JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف طريقة لتحفيز جذور شعر من قبل Agrobacterium rhizogenes-بوساطة التحول في الحنطة السوداء Tartary(Fagopyrum tataricum). ويمكن استخدام هذا للتحقيق في الوظائف الجينية وإنتاج الأيض الثانوي في الحنطة السوداء الطرطرية، أو اعتمادها لأي تحول وراثي، أو استخدامها للنباتات الطبية الأخرى بعد التحسين.

Abstract

الحنطة السوداء الطرتارية (السل)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] تمتلك مختلف الأنشطة البيولوجية والدوائية لأنه يحتوي على الأيض الثانوية وفيرة مثل الفلافونويدات، وخاصة روتين. وقد استخدمت الجذور الزراعية البكتريا تدريجيا في جميع أنحاء العالم للحث على جذور شعر في النباتات الطبية للتحقيق في وظائف الجينات وزيادة غلة الأيض الثانوية. في هذه الدراسة، وصفنا طريقة مفصلة لتوليد جذور مشعرة بوساطة A. رهيزوجيناتفي السل. تم اختيار Cotyledons ومحور تحت تأثير الحمل في 7-10 أيام كنباتات خارجية ومصابة بـ A. rhizogenes تحمل ناقلًا ثنائيًا ، مما أدى إلى جذور شعر ية مُرعرة مُرقدة ظهرت بعد أسبوع واحد. تم تحديد التحول الجذر المشعر المتولد على أساس مورفولوجيا، واختيار المقاومة (kanamycin)، والتعبير الجيني المراسل (بروتين الفلورسنت الأخضر). في وقت لاحق، تم نشر الجذور المشعرة المتحولة ذاتيا على النحو المطلوب. وفي الوقت نفسه، تم تحويل عامل النسخ mymyB116، إلى الجينوم السل باستخدام جذور مشعرة بوساطة A. رهيزوجيناتللتحقق من دور FtMYB116 في توليف الفلافونويدات. وأظهرت النتائج أن التعبير عن الجينات ذات الصلة بالفلافونويد وغلة مركبات الفلافونويد (الروتين والكيرسيتين) كانت بشكل كبير (p < 0.01) التي روجت لها FtMYB116، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام جذور مشعرة بوساطة الرهيزوجيناتكأداة بديلة فعالة للتحقيق في الوظائف الجينية وإنتاج الأيض الثانوي. يمكن اعتماد البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة الموصوفة في هذه الدراسة لتوليد جذور شعر لأي تحول وراثي أو غيرها من النباتات الطبية بعد التعديل.

Introduction

الحنطة السوداء الطرتاري (السل)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) هو نوع من dicotyledon ينتمي إلى جنس Fagopyrum والأسرة Polygonaceae1. ويحظى السل، بوصفه نوعاً من الأغذية المتجانسة للطب الصيني، باهتمام كبير بسبب تكوينه الكيميائي المميز وأنشطته البيولوجية المتنوعة ضد الأمراض. السل غني في المقام الأول بالكربوهيدرات والبروتينات والفيتامينات والكاروتينات وكذلك في البوليفينول مثل الأحماض الفينولية والفلافونويدات1. وقد أظهرت مختلف الأنشطة البيولوجية والدوائية من الفلافونويدات، بما في ذلك مضادات الأكسدة، خافض للضغط2،والمضادة للالتهابات، فضلا عن خصائص مضادة للسرطان ومضادة للسكري،3.

Agrobacterium rhizogenes هي بكتيريا التربة التي تساهم في تطوير مرض الجذر شعر في العديد من النباتات أعلى، وخاصة dicotyledons، عن طريق إصابة مواقع الجرح4،,5. هذه العملية بدأت من خلال نقل T-DNA في الجذر تحريض (Ri) plasmid5،6 وعادة ما يرافقه التكامل والتعبير عن الجينات الخارجية من البلازميد ري والخطوات اللاحقة لتوليد الورم الجذر شعر7. A. جذور رهيزوجيناتمجففة بوساطة، كأداة قوية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية، وقد استخدمت على نطاق واسع نظرا لإنتاجيتها مستقرة وعالية وسهولة الحصول عليها في فترة قصيرة. وعلاوة على ذلك، يتم تمييز الجذور شعر الناجمة عن A. رهيزوجينات بكفاءة من خلال تطوير جذر plagiotropic والنمو المتفرعة للغاية في متوسطة خالية من الهرمونات8. ويمكن استخدامها في عدة مجالات من البحوث، بما في ذلك إنتاج البذور الاصطناعية، وبحوث العقيدات الجذرية، وفي دراسة التفاعلات مع الكائنات الحية الأخرى مثل الفطريات mycorrhizal، والديدان الخيطية، ومسببات الأمراض الجذرية7،9. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام ثقافات تحويل الجذر المشعرة على نطاق واسع كنظام تجريبي للتحقيق في المسارات الكيميائية الحيوية والإشارات الكيميائية وإنتاج الأيض الثانوية النباتية التي تستخدم كمستحضرات صيدلانية ومستحضرات تجميل وإضافات غذائية8،10. وقد تم التحقيق في الأيض الثانوية القيمة، بما في ذلك قلويدات الإندول، aconites، قلويدات التروبان، تيربينويدس، والفلافونويدات، توليفها في جذور شعر البرية من نوع لعدة عقود في العديد من الأنواع، مثل الجنسينوسيد في باناكس الجينسنغ11،الكوممارين في أمي ماجوس12،والمركبات الفينولية في السل2،,13.

وقد تم إنتاج جذور شعر باستخدام A. rhizogenes في 79 نوعا من النباتات من 27 أسرة14. على سبيل المثال، A. رهيزوجينات-بوساطةتحول الجذر شعر تم الإبلاغ في فول الصويا15،,16، سالفا17، Plumbago indica18،لوتس japonicus19،والهندباء(Cichorium intybus L.) 20. السل مشعر الجذر التحول كما تم التحقيق2. عدد قليل من البروتوكولات التفصيلية المتاحة بشأن تطوير جذور شعر بوساطة A. rhizogenes إما تحمل ناقل ثنائي أم لا. فعلى سبيل المثال، أدخلت ساندرا وآخرون21 طريقة لإنتاج جذور شعر بطاطا معدلة وراثياً مستدامة في براعم برية من النوع. يمكن تصور الجذور المشعرة المتطورة بالكامل بعد 5-6 أسابيع من حقن A. rhizogenes تحمل جين مراسل جوس في الإنترنودس الجذعية لنباتات البطاطا. كما أفادت دراسة أخرى نظام الجذر المشعر المعدلة وراثيا الناجمة عن A. rhizogenes إيواء جين مراسل gusA في الجوت(Corchorus capsularis L.) 22.وعلاوة على ذلك، حصل Supaart وآخرون23 على جذور مشعرة للتبغ المحورة وراثيا باستخدام A. rhizogenes تحولت مع التعبير ناقلات pBI121 تحمل جين منحمضرباعي هيدروكانابينوليك (THCA) synthase لإنتاج THCA.

ومع ذلك، فإن العملية التدريجية لتوليد فعال من التحول الجذري المشعر، وخاصة في مجال السل، كانت أقل وضوحاً نسبياً. في هذه الدراسة ، وصفنا بروتوكولًا مفصلًا باستخدام A. rhizogenes الذي يحمل جين المراسل(GFP)، وهو علامة انتقائية(Kan)، وجينًا مهمًا (b4) ، وهو جين محدد من مجموعتنا ولكنه غير منشور من حلزون حلقة أساسية(bHLH)الأسرة) لتوليد التحول الوراثي الجذر المشعر في السل. استمرت التجربة لمدة 5-6 أسابيع ، من تلقيح البذور إلى توليد الجذور المشعرة ، والتي تنطوي على إعداد النبزة ، والعدوى ، والتعبد ، والتبوّاب ، والانتشار اللاحق. وعلاوة على ذلك، تم استخدام A. rhizogenes التي تحتوي على البلازميد ثنائي يحمل transgene السل من عامل النسخ النخاعي 116(FtMYB116)لتحديد ما إذا كان FtMYB116 يمكن أن تعزز تراكم الفلافونويدات، وخاصة الروتين، في السل في الجين ومستوى التمثيل الغذائي من خلال التحول الجذر شعر السل. FtMYB116، وهو عامل النسخ الناجم عن الضوء ، وينظم توليف روتين تحت ظروف الإضاءة المختلفة5. Chalcone synthase(CHS)، فلافانون -3 - هيدروكسيلاز(F3H)، فلافونويد -3 '-هيدروكسيلاز(F3'H)، والفلافونول synthase(FLS)24 هي الإنزيمات الرئيسية المشاركة في المسار الأيضي لعملية التركيب الحيوي روتين. لذلك ، توضح هذه الدراسة التعبير المفرط لـ FtMYB116 في جذور TB المشعرة والتعبير عن جينات الإنزيم الرئيسية وكذلك محتوى الروتين والفلافونويدات الأخرى مثل الكيرسيتين.

Protocol

السل المستخدمة في هذه الدراسة كان اسمه BT18 ، والتي نشأت من سلالة "JinQiao No.2" المزروعة من قبل مركز بحوث الحبوب الصغيرة المتنوعة من أكاديمية شانشي للعلوم الزراعية. يتم توضيح الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول في الشكل 1.

ملاحظة: تشغيل التلاعب المتعلقة بالنباتات الخارجية بسرعة، وعندما يكون ذلك ممكنا، والحفاظ على أطباق بيتري مغلقة لتجنب الذبول والتلوث. ما لم ينص على خلاف ذلك، أجريت جميع الحاضنات explant تحت شرط ضوء 14-ح و10-ح فترة ضوئية داكنة في 25 درجة مئوية. ما لم ينص على خلاف ذلك، تم إجراء جميع العمليات المتعلقة بالنباتات السابقة أو البكتيريا في ظروف معقمة في غطاء تدفق لامينار. يتم توفير جميع المكونات الإعلامية لـ A. rhizogenes والثقافات النباتية في المختبر في الجدول 1. بعد ضبط درجة الحموضة ، تم ضبط جميع الوسائط في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم إعداد الوسائط الصلبة عن طريق ملء 25 مل من المتوسط في طبق بيتري قطره 9 سم والسماح لها بترسيخ.

تنبيه: إيداع جميع البكتيريا والنباتات المعدلة وراثيا في حاوية النفايات المناسبة. تشغيل جميع المواد الكيميائية الخطرة في خزانة أبخرة وإيداعها في حاوية النفايات الخطرة.

1- إعداد القابلات المسببة للسل

  1. إعداد بذور السل
    1. حدد بذور السل الممتلئة وغير التالفة(الشكل 1A1)التي تم الحفاظ عليها عند درجة حرارة أقل من −20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن عامين.
    2. نقع البذور في الماء في 28 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا بحيث يمكن بسهولة تقشير معطف البذور قبالة(الشكل 1A2). إذا لزم الأمر، استخدم مقص لقطع فتحة على البذور لتسهيل تقشير.
  2. تعقيم بذور السل
    1. ضع 100-200 بذور مقشرة في قارورة مخروطية معقمة 100 مل.
    2. تطهير البذور باستخدام الإيثانول 75٪ لمدة 30 s.
    3. استبدال الإيثانول مع 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم وتطهير لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام التطهير باستخدام ثنائي كلوريد الزئبق بتركيز 1 غرام/لتر لمدة 8 سنوات كمقمّقم بديل ليحل محل هيبوكلوريت الصوديوم في أي حالة من حالات التعقيم غير الكافي.
      تنبيه: ثنائي كلوريد الزئبق خطير وليس مادة صديقة للبيئة. تشغيله في خزانة fuming وإيداعه في حاوية النفايات الخطرة، إذا تم استخدام ثنائي كلوريد الزئبق في أي حال.
    4. صب هيبوكلوريت الصوديوم.
    5. غسل البذور باستخدام الماء المعقم deionized 5 مرات.
    6. لطخة البذور الجافة مع ورقة ثنائية العقيمة.
  3. إعداد شتلات السل
    1. إعداد 50 مل موراشيج وSkoog (MS) المتوسطة القاعدية (1962) تستكمل مع 30 غرام / لتر السكروز و 7 ز / لتر مسحوق أجار (MSSA)(الجدول 1)في زجاجة زراعة الأنسجة النباتية 300 مل.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 5.8 قبل التعقيم.
    3. توزيع 10 بذور بالتساوي لكل زجاجة من متوسطة MSSA.
    4. تنبت البذور في غرفة الثقافة في 25 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية تحت شرط الضوء لمدة 7-10 أيام.
  4. إعداد النباتات المعقمة
    1. حدد شتلات قوية من السل(الشكل 1C)،عندما تتكشف 2 قطعة من cotyledons.
    2. قطع الشتلات من الجذور(الشكل 1C أحمر اندفاعة رؤوس الأسهم)،وتجنب الاتصال مع المتوسطة.
    3. وضعها في طبق بيتري معقم.
    4. قطع يبوكوتل إلى شرائح 0.8-1 سم، وقص cotyledons إلى قطع 0.5 سم تقريبا.
    5. قبل زراعة هذه explants على MSSA المتوسطة تحت شرط الضوء لمدة 24 ساعة.
    6. نقلها إلى قارورة مخروطية 100 مل معقم، والتي هي الآن جاهزة للعدوى.

2. إعداد A. رهيزوجينات للتحول

ملاحظة: تم توفير سلالة A. rhizogenes ACCC10060 من قبل معهد تطوير النباتات الطبية والحفاظ عليها عند −80 درجة مئوية. A. تم تحويل رهيزوجينات مع ناقل ثنائي pK7GWIWG2D (II) التي تؤوي T-DNA تحمل الجين B4 المصاحبة GFP كجين مؤشر والجينات المقاومة كان كعلامة يمكن اختيارها. الجين b4 هو عضو في الأسرة bHLH عامل النسخ, التي لم تنشر بعد. لتقييم إمكانات جذور السل المشعرة، تم تحويل A. rhizogenes مع الناقل الثنائي pK7WG2D الذي يحتوي على جين MYB116 للتحقيق في تأثيره على إنتاج الأيض الثانوي مثل الفلافونويدات على مستوى التعبير الجيني والتحليلات الأيضية. تنشيط A. يجب أن تكون مستعدة جيدا في نفس الوقت مع explants.

  1. تفعيل A. رهيزوجينات
    1. ذوبان الريزوجينات A. على الجليد
    2. تراجع البكتيريا وخط لهم بالتساوي على الخميرة مانيتول المتوسطة (YEB) تستكمل مع 15 غ / لتر مسحوق أجار, 50 ملغ / لتر ريفامبيسين, و 50 ملغ / لتر spectinomycin (YEBARS, درجة الحموضة 7.0).
    3. احتضان البكتيريا في 28 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
    4. اختيار مستعمرة أحادية النسيلة والثقافة في طبق آخر بيتري في نفس الطريقة المذكورة أعلاه.
    5. حدد المستعمرات أحادية النسيلة والثقافة لهم في قارورة مخروطية معقمة 100 مل تحتوي على 20 مل من متوسطة YEB تكملها مع 50 ملغ / لتر ريفامبيسين و 50 ملغ / لتر spectinomycin (YEBRS، درجة الحموضة 7.0) في 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة حتى قيمة OD600 تصل إلى 2.0.
    6. احتضان 2٪ -4٪ من الثقافة المذكورة أعلاه في قارورة مخروطية أخرى 100 مل تحتوي على 20 مل من وسط YEBRS عند 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 4-5 ساعة حتى تصل قيمة OD600 إلى حوالي 0.5(الشكل 1D).

3- العدوى بالنباتات المسببة للسل وفحصها

ملاحظة: الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على جذور مشعرة متحولة وراثيا. تم استخدام الجذور البرية كتحكم سلبي لتقييم التعبير المعدل وراثيا. في هذا البروتوكول، تم تحويل A. rhizogenes مع ناقلات ثنائية إما pK7WG2D تحمل جين FtMYB116 أو pK7GWIWG2D (II) تحمل جين B4 مقدما.

  1. إعادة تعليق A. رهيزوجينات
    1. نقل الثقافة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.1.6 إلى أنبوب طارد ة بالسيارة معقم 50 مل.
    2. تدور في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 درجة مئوية.
    3. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه البكتيرية مع MS المتوسطة تستكمل مع 30 غرام / لتر السكروز و 300 ميكرومتر acetosyringone (AS) (MSSAS، درجة الحموضة 5.8) إلى OD600 × 0.2.
  2. عدوى النباتات الخارجية
    1. غرس التعليق البكتيري الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.1.3 في قارورة مخروطية تحتوي على النباتات الجاهزة المعدة في الخطوة 1.4.6 لمدة 10 دقيقة(الشكل 1E).
    2. إخراج explants، ولطخة لهم الجافة باستخدام ورقة bibulous معقمة.

4. الزراعة المشتركة للنباتات مع A. rhizogenes

  1. ضع ورق فلتر معقم قطره 9 سم على متوسط MS ، والذي يتم ترسيخه باستخدام مسحوق أجار 7 جرام / لتر مُكمل بـ 30 جرام / لتر من السكروز و 100 ميكرومتر AS (MSSAAS متوسط ، درجة الحموضة 5.2).
  2. تراكب explants على ورقة تصفية في 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام في الظلام(الشكل 1F).

5- الثقافة التعريفية والانتقائية

  1. ضع ما يقرب من 20 من النباتات المصابة على متوسطة MSSA المكملة بـ 500 ملغم/لتر من التشيفوتتاكسي و50 ملغم/لتر كاناميسين (كان) (MSSACK، درجة الحموضة 5.8)(الشكل 1G).
  2. احتضانها عموديا تحت حالة الضوء عند 25 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية. تحدث الجذور المشعرة بعد أسبوع واحد تقريبًا من الحضانة(تشيررؤوس الأسهم السوداء ذات الاندفاعة السوداء الشكل 1H إلى حدوث جذور شعرية).
    ملاحظة: استبدال MSSACK المتوسطة كل 15 يوما إذا لزم الأمر.

6. subculturing جذور السل شعر

ملاحظة: يهدف هذا الإجراء إلى حصاد جذور شعر قوية. مراقبة نمو الجذور المشعرة بانتظام أثناء الانتشار ، وإزالة تلك الملوثة والمنشطة في الوقت المناسب. إذا لزم الأمر، كرر الخطوات التالية لنشر المزيد من الجذور المشعرة. يستغرق ما يقرب من 10-14 يوما من subculturing إلى الحصاد.

  1. حدد الجذور شعر تظهر مظهر الأبيض والنمو السريع.
  2. قطع لهم إلى قطع من 2-3 سم.
  3. من الواضح أن رقم لهم على مقاعد البدلاء نظيفة.
  4. الثقافة الفرعية لهم في قارورة مخروطية 100 مل معقم تحتوي على 5 مل من متوسطة MS تكملها مع 30 غرام / لتر السكروز و 50 ملغ / لتر كان (MSSK، درجة الحموضة 5.8) بسرعة دوارة من 80 دورة في الدقيقة في 25 درجة مئوية في الظلام حتى أنها مبالغفيها إلى الجزء السفلي من القارورة(الشكل 1I).

7- تحديد الجذور المشعرة المتحولة والحفاظ عليها

ملاحظة: يمكن تحديد الجذور المشعرة المتحولة استنادًا إلى جوانب المورفولوجيا ومستوى الجينات. ويمكن أيضا أن يتم تحديد وفقا لالجينوم الجذر شعر والمقاومة، والتي لا تغطيها في هذا البروتوكول. يركز هذا الإجراء في المقام الأول على الجينات المراسلة وتحديد الجينات المستهدفة.

  1. إزالة التوني والجذور المشعرة الملوثة واختيار تلك مع مظهر أبيض.
  2. تقييم ما إذا كان هناك الفلورة الخضراء تحت الأزرق / الضوء المزدوج فوق البنفسجي ة transilluminator.
  3. حدد الجذور المشعرة التي تظهر إشارة فلورية قوية في الأنابيب مرقمة أو ملفوفة باستخدام tinfoil ملحوظ بعد تجفيفها بورقة ماصة.
  4. Lyophilize لهم في النيتروجين السائل، تليها تخزين كل الحصاد في −80 درجة مئوية لمزيد من التحقيق.
  5. التعرف الجيني
    1. ثلاثية 0.1 غرام من الجذور المشعرة إلى مسحوق ناعم في النيتروجين السائل.
    2. إعداد الحمض النووي الجينومي للخطوط المعدلة وراثيا مستقلة من السل باستخدام تعديل cetyltrimethylammonium بروميد الأسلوب25 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمصنع الجينوم ية DNA عدة.
    3. تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام 100 نانوغرام من قالب الحمض النووي الجينومي والتمهيديات المدرجة في الجدول 2.
    4. أداء دورة التضخيم على النحو التالي: predenaturation في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة، التطهر في 94 درجة مئوية لمدة 30 ث، التمهيدي الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ث، وتمديد التمهيدي في 72 درجة مئوية لمدة 30 ث. بعد 36 دورة وخطوة تمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وتحليل منتجات التضخيم على 1٪ المواد الهلامية أغاروز.
    5. الطخ المواد الهلامية بتلطيخ الحمض النووي وتصورها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

النتائج

Agrobacterium rhizogenesبوساطة السل تحويل الجذر شعر
تصف هذه الدراسة البروتوكول خطوة بخطوة التي أنشئت للحصول على جذور شعر متحولة وراثيا باستخدام A. rhizogenes. استغرق الأمر ما يقرب من 5-6 أسابيع من تلقيح بذور السل إلى حصاد الجذور المشعرة المحددة ، ويتم تصوير بعض الخطوات الرئيسية في

Discussion

وقد استخدم السل في العديد من الدراسات المتعلقة بالأيض الثانوي على المستويات الوراثية والأيضية1،2،5،,27،28. ثقافة الجذر شعر، كمصدر فريد لإنتاج المستقلب، يلعب دورا محوريا في الهندسة الأيضية29

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل صناديق البحوث الأساسية لمعاهد بحوث الرعاية العامة المركزية ZXKT17002.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

References

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 GFP rhizogenes Agrobacterium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved