Однородный гликоконъюгированный, производимый комбинированной неестественной аминокислотной инкорпорацию и нажмите-химию для целей вакцины

Резюме

Генетическое расширение кода применяется для введения неестественной аминокислоты, несущей биоргононо-функциональную группу на несущем белке в определенном месте. Биортогональная функция далее используется для селективного соединения углеводного антигена для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины.

Аннотация

Расширение генетического кода является мощным инструментом для внедрения неестественных аминокислот (УА) в белки для изменения их характеристик, изучения или создания новых белковых функций или доступа к протеиновым конъюгратам. Остановить подавление кодона, в частности подавления янтарного кодона, стало самым популярным методом генетического внедрения БПЛА на определенных позициях. Эта методология применяется к подготовке несущего белка, содержащего UAA укрывательство биоортогональной функциональной группы. Эта реактивная ручка может быть использована для конкретного и эффективного прививки синтетического олигосахарида hapten для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины. Протокол ограничен синтезом гликоконъюгатов в соотношении белка 1:1 углеводов, но податлив к многочисленным парам биортогональных функциональных групп. Гликококонджгейт однородность вакцины является важным критерием для обеспечения полной физико-химической характеристики, тем самым удовлетворяя все более и более требовательные рекомендации агентства по регулированию лекарственных препаратов, критерий, который не удовлетворяется классическими стратегиями спряжения. Кроме того, этот протокол позволяет точно настроить структуру фактической конъюгации вакцины, что дает возможность использовать инструменты для решения отношений между структурой и иммуногенностью.

Введение

Гликоконъюгированные вакцины являются важными элементами арсенала вакцин, доступного для профилактического лечения инфекционных заболеваний. Они безопасны, хорошо переносятся и эффективны в широкой возрастной группе, включая маленьких детей. Они обеспечивают оптимальную защиту от инфекций, вызванных капсулированных бактерий, таких как менингококк, пневмококк или гемофильные грипп типа b¹. Гликоконъюгированные вакцины сделаны из очищенных бактериальных полисахаридов, которые образуют капсулы бактерий или синтетических олигосахаридов, которые имитируют эти поверхностно выраженные^{полисахариды 2}, которые ковалентно связаны с белками перевозчика. Наличие белка перевозчика имеет важное значение для содействия защитной гуморальной иммунной реакции, направленной против антигенного детерминанта, выраженного углеводных^{антигенов 3}. Помимо тщательного отбора и производства углеводного антигена, функции, как известно, оказывают влияние на эффективность вакцины гликоконъюгации являются: природа белка перевозчика, спряжение химии (в том числе характер и длина связующим звеном при использовании), или сахарид / соотношение^{белка 3}. Очевидно, что позиции, при которых сахарид спрягаются с белком, а также количество точек подключения имеют отношение к иммуногенности. На сегодняшний день эти два параметра практически не изучены, поскольку подготовка гликоконъюгатов остается в основном эмпирической. Их синтез обычно опирается на использование амина или карбоксилиновой кислоты функции, соответственно, лизина или аспарагиновой / глутамической кислоты боковой цепи остатков, присутствующих на последовательности белка перевозчика. Это приводит не к одному, а к неоднородной смеси гликоконъюгатов.

Игра на реактивности, доступности или распределении аминокислотных остатков в белке приводит к более определенным гликоконъюгатам, которые являются более надежными для документирования эффекта сахарид/белковой связи⁴. Шаг вперед к этой цели может быть достигнут путем применения технологии соединения белка гликан, рекомбинантный процесс, который позволяет производство контролируемых гликоконъюгированных вакцин на клеточных^{фабриках 5,6}. Тем не менее, гликозиляция происходит исключительно на аспарагин остаток в D / EXNYS / T sequons (в котором X любой из 20 природных аминокислот), естественно, не присутствует на несущей белков.

Сайт селективного мутагенеза и, в частности, включение цистеин для использования их высокой и селективной реактивности появляется^{в качестве альтернативы 7,8}. Производство белков-носителей, включающих БПЛА в их последовательность, может предложить еще большую гибкость для однородного гликоконъюгирования вакцины. Более 100 БПЛА были разработаны и дополнительно включены в различные белки^9,10. Многие из них содержат биоортогональные функции, обычно используемые для выполнения постреакционных^{модификаций 11 или} для прививки^{биофизических зондов 12 или препаратов 13,} но которые являются идеальными ручками для дальнейшего спряжения с углеводными антигенами. Успешные примеры были заявлены Biotech^{14 с использованием} клеточного синтеза^{белка 15,} но подготовка гликоконъюгированных вакцин в соответствии с этой стратегией все еще ждет становится популяризировал.

Применение стратегии in vivo для производства мутировавшего белка перевозчика нуждается в модифицированном переводном механизме, который включает в себя конкретный кодон, тРНК, распознающий кодон, и синтетазы аминоакил-тРНК (aaRS), который специально катализирует передачу UAA на тРНК (Рисунок 1)¹⁶. Пирролизин янтаря остановить подавление кодона является одним из наиболее широко используемых методов для включения UAA, в частности, пропаргил-лизин (PrK)¹⁷. Последние, в свою очередь, могут реагировать с азидо-функциональными углеводными haptens обеспечить полностью определенные, однородные гликоконъюгаты. В настоящей рукописи мы описываем, как синтезировать пропаргиль-L-лизин, UAA проведения алкин ручкой, как включить его в целевой белок во время его перевода в бактерии и, наконец, как выполнить спряжение между модифицированным белком и hapten проведения функции азида с помощью щелчка химии.

протокол

1. Синтез УАА: пропаргыл-лизин (PrK)

1. Синтез N^α-Boc-propargyl-lysine¹⁸
   1. Растворите 500 мг Boc-L-Lys-OH (2,03 ммоль) в смеси aqueous 1 M NaOH (5 мл) и THF (5 мл) в колбе и поместить колбу с кремниевой перегородкой.
   2. Охладить колбу в ледяной ванне, а затем добавить 158 л пропаргилового хлороформата (1,62 ммоль) dropwise (в течение 2-3 мин период) с помощью микросыринга при перемешивании.
   3. Разогреть реакционной смеси до комнатной температуры и продолжать помешивая в течение 10 ч.
   4. Охладить растворы 50 мл диэтил эфира, 50 мл аквеозной 1 М соляной кислоты и 60 мл этилового ацетата в ледяной ванне.
   5. Охладить сырую реакционной смесь в ледяной ванне и вылить смесь в разделительную воронку. Извлекайте смесь с 50 мл диетил эфира. Откажитесь от органического слоя.
   6. Осторожно добавьте аквеозную 1 М соляную кислоту в aqueous фазу в разделительной воронке. Затем извлекайте аковый слой дважды с помощью 30 мл этилового ацетата. Проверить наличие N-Boc-пропаргил-лизин в органической фазе TLC с помощью CH₂Cl₂-метанол (9:1) в качестве элюента.
   7. Высушите комбинированные органические слои над MgSO_4,отфильтруй твердую фазу и сконцентрируй фильтрат под пониженным давлением на роторный испаритель.
   8. Растворите образец сырой жирной N^α-Boc-propargyl-lysine в детерированной хлороформе (CDCl₃) и контролировать его ^{идентичность на 1}НМР.
      ВНИМАНИЕ: Извлечение может привести к наращиванию давления. Освобождение любого давления накопления часто.
2. Синтез неестественной аминокислоты пропаргил-Л-лизин (PrK)
   1. Ввести N^α-Boc-propargyl-lysine в круглой нижней колбе, оснащенной перегородкой.
   2. Добавьте 4 мл ангидроус-дихлорметана (CH₂Cl₂) в колбу под аргоном, чтобы^{растворить}N α-Boc-propargyl-lysine.
   3. Добавьте 4 мл трифтороацептной кислоты (TFA) с помощью шприца при перемешивании.
   4. Перемешать реакционной смеси в течение 1 ч на RT. Мониторинг реакции TLC с помощью CH₂Cl₂-метанол (9:1) в качестве элюента.
   5. Сосредоточьте реакционной смеси под пониженным давлением.
   6. Добавить диэтил эфира в сырой остаток и инкубировать его при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы осадки PrK. При работе в более высоком масштабе, если PrK не полностью осаждается, тритурат, чтобы вызвать его и продлить время инкубации, если это необходимо.
   7. Фильтровать PrK в виде белого твердого тела на fritted-стекло.
   8. Растворите алицит PrK в D₂O. Затем провести анализ НМР, чтобы контролировать его идентичность и чистоту.
   9. Для дальнейшего использования растворите неестественную аминокислоту PrK в дистиллированной воде в конечной концентрации 100 мМ и храните при -20 градусах Цельсия в качестве 1 мл aliquots.

2. Производство рекомбинантного белка, модифицированного PrK

1. Плазмидная подготовка
   1. Построить выражение плазмид (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYF-HHHHHHHH), который содержит целевой зрелый пневмококковый поверхностный адхесин A (mPsaA) ген (mPsaA) pET24d-mPsa-WT), за которым следует последовательность протеазы вируса табака Etch (TEV), клонирование вставки между местами ограничения BamHI и XhoI плазмид pET24d. Это введет его₆ тегов на C-терминуса белка. Замените кодон лизина-32 на янтарный кодон (TAG), используя обычную технику мутагенеза, направленную на сайт.
   2. Создайте вторую плазмиду экспрессии (pEVOL-MmPylRS), содержащую две копии генного кодирования для пирролизил-тРНК-синтетазы от Methanosarcina mazei (MmPylRS) и кодирования генов для соответствующего tRNA^Pyr, как^{описано ранее 19}. Используйте этот специально разработанный плазмидный вектор, pEVOL, для эффективного включения БПЛА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о плазмидах описана в дополнительном файле 1.
2. Совместное преобразование плазмидов в экспрессионный штамм
   1. Оттепель 100 йл aliquot химически компетентных Escherichia coli BL21 (DE3) на льду в течение 5 мин.
   2. Добавьте 1 йл каждой плазмиды (50-100 нг каждая) в клетки и инкубировать в течение 30 минут на льду.
   3. Перенесите микротрубки 1,5 мл с размороженными компетентными клетками в инкубатор при 42 градусов по Цельсию на 45 градусов, а затем перемести его обратно на лед в течение 2 минут.
   4. Добавьте 900 л среды LB и инкубировать под встряхивания в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию, чтобы выражение антибиотиков. Затем пластины бактерий на LB агар с 25 мкг / мл канамицина и 30 мкг / мл хлорамфеникол. Разрешить рост бактерий в одночасье при 37 градусов по Цельсию.
3. Выражение белков, модифицированных с помощью PrK
   1. Прививка одной совместно преобразованной колонии в 5 мл ЛБ среды с антибиотиками (25 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл хлорамфеникол). Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской.
   2. Разбавить первичную культуру (5 мл) в 500 мл автоматической индукционной среды, содержащей антибиотики, 0,02% L-арабинозы и 1 мМ неестественной аминокислоты PrK и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение 24 ч при встряхивании. Включите отрицательный контроль, выполняя культуру без PrK параллельно и положительный контроль, выполняя культуру клона, содержащего белок wt.
   3. Aliquot 5 мл из 500 мл среды культуры и центрифуги в течение 10 мин при 5000 х г. Откажитесь от супернатанта и заморозьте гранулы при -20 градусов по Цельсию. Урожай клеток из оставшихся 495 мл центрифугации в течение 10 мин при 5000 х г. Откажитесь от супернатанта и заморозьте гранулы при -20 градусов по Цельсию.
4. Анализ экстрактов сырых клеток из образцов культуры 5 мл SDS-PAGE и западного анализа Blot
   1. Resuspend 5 мл клеточных гранул в 250 мкл буфера лиза (50 мМ На₂HPO₄/₂PO₄, 150 мМм NaCl, рН 8, 5 мм имидазол, 0,2 мММ PMSF) и передать его в 1,5 мл микротрубки.
   2. Лизе-клетки, замораживая трубки в жидком азоте, оттаивание его в ванне 42 градусов по Цельсию и вихри на высокой скорости в течение 30 с. Повторите этот шаг 3 раза.
   3. Образцы центрифуги на 17000 х г в течение 10 мин для устранения клеточного мусора.
   4. Возьмите 10 МКЛ супернатанта и добавьте 5 МКЛ воды и 5 МКЛ погрузочного буфера (бромофено-голубой, SDS, β-меркаптоэтанол). Нагрейте образцы в течение 5 минут при температуре 100 градусов по Цельсию и провести SDS-PAGE и западный анализ Blot.
5. Очистка белка гравитационным потоком-скамейка сродство хроматографии с использованием никель-NTA бисера
   1. Перезапись клеточных гранул (из культуры 495 мл) в 20 мл лиза буфера (50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 мМн NaCl, рН 8, 5 мм имидазол, 0,2 мММ PMSF).
   2. Добавьте в суспензию 5 л DNase I (1 мг/мл) и 500 мкл лизозима (50 мг/мл) и дайте лизу прорезать суспензию при 37 градусах Цельсия в течение 30 мин.
   3. Sonicate клетки в течение 5 мин (циклы 5 с-5 с, амплитуда 50%) а затем удалить клеточный мусор путем центрифугации на 20000 х г в течение 30 мин с последующим фильтрацией на 0,45 мкм фильтра.
   4. Добавьте смолу Ni-NTA в суспензию (500 мкл за 500 мл клеточной культуры) и аккуратно перемешайте при 4 градусах Цельсия в течение 1 ч.
   5. Налейте суспензию в полипропиленовую колонку и соберите несысяную фракцию.
   6. Вымойте смолу 10 мл стирального буфера, содержащего 50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO_4,150 мМ NaCl, 10 мм имидазола. Вымойте смолу во второй раз с 5 мл стирального буфера (50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 мМ NaCl, 20 мм имидазол). Соберите фракции для мытья.
   7. Elute его помеченный белок с 1 мл элюционного буфера (50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 мМ NaCl, 300 мм имидазол). Повторите этот шаг 4 раза и соберите все фракции elution.
   8. Проанализируйте сырой лисат, а также 7 фракций очистки SDS-PAGE на 12% акриламидный гель.
   9. Объедините фракции, содержащие чистый белок с тегами Его, и облизтете его против 1 Л буфера протеазы TEV (50 мМ Трис-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8) на ночь с помощью диализной мембраны (отрезанный МВт 6000-8000 Да). Измерьте концентрацию белка на уровне 280 нм с коэффициентом вымирания моляров 37 360^{см -1М -1} и молекулярным весом 34,14 кДа для MPsaA.

3. Удаление гистидина теги TEV протеазы пищеварения

1. Соберите образец белка в трубку 50 мл и добавьте буфер TEV (50 мМ Tris HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8) до 1 мл при концентрации 2 мг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация может варьироваться в зависимости от предыдущих результатов. Концентрации белка, которые мы проверили, находятся в типичном диапазоне 2-3 мг/мл.
2. Добавьте 100 МКЛ протеазы TEV (добавьте 1 йл, содержащий 10 единиц протеазы TEV для 20 мкг белка, чтобы переварить).
3. Добавьте 50 МКЛ из 0,1 М дитиотрейтол (DTT).
4. В комплекте с буфером TEV (50 мМ Трис HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8) до 5 мл.
5. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию с медленной тряской.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если пищеварение не завершено, добавьте больше протеазы TEV, инкубировать в течение более длительного времени или при более высокой температуре до 30 градусов по Цельсию.
6. Диализ переваренного белка для удаления ЭДТА при 4 градусах Цельсия на ночь с помощью диализной мембраны (отрезание 6000-8000 Да) против фосфатного буфера (50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 5 мМ имидазол).
7. Чтобы исключить протеазу TEV и непереваренный белок, инкубировать смесь с бисером Ni-NTA и аккуратно перемешать в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия.
8. Налейте подвеску в полипропиленовую колонку. Соберите несырья фракции и мыть колонку с 5 мл стирального буфера (50_мМНа 2 HPO₄/₂PO₄, 150 мМ НаКл, 10 мм имидазол)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белок интереса должен быть восстановлен в неограниченных и стиральных фракций.
9. Elute TEV protease и непереваренный белок, добавив 5 мл буфера элюции (50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 мм имидазола) на колонне. Проверьте фракции на содержание белка на 280 нм и SDS-PAGE анализа.
10. Проверьте эффективность пищеварения, загрузив переваренные образцы на SDS PAGE с непереваренным белком в качестве контроля.
11. Диализ переваренного белка против 1 л клика буфера (50 мМ На₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH8) при 4 градусов по Цельсию ночь с диализной мембраны (отрезание 6000-8000 Da), чтобы удалить имидазол, а также для обмена буфера, и измерить концентрацию белка на уровне 280 нм с коэффициентом вымирания моляров и молекулярным весом MPsaA (37 360 см^{-1м -1} и МВт 34,14 кДа).

4. Оценка неестественной аминокислоты пропаргил-лизин доступности и функциональности для нажмите химии

ПРИМЕЧАНИЕ: Спрягать MPsaA с 6-hexachloro-fluorescein-азид с помощью протокола, описанного Presolski и др.²⁰ для нажмите химии.

1. Возьмите 432,5 МКЛ мутировавшего белка prK в концентрации 57,8 МКМ в микротрубку 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная концентрация 2 МК алкин является приемлемым. Если концентрация белка ниже, сосредоточьте его с центробежным концентратором или в пользу баланса реакции, увеличив соотношение азид/алкин моляр.
2. Добавьте 10 л 5 мМ 6-хексахлоро-флуоресцеин-азид, а затем добавьте премикс 2,5 л раствора CuSO₄ на 20 мм и 7,5 л триса (бензилтриазоллметил) амина (THPTA) при концентрации 50 мМ (концентрации фондовых растворов).
   1. Добавьте 25 мкл аквея 100 мМ аминогуанидина гидрохлорид.
   2. Добавьте 25 л 20 мг/мл в экземпоранно подготовленный аквейный раствор аскорбата натрия.
   3. Закройте трубку, перемешайте несколько раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч.
   4. Остановите реакцию, добавив 50 МКЛ 0,5 М EDTA.
   5. Возьмите 15 МКЛ реакционной смеси и положите ее на микротрубку, добавьте 5 МКЛ погрузочного буфера (бромофенол синий, SDS, β-меркаптоэтанол), нагрейте смесь при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем загрузите ее в 12% акриламидный гель. После миграции визуализуйте флуоресцентный конъюг на гель под ультрафиолетовым светом на 312 нм.

5. Спряжение MPsaA с азидо-функционализированным углеводным антигеном (Pn14TS-N₃) одним щелчком мыши химии

1. Муфта
   1. Возьмите 432,5 МКЛ мутировавшего белка при 57,8 МКМ в микротрубку 2 мл.
   2. Добавьте 10 л 5 мМ Pn14TS-N₃^{21 в} воду, затем добавьте премикс 2,5 л раствора CuSO₄ на 20 мм и 7,5 л THPTA на 50 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез Pn14TS-N₃, тетрасахарид имитирует Streptococcus пневмонии серотип 14 капсульный полисахарид, был описан в ссылке 21. Теоретически, любой углеводный антиген, содержащий функцию азида, может быть использован.
   3. Добавьте 25 мкл из 100 мМ аминогуанидина гидрохлорид.
   4. Добавьте 25 л 20 мг/мл extemporaneously подготовленный aqueous раствор аскорбат натрия.
   5. Закройте трубку, перемешайте несколько раз и инкубировать на RT в течение 2 ч.
   6. Остановите реакцию, добавив 50 МКЛ 0,5 М EDTA.
   7. Возьмите 15 МКЛ образцов и проанализируйте SDS-PAGE.
2. Очистка гель фильтрации гликоконъюгата
   1. Очистите гликоконъюг, применив его к столбец агарозы стерического исключения (15 х 600 размеров кровати, 3000-70000 диапазон фракции), equilibrated с 100 мМ. PBS буфер, рН 7,3 на 0,8 мл / мин потока с обнаружением на 280 нм.
   2. Соберите фракции, содержащие гликоконъюг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения, диализ гликоконъюгации против 1 л H 2 O_дваждыв течение 2 ч, а затем на ночь при 4 градусов по Цельсию с помощью диализной мембраны (отрезанные Mw 6000-8000 Da), а затем заморозить сухой и хранить гликоконъюг при -80 градусов по Цельсию.

Результаты

В этом проекте, однородная вакцина гликоконъюгат был подготовлен с использованием стратегии подавления остановки янтаря кодона ввести UAA на определенном сайте (Рисунок 1). Пневмоккокал поверхности адхезин А был выбран в качестве носителя белка moiety. Эт?...

Обсуждение

Сайт-направленный мутагенез является простой стратегией для включения конкретных аминокислот в определенном положении белка, который остается едва используется с целью подготовки^{гликоконъюгированных вакцин 7,8,14}. Классический мутаг...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220