قمع كودون العنبر، باعتبارها الطريقة الأكثر شعبية لإدخال UAAs وراثيا في المواقف المحددة. هذه المنهجية هي التي تطبق هنا لإعداد بروتين الناقل يحتوي على UAA إيواء مجموعة وظيفية bioorthogonal. ويمكن استخدام هذا المقبض التفاعلي بعد ذلك على وجه التحديد وكفاءة الكسب غير المشروع هابتين أوليغوساشاريد الاصطناعية لتوفير لقاح جليكوكونجيت متجانس. يقتصر البروتوكول على تخليق الجليكوكونجوتات في نسبة البروتين 1:1 الكربوهيدرات هابنت / الناقل ولكن قابلة لأزواج عديدة من المجموعات الوظيفية biorthogonal. التجانس لقاح الجليكوكونجوجيت هو معيار مهم لضمان توصيف كامل الفيزيائية الكيميائية، وبالتالي، تلبية أكثر وأكثر تطلبا توصيات وكالة تنظيم الأدوية، وهو المعيار الذي لا يتم تلبيتها من قبل استراتيجيات الاقتران الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يجعل من الممكن ضبط بنية اللقاح المترافق الفعلي بدقة، مما يؤدي إلى إنشاء أدوات لمعالجة العلاقات بين البنية والمناعة.

Introduction

وتشكل اللقاحات الجِليكونية عناصر أساسية في ترسانة اللقاحات المتاحة للمعالجة الوقائية للأمراض المعدية. فهي آمنة وجيدة التحمل وفعالة في فئة عمرية واسعة بما في ذلك الرضع الصغار. أنها توفر الدفاع الأمثل ضد العدوى الناجمة عن البكتيريا المنقلبة مثل المكورات السحائية، المكورات الرئوية أو الهيموفلوس الأنفلونزا نوع ب1. مصنوعة لقاحات جليكوكوكونجوجيت من السكريات البكتيرية النقية التي تشكل كبسولات من البكتيريا أو oligosaccharides الاصطناعية التي تحاكي هذه السكريات عبر السطح2، والتي ترتبط بقوة إلى البروتين الناقل. وجود بروتين الناقل أمر ضروري لتعزيز الاستجابات المناعية الحماية الموجهة ضد المحددات المضادة للحساسية التي أعرب عنها المستضدات الكربوهيدرات3. وبصرف النظر عن اختيار دقيق وإنتاج مستضد الكربوهيدرات، والميزات المعروفة لممارسة تأثير على فعالية لقاح جليكوكونجوت هي: طبيعة البروتين الناقل، والكيمياء الاقتران (بما في ذلك طبيعة وطول الرابط إذا استخدمت)، أو نسبة saccharide /البروتين3. ومن الواضح أن المواقف التي يتم فيها مترافق sacchargated إلى البروتين، فضلا عن عدد نقاط الاتصال ذات الصلة المناعية. حتى الآن، لم يتم دراسة هذين المعلمين لأن إعداد جليكوكونكونجات لا يزال تجريبيا إلى حد كبير. توليفها يعتمد عادة على استخدام وظائف أمين أو حمض الكربوكسيلي من, على التوالي, ليسين أو الأسبارتيك / حمض بقايا جانبية سلسلة موجودة على تسلسل البروتين الناقل. وهذا لا يؤدي إلى واحد ولكن إلى خليط غير متجانس من الجليكوكونجات.

اللعب على التفاعل، وإمكانية الوصول أو توزيع بقايا الأحماض الأمينية في البروتين يؤدي إلى زيادة تعريف glycoconjugates التي هي أكثر موثوقية لتوثيق تأثير اتصال سكريميد / البروتين4. ويمكن تحقيق خطوة إلى الأمام نحو هذا الهدف من خلال تطبيق البروتين glycan التكنولوجيا اقتران ، وهي عملية المؤتلفة التي تسمح لإنتاج لقاحات الجليكوكونجات الخاضعة للرقابة في مصانع الخلايا5،6. ومع ذلك، فإن جليكوسيليشن تجري حصرا في بقايا الهليون داخل D/EXNYS/T sequons (حيث X هو أي من أصل 20 الأحماض الأمينية الطبيعية)، وليس بشكل طبيعي على البروتينات الناقل.

يبدو أن الطفرات الانتقائية للموقع ولا سيما دمج السيشتاينات لاستغلال تفاعلها الشديد والانتقائي هو بديل7،8. ويمكن أن يوفر إنتاج البروتينات الحاملة التي تدمج UAAs في تسلسلها مرونة أكبر لإعداد لقاح جليكوكونجيت متجانس. وقد تم تطوير أكثر من 100 UAAs وأدرجت في مزيد من البروتينات المختلفة9،10. كثير منهم تحتوي على وظائف بيورثوغونال تستخدم عادة لتنفيذ التعديلات ما بعد الترجمة11 أو لالكسب غير المشروع تحقيقات الفيزياء الحيوية12 أو الأدوية13 ولكن التي هي مقابض مثالية لمزيد من الاقتران مع مستضدات الكربوهيدرات. وقد ادعى أمثلة ناجحة من قبل Biotech14 باستخدام تخليد البروتين خالية من الخلايا15 ولكن إعداد لقاحات جليكوكونجوجيت وفقا لهذه الاستراتيجية لا يزال ينتظر لتصبح شعبية.

تطبيق استراتيجية في الجسم الحي لإنتاج البروتين الناقل تحور يحتاج إلى تعديل الآلات التي تتضمن كودون محددة، وهرنا الاعتراف كودون و aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) التي تحفز على وجه التحديد نقل UAA على tRNA (الشكل 1)16. و pyrrolysine العنبر وقف قمع كودون هي واحدة من الأساليب الأكثر استخداما لدمج UAA، ولا سيما propargyl-lysine (PrK)17. يمكن أن تتفاعل هذه الأخيرة بدورها مع الهيمات الكربوهيدرات azido وظيفية لتوفير تعريف كامل, متجانسة الجليسكوكونكونجات. في هذه المخطوطة، نُصف كيفية توليف البرارججيل-إل-ليسين، وهو عبارة عن 1 UAA يحمل مقبض ألكين، وكيفية دمجه في البروتين المستهدف أثناء ترجمته في بكتيريا، وأخيراً كيفية إجراء الاقتران بين البروتين المعدل والهابتين الذي يحمل وظيفة أزيدية باستخدام كيمياء النقر.

Protocol

1. توليفة من UAA: propargyl-ليسين (PrK)

  1. توليف Nα-Boc-propargyl-lysine18
    1. قم بحل 500 ملغ من بوك-L-Lys-OH (2.03 مليمول) في خليط من صوديوم صوديوم مائي 1 M NaOH (5 مل) وTHF (5 مل) في قارورة وتناسب القارورة مع حاجز السيليكون.
    2. تبريد القارورة في حمام الثلج ثم إضافة 158 ميكرولتر من كلوروفورمات البرباراجيل (1.62 مليمول) قطرة (على مدى 2-3 دقيقة) باستخدام microsyringe أثناء التحريك.
    3. دافئة خليط التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة والاستمرار في اثارة لمدة 10 ساعة.
    4. تهدئة حلول 50 مل من الإيثر ديثيل، 50 مل من حمض الهيدروكلوريك مائي 1 M و 60 مل من خلات الإيثيل في حمام جليدي.
    5. يبرد خليط التفاعل الخام في حمام جليدي ويصب الخليط في قمع الفصل. استخراج الخليط مع 50 مل من الإيثر ديثيل. تجاهل الطبقة العضوية.
    6. إضافة بحذر مائي 1 M حمض الهيدروكلوريك إلى المرحلة المائية في قمع فصل. ثم استخراج طبقة مائي مرتين باستخدام 30 مل من خلات الإيثيل. تحقق من وجود N-Boc-propargyl-lysine في المرحلة العضوية بواسطة TLC باستخدام CH2Cl2-الميثانول (9:1) كما الوينت.
    7. جفف الطبقات العضوية مجتمعة على MgSO4،تصفية قبالة المرحلة الصلبة والتركيز على الترشيح تحت ضغط مخفض على المبخر الدوارة.
    8. قم بحل عينة من αNالنفطي الخام -Boc-propargyl-lysine في الكلوروفورم دياتيد (CDCl3)والتحكم في هويتها بواسطة 1H NMR.
      تنبيه: قد يؤدي الاستخراج إلى تراكم الضغط. الإفراج عن أي تراكم الضغط في كثير من الأحيان.
  2. تخليق من الأحماض الأمينية غير الطبيعية propargyl-L-ليسين (PrK)
    1. إدخال N α-Boc-propargyl-lysine في قارورة أسفل مستديرة مجهزة الحاجز.
    2. إضافة 4 مل من ثنائي كلورو الميثان اللامائية (CH2Cl2) إلى قارورة تحت الأرجون إلى حل α-Boc-propargyl-lysine.
    3. إضافة 4 مل من حمض ثلاثي الفلوراستيك (TFA) قطرة باستخدام حقنة أثناء التحريك.
    4. يحرك خليط التفاعل لمدة 1 ساعة في RT. راقب رد فعل TLC باستخدام CH2Cl2-الميثانول (9:1) كما رُحَل.
    5. تركيز خليط التفاعل تحت ضغط مخفض.
    6. إضافة ديثيل الأثير إلى بقايا الخام واحتضانه في 4 °C لمدة 1 ساعة لتعجيل PrK. عند العمل على نطاق أعلى، إذا لم يتم عجلت تماما PrK، triturate إلى التعجيل بها وتمديد وقت الحضانة إذا لزم الأمر.
    7. تصفية PrK في شكل صلبة بيضاء على الزجاج fritted.
    8. حل aliquot من PrK في D2O. ثم إجراء تحليلات NMR للسيطرة على هويتها ونقاوتها.
    9. لمزيد من الاستخدام، قم بحل الأحماض الأمينية غير الطبيعية PrK في الماء المقطر بتركيز نهائي من 100 mM وتخزينها عند -20 درجة مئوية كـ 1 مل aliquots.

2. إنتاج البروتين المؤتلف المعدلة من قبل PrK

  1. إعداد بلاسميد
    1. بناء تعبير بلاسميد (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHH) الذي يحتوي على الهدف ناضجة المكورات الرئوية التصاقه A (mPsaA) الجينات (mPsaA) pET24d-mPsa-WT) تليها فيروس احفر التبغ (TEV) تسلسل بروتياز عن طريق استنساخ إدراج بين مواقع القيد BAMHI و XhoI من pET24d plasmid. وهذا سوف يقدم له6 الوسم في سي- دلفينوس من البروتين. استبدل كودون من ليسين-32 بالكودون العنبر (TAG)، باستخدام تقنية الطفرات التقليدية الموجهة من الموقع.
    2. بناء تعبير ثان plasmid (pEVOL-MmPylRS) تحتوي على نسختين من الجين الترميز لa pyrrolysyl-tRNA synthetase من Methanosarcina mazei (MmPylRS) وث ترميز الجينات لبررنا المقابلة كما هو موضح سابقا19. استخدام هذا المناقل plasmid المصممة خصيصا، pEVOL، لدمج كفاءة من UAAs.
      ملاحظة: يتم وصف معلومات بلازميد مفصلة في ملف إضافي 1.
  2. التحول المشترك من البلازميدات إلى سلالة التعبير
    1. ذوبان 100 ميكرولتر aliquot من Escherichia المختصة كيميائيا القولونية BL21 (DE3) على الجليد لمدة 5 دقائق.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من كل بلازميد (50-100 نانوغرام من كل) في الخلايا واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    3. نقل 1.5 مل microtube مع الخلايا المختصة المذابة في حاضنة في 42 درجة مئوية لمدة 45 ث ومن ثم نقله مرة أخرى إلى الجليد لمدة 2 دقيقة.
    4. إضافة 900 μL من LB المتوسطة واحتضان تحت اهتزاز 1 ساعة في 37 درجة مئوية للسماح التعبير عن المضادات الحيوية. ثم قم بطبقة البكتيريا على LB agar مع 25 ميكروغرام / مل من الكاناميسين و 30 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول. السماح نمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. التعبير عن البروتينات المعدلة مع PrK
    1. تلقيح مستعمرة واحدة شارك في تحويلها في 5 مل من LB المتوسطة مع المضادات الحيوية (25 ميكروغرام / مل من kanamycin و 30 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
    2. تمييع الثقافة الأولية (5 مل) في 500 مل من لصناعة السيارات في الحث المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية، 0.02٪ من L-arabinose و 1 mM من الأحماض الأمينية غير الطبيعية PrK واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة 24 ح مع اهتزاز. وتشمل السيطرة السلبية من خلال تنفيذ الثقافة دون PrK بالتوازي والسيطرة الإيجابية من خلال تنفيذ ثقافة استنساخ تحتوي على البروتين wt.
    3. Aliquot 5 مل من أصل 500 مل ثقافة المتوسطة والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 5000 س ز. تجاهل عظمى وتجميد بيليه في -20 درجة مئوية. حصاد الخلايا من 495 مل المتبقية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 5000 × ز. تجاهل عظمى وتجميد بيليه في -20 درجة مئوية.
  4. تحليل مستخلصات الخلايا الخام من عينات ثقافة 5 مل من قبل SDS-PAGE وتحليل لطخة الغربية
    1. Resuspend 5 مل كريات الخلية في 250 ميكرولتر من العازلة تحلل (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4، 150 mM NaCl، pH 8، 5 mM imidazole، 0.2 mM PMSF) ونقلها إلى 1.5 مل microtube.
    2. خلايا اللاي عن طريق تجميد الأنابيب في النيتروجين السائل، ذوبان في حمام 42 °C ودوامة بسرعة عالية لمدة 30 s. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
    3. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 17،000 س ز لمدة 10 دقيقة لإزالة حطام الخلية.
    4. خذ 10 ميكرولتر من السوبر وإضافة 5 ميكرولتر من الماء و 5 ميكرولتر من العازلة التحميل (الأزرق البروموفينول، SDS، β-mercaptoethanol). سخني العينات لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية، ثم قم بإجراء تحليلات SDS-PAGE و لطخة لطخة غربية.
  5. تنقية البروتين عن طريق الجاذبية تدفق مقاعد البدلاء تقارب اللوني باستخدام حبات النيكل NTA
    1. Resuspend الكريات الخلية (من ثقافة 495 مل) في 20 مل من العازلة تحلل (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4، 150 mM NaCl، pH 8، 5 mM imidazole، 0.2 mM PMSF).
    2. إضافة 5 ميكرولتر من DNase I (1 ملغ / مل) و 500 ميكرولتر من lysozyme (50 ملغ / مل) في التعليق والسماح للتحلل عن طريق احتضان التعليق في 37 درجة مئوية خلال 30 دقيقة.
    3. سونيكات الخلايا خلال 5 دقائق (دورات من 5 s-5 s، السعة 50٪) ثم إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20،000 س ز لمدة 30 دقيقة تليها الترشيح على مرشح 0.45 ميكرومتر.
    4. إضافة ني NTA الراتنج إلى التعليق (500 μL ل 500 مل من ثقافة الخلية) ومزيج بلطف في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    5. صب التعليق في عمود البولي بروبلين وجمع كسر غير منضم.
    6. غسل الراتنج مع 10 مل من العازلة الغسيل التي تحتوي على 50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4، 150 mM NaCl، 10 mM imidazole. غسل الراتنج مرة ثانية مع 5 مل من العازلة الغسيل (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4، 150 mM NaCl ، 20 mM imidazole). جمع كسور الغسيل.
    7. Elute البروتين له الموسومة مع 1 مل من عازلة elution (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole). كرر هذه الخطوة 4 مرات وجمع كل الكسور elution.
    8. تحليل lysate الخام وكذلك 7 كسور تنقية من قبل SDS-PAGE على هلام الاكريلاميد 12٪.
    9. الجمع بين الكسور التي تحتوي على البروتين النقي الموسومة له و dialyze ضد 1 L من TEV protease العازلة (50 mM تريس-HCl، 0.5 mM EDTA، الرقم الH 8) بين عشية وضحاها باستخدام غشاء غسيل الكلى (قطع MW 6000-8000 دا). قياس تركيز البروتين في 280 نانومتر مع معامل الانقراض الضرس من 37 360 سم-1• M-1 والوزن الجزيئي من 34.14 كيلو أمبير لmPsaA.

3. إزالة علامة الهستيدين من قبل هضم التيفي بروتياز

  1. جمع عينة البروتين في أنبوب 50 مل وإضافة TEV العازلة (50 mM تريس HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) تصل إلى 1 مل بتركيز 2 ملغ / مل.
    ملاحظة: قد يختلف التركيز وفقًا للنتائج السابقة. تركيزات البروتين التي قمنا باختبارها هي في مجموعة نموذجية 2-3 ملغ / مل.
  2. أضف 100 ميكرولتر من بروتين تييف (أضف 1 ميكرولتر تحتوي على 10 وحدات من بروتين TEV مقابل 20 ميكروغرام من البروتين لهضمه).
  3. إضافة 50 ميكرولتر من 0.1 M ثنائي الانبعاثات (DTT).
  4. كاملة مع TEV العازلة (50 mM تريس HCl، 0.5 mM EDTA، pH 8) تصل إلى 5 مل.
  5. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع اهتزاز بطيء.
    ملاحظة: إذا لم يكتمل الهضم، أضف المزيد من البروتيز TEV، أو احتضانه لفترة أطول أو في درجة حرارة أعلى تصل إلى 30 درجة مئوية.
  6. Dialyze البروتين هضم لإزالة EDTA في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام غشاء غسيل الكلى (قطع 6000-8000 دا) ضد العازلة الفوسفات (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mm imidazole).
  7. للقضاء على بروتياز TEV والبروتين غير المهضوم، احتضان المزيج مع حبات ني-NTA ومزيج بلطف لمدة 1 ساعة في 4 °C.
  8. صب التعليق في عمود البولي بروبلين. جمع كسر غير منضم وغسل العمود مع 5 مل من العازلة الغسيل (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4، 150 mM NaCl ، 10 mM imidazole)
    ملاحظة: يجب استرداد البروتين من الفائدة في الكسور غير منضم وغسل.
  9. Elute بروتياز TEV والبروتين غير مهضومة بإضافة 5 مل من عازلة elution (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) على العمود. تحقق من الكسور لمحتويات البروتين في 280 نانومتر وبتحلي تحليل SDS-PAGE.
  10. تحقق من كفاءة الهضم عن طريق تحميل العينات المهضمة على صفحة SDS مع البروتين غير المهضوم كتحكم.
  11. Dialyze البروتين هضم ضد 1 لتر من فوق العازلة (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4، pH8) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع غشاء غسيل الكلى (قطع 6000-8000 دا) لإزالة imidazole وكذلك لتبادل العازلة ، وقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر مع معامل الانقراض الضرس والوزن الجزيئي للmPsa (37 360 سم-1• M-1 و MW 34.14 كيلوآت).

4. تقييم غير طبيعي من الأحماض الأمينية propargyl-ليسين إمكانية الوصول والوظائف للكيمياء انقر

ملاحظة: اقارن بين mPsaA مع 6-سداسية-فلوريسين-أزيد باستخدام البروتوكول الذي وصفه Presolski وآخرون20 للكيمياء فوق.

  1. خذ 432.5 ميكرولتر من البروتين المتحول بـ PrK بتركيز 57.8 ميكرومتر في أنبوب ميكروتيوم 2 مل.
    ملاحظة: الحد الأدنى للتركيز 2 μM من ألكين هو مقبول. إذا كان تركيز البروتين أقل، ركز مع تركيز الطرد المركزي أو تفضيل توازن التفاعل عن طريق زيادة نسبة المولى أزيد/ألكين.
  2. أضف 10 ميكرولتر من 5 مل 6-6-سداسي كلورو-فلوريسين-أزيم، ثم أضف مزامل 2.5 ميكرولتر من محلول CuSO4 في 20 mM و7.5 ميكرولتر من تريس (benzyltriazolylmethyl) amine (THPTA) في 50 mm (تركيزات حلول الأسهم).
    1. إضافة 25 ميكرولتر من مائي 100 mM أمينوغواندين هيدروكلوريد.
    2. إضافة 25 μL من 20 ملغ / مل حل مائي إعداد extemporaneously من أسكوربات الصوديوم.
    3. أغلق الأنبوب، اخلطه عن طريق عكس عدة مرات واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    4. وقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
    5. خذ 15 ميكرولتر من خليط التفاعل وضعه microtube، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة التحميل (الأزرق بروموفينول، SDS، β-mercaptoethanol)، تسخين الخليط في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومن ثم تحميله في هلام أكريلاميد 12٪. بعد الهجرة، تصور المترافق الفلورسنت على الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 312 نانومتر.

5. الاقتران من mPsaA مع مستضد الكربوهيدرات azido وظيفية (Pn14TS-N3)عن طريق انقر فوق الكيمياء

  1. اقتران
    1. خذ 432.5 ميكرولتر من البروتين المتحول بـ PrK عند 57.8 ميكرومتر في أنبوب ميكروتي 2 مل.
    2. أضف 10 ميكرولتر من 5 mM Pn14TS-N321 في الماء ثم إضافة بريميكس من 2.5 ميكرولتر من محلول CuSO4 في 20 mM و 7.5 ميكرولتر من THPTA في 50 mM.
      ملاحظة: التوليف من Pn14TS-N3، وهو رباعي الaccharide محاكاة العقدية ذات النمط المصلي المصلي 14 capsular السكريات ، وقد وصفت في المرجع 21. نظريا, أي مستضد الكربوهيدرات التي تحتوي على وظيفة أزيدي يمكن استخدامها.
    3. إضافة 25 μL من 100 mM أمينوغواندين هيدروكلوريد.
    4. إضافة 25 ميكرولتر من 20 ملغم / مل extemporaneously محلول مائي من أسكوربات الصوديوم.
    5. أغلق الأنبوب، اخلطه عن طريق عكس عدة مرات واحتضانه في RT خلال 2 ساعة.
    6. وقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
    7. أخذ 15 ميكرولتر من العينات وتحليلها بواسطة SDS-PAGE.
  2. تنقية هلام من جليكوكونجوجيت
    1. تنقية glycoconjugate عن طريق تطبيقه على العمود agarose استبعاد steric (15 × 600 أبعاد السرير، 3000-70،000 نطاق تجزئة)، توازن مع 100 mM PBS العازلة، وhh 7.3 في تدفق 0.8 مل / دقيقة مع الكشف عن 280 نانومتر.
    2. جمع الكسور التي تحتوي على glycoconjugate.
      ملاحظة: للتخزين لفترات طويلة، dialyze glycoconjugate ضد 1 لتر من H2O مرتين لمدة 2 ساعة ثم بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية باستخدام غشاء غسيل الكلى (قطع Mw 6000-8000 Da)، ثم تجميد الجافة وتخزين glycoconjugate في -80 درجة مئوية.

النتائج

في هذا المشروع، تم إعداد لقاح جليكوكونجوجيت متجانس باستخدام استراتيجية قمع كودون وقف العنبر لإدخال UAA في موقع محدد(الشكل 1). تم اختيار الالتصاق سطح Pneumoccocal A كـ moiety البروتين الناقل. هذا البروتين هو الحفاظ عليها للغاية والتي أعرب عنها من قبل جميع سلالات من ...

Discussion

إن الطفرات الموجهة للموقع هي استراتيجية مباشرة لدمج أحماض أمينية محددة في موضع محدد للبروتين الذي لا يزال بالكاد يستخدم بهدف إعداد لقاحات جليكوكونجوجيت7،8،14. الطفرات الكلاسيكية على أساس نهج 20 الأحماض الأمينية الطبيعية كفاءة عالية منذ ل?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

E.C. يعرب عن امتنانه للدعم المالي المقدم من La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt")، ولا سيما زمالة الدكتوراه في برنامج T.V. كما نُقرّ الدكتور روبرت ب. كواست (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, تولوز, فرنسا) لنصائحه الفنية الثمينة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AIM (autoinductif medium)FormediumAIMLB0210Solid powder
Boc-Lys-OHAlfa-AesarH63859Solid powder
BL21(DE3)Merck Novagen69450E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resinMachery NagelProtinoNi-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHthis studysame as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WTthis studypET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmidgift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformateSigma-Aldrich460923Liquid
SonicatorThermo FisherFB120-220

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166 conjugation propargyl l Lysine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved