JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה של גרימת שורשים שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך של כוסמת טרארי (Fagopyrum tataricum). זה יכול לשמש כדי לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משני ב כוסמת טרארי, להיות מאומץ עבור כל שינוי גנטי, או משמש צמחי מרפא אחרים לאחר שיפור.

Abstract

כוסמת טרארי (שחפת) ( ליטר) Gaertn בעלת פעילות ביולוגית ופרמקולוגית שונים, משום שהוא מכיל מטבוליטים משניים שופע כגון פלבנואידים, במיוחד rutin. Agrobacterium בשימוש בהדרגה ברחבי העולם כדי לגרום שורשים שעירים צמחי מרפא לחקור פונקציות גן ולהגדיל את התשואה של מטבוליטים משנית. במחקר זה, תיארנו שיטה מפורטת ליצירת . ריזוגנים-תיווך שורשיםשעירים בשחפת. Cotyledons וציר hypocotyledonary ב 7 – 10 ימים נבחרו כאקסוצמחים ונגועים עם . ריזוזוגנים נושאת וקטור בינארי, אשר המושרה שורשים השעירים האדוקיות שהופיעו לאחר 1 שבוע. השינוי שנוצר שורש השורש זוהה על בסיס מורפולוגיה, בחירת התנגדות (kanamycin), וביטוי גן העיתונאי (חלבון פלורסנט ירוק). לאחר מכן, השורשים השעירים הפכו את עצמם כנדרש. בינתיים, מיאלואובלסטוזיס (MYB) שעתוק גורם, FtMYB116, הפכה הגנום שחפת באמצעות א. ריזוזוגנים-תיווך השורשים שעירים כדי לאמת את התפקיד של FtMYB116 ב סינתזה פלאונואידים. התוצאות הראו כי הביטוי של גנים הקשורים פלונואיד ואת התשואה של תרכובות פלונואיד (rutin ו-quercetin) היו באופן משמעותי (p < 0.01) קידם על ידי FtMYB116, המציין כי . ריזוזוגנים-תיווך שורשים שעירים יכול לשמש כלי אלטרנטיבי יעיל לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משנית. פרוטוקול צעד אחר צעד המפורט במחקר זה ליצירת שורשים שעירים יכול להיות מאומץ לכל שינוי גנטי או צמחי מרפא אחרים לאחר הסתגלות.

Introduction

כוסמתטרטרית ( ליטר) הוא סוג של דו-פסיגיים השייך לסוג fagopyrum והמשפחה המאירוניים1בתוך השנה. כסוג של הרפואה הסינית מזון הומוולוגי, TB קיבל עניין רב בשל ההרכב הכימי הייחודי שלה ופעילויות ביוקליות מגוונות נגד מחלות. TB הוא עשיר בעיקר בפחמימות, חלבונים, ויטמינים, קרוטנואידים כמו גם ב פוליפנולים כגון חומצות פנופילית ו פלבנואידים1. פעילויות ביולוגיות ותרופתי שונות של פלונונואידים, כולל אנטיחמצוני, אנטי יתר לחץ דם2, אנטי דלקתיות, כמו גם antioxidative ותכונות נוגדות סוכרת, הוכחו3.

Agrobacterium ריזוגנס הוא חיידק האדמה תורמת לפיתוח של מחלת שורש שעירים בכמה צמחים גבוהים, במיוחד dicotyledons, על ידי זיהום אתרי הפצע4,5. תהליך זה הוא יזם על ידי העברת ה-DNA ב-לגרימת שורש (Ri) פלמיד5,6 והוא מלווה בדרך כלל על ידי שילוב וביטוי של גן אקסוגני מן הפלביניים Ri ואת השלבים הבאים של יצירת השורש השעיר פנוטיפ7. א. ריזוגנים-שורשים שעירים מתווכת, ככלי רב-עוצמה בתחום ביוטכנולוגיה הצמח, השתמשו באופן נרחב ביותר בשל הפרודוקטיביות היציבה והגבוהה שלהם ובידור קל בתקופה קצרה. יתר על כן, שורשים שעירים הנגרמת על ידי. ריזוזוגנים מכובד ביעילות על ידי פיתוח שורש plagiotropic שלהם וצמיחה מסעף מאוד בינונית ללא הורמון8. ניתן להשתמש בהם במספר תחומים של מחקר, כולל ייצור זרעים מלאכותיים, מחקר גולה שורש, ובלימוד האינטראקציות עם אורגניזמים אחרים כגון פטריות mycorrhizal, nematodes, ופתוגנים שורש7,9. בנוסף, תרבויות שונות השינוי השורש השתמשו בהרחבה כמערכת ניסיונית כדי לחקור את מסלולים ביוכימיים ואיתות כימי לייצר צמח משני מטבוליטים המשמשים כתרופות, קוסמטיקה, תוספי מזון8,10. מטבוליטים משניים יקרי ערך, כולל "אינדול אלקלואידים", "הטרואידים", "טרפננואידים", ופלונונואידים, מסונתז בשורשים שעירים פראי-סוג, נחקרו במשך מספר עשורים במינים רבים, כגון ginsenoside ג'ינסנג11, coumarine ב ammi majus12, תרכובות פנופילית בשחפת2,13.

שורשים שעירים הופקו באמצעות . ריזוזוגנים ב 79 מינים צמחים מ 27 משפחות14. למשל, א. ריזוזוגנים-תיווך השינוי שורש שעירדווחה ב סויה15,16, מרווה17, plumbago indica18, לוטוס יפני19, ו עולש (cichorium intybus L) 20. TB שיער השינוי שורש יש גם נחקר2. פרוטוקולים מפורטים מעטים זמינים לגבי פיתוח של שורשים שעירים תיווך על ידי . ריזוגנים שנושאים וקטור בינארי או לא. למשל, סנדרה ואח '21 הציג שיטה של הפקת תפוחי אדמה שעירים שעיר מתמשכת בעלי סוג פראי נצרי. שורשים שעירים מפותח לחלוטין יכול להיות דמיינו 5-6 שבועות לאחר ההזרקה של . ריזוזוגנים נושאת את הגן העיתונאי גאס לתוך בלוטות הגזע של צמחי תפוחי אדמה. מחקר נוסף דיווח גם על מערכת שורש טרנסגניים השעיר הנגרמת על ידי . ריזוזוגנים מחסה את הגן העיתונאי gusa ב יוטה (מקהלה capsularis L.) 22. יתר על כן, Supaart ואח '23 השיגו שורשי טבק השעירים באמצעות . ריזוזוגנס שינתה את הביטוי וקטור pBI121 נושאת את הגן של Δ1-הטטרקאנאיפילית חומצה (thca) סטנדרטים לייצר thca.

עם זאת, תהליך צעד אחר צעד עבור הדור האפקטיבי של שינוי שורש בסיס, במיוחד בשחפת, הוכח פחות יחסית. במחקר זה, תיארנו פרוטוקול מפורט באמצעות. ריזוזוגנים נושאת את הגן העיתונאי (gfp), סמן סלקטיבי (Kan), וגנים של עניין (b4, מזוהה מהקבוצה שלנו אבל לא פורסם הגן מתוך סליל בסיסי לולאה-סליל (bhlh) משפחה) כדי ליצור שעיר השינוי הגנטי השורש בשחפת. הניסוי נמשך 5-6 שבועות, מן החיסונים של זרעים לדור שורשים שעירים, מעורבים הכנה ההסבר, זיהום, coculturing, subculturing, והתפשטות הבאים. יתר על כן, ריזוגנים המכילים בינארי פלבאמצע נושאת את שחפת מגנטית של שעתוק מיאלואובלסטוזיס גורם 116 (FtMYB116) שימש כדי לקבוע אם FtMYB116 יכול לקדם הצטברות של פלונונואידים, במיוחד rutin, בשחפת על הגן ואת רמת מטבולית באמצעות שחפת שיער שעירים שורש. FtMYB116, שהוא גורם המושרה באור, מווסת את סינתזה של רוטין בתנאי אור שונים5. כלקון סינתז (CHS), flavanone-3-הידרוקסילאז (F3H), פלונואיד-3'-הידרוקסילז (F3'H), ופלונול סינתז (fls)24 הם אנזימים מפתח המעורבים במסלול חילוף החומרים של הביוטין של רוטין. לכן, מחקר זה מדגים את ביטוי היתר של FtMYB116 ב שורשים שעירים TB ואת הביטוי של גנים אנזים מפתח, כמו גם את התוכן של רוטין ופלבנואידים אחרים כגון quercetin.

Protocol

TB בשימוש במחקר זה נקרא בשם BT18, אשר מקורו גזע של "JinQiao מס ' 2" מעובד על ידי מרכז המחקר של גרגר קטן שונות של האקדמיה החקלאית שאנש של המדע החקלאי. השלבים העיקריים של פרוטוקול זה מומחשים באיור 1.

הערה: הפעל מניפולציה הקשורות לאקסוצמחים במהירות, וכאשר הדבר אפשרי, השאר את מנות פטרי סגורות כדי להימנע מוויטינג וזיהום. אלא אם נכתב אחרת, כל הincubations האלה נערכו במצב של אור 14-h ו photoperiod כהה 10-h ב -25 ° c. אלא אם נכתב אחרת, כל הפעולות explants או חיידקים הקשורים בוצעו בתנאים אספטי במכסה הזרם למינארי. כל מרכיבי המדיה של הגנים והצומח בתרבויות מבחנה מסופקים בטבלה 1. לאחר התאמת ה-pH, כל אמצעי התקשורת היו אוטומטיים ב 120 ° c עבור 20 דקות. התקשורת הייתה מוכנה על ידי מילוי 25 מ ל בתוך צלחת פטרי בקוטר 9 ס מ ומאפשר לו לגבש.

התראה: הפקדה את כל החיידקים והצמחים ששונו גנטית לתוך מיכל הפסולת המתאים. הפעל את כל הכימיקלים המסוכנים בארון המים והכנס אותם למיכל הפסולת המסוכנת.

1. הכנת מתקני שחפת

  1. הכנת זרעי שחפת
    1. בחרו זרעי שחפת שמנמנות ולא ניזוק (איור 1A1) שנשמרו בטמפרטורה פחות מ-20 ° c במשך יותר משנתיים.
    2. משרים את הזרעים במים ב -28 ° c בקירוב כ -20 דקות, כך שניתן לקלוף בקלות ממעיל הזרע (איור 1A2). במקרה הצורך, השתמשו במספריים לחיתוך חריץ על הזרעים כדי להקל על הפילינג.
  2. סטריליזציה של זרעי שחפת
    1. מקום 100 – 200 הזרעים קלוף לתוך מבחנה חרוט 100 mL.
    2. לחטא את הזרעים באמצעות 75% אתנול עבור 30 s.
    3. החלף את האתנול עם היפוכלוריט של 5% נתרן וחטא במשך 15 דקות.
      הערה: חיטוי באמצעות כספית ביוכלוריד בריכוז של 1 g/L עבור 8 דקות עשוי לשמש כחיטוי אלטרנטיבי להחליף היפוכלוניט נתרן בכל מקרה של עיקור לקוי.
      התראה: כספית ביוכלוריד מסוכנת ולא חומר ידידותי לסביבה. הפעל אותו בארון הפוגות והכנס אותו למיכל הפסולת המסוכנת, אם נעשה שימוש בכספית כספית בכל מקרה.
    4. . תשפוך את ההיפוכלוריט של הנתרן
    5. רוחצים את הזרעים במים מעוקרים ומפוקרים 5 פעמים.
    6. למחוק את הזרעים יבשים עם נייר bibulous סטרילי.
  3. הכנת שתילי השחפת
    1. להכין 50 mL מורראשיג ו Skoog (MS) הבסיס בינונית (1962) שיושלם עם 30 g/L סוכות ו 7 g/L אגר אבקה (MSSA) (שולחן 1) בבקבוק תרבות של הצמח מ mL 300.
    2. כוונן את ה-pH ל 5.8 לפני הפעלה אוטומטית.
    3. הפץ 10 זרעים באופן שווה לכל בקבוק של מדיום MSSA.
    4. לנבוט הזרעים בחדר תרבות ב 25 ° c ± 1 ° צ' במצב האור במשך 7 – 10 ימים.
  4. הכנת מתקני חיטוי סטריליים
    1. בחר שתילים חזקים של TB (איור 1ג), כאשר 2 פיסות של פסיגי מפרש.
    2. חותכים את השתילים מן השורשים (איור 1ג ' ראשי חץ אדום), הימנעות קשר עם המדיום.
    3. מניחים אותם בצלחת פטרי סטרילית.
    4. חותכים את ה-hypocotyls לתוך 0.8 – 1 ס מ קטעים, ולהטות את פסיגי לתוך כ 0.5 ס מ חתיכות.
    5. טרום תרבות אלה explants על מדיום MSSA תחת תנאי האור עבור 24 שעות.
    6. להעביר אותם לתוך בקבוקון חרוטי 100 mL מעוקר, אשר כעת מוכן זיהום.

2. הכנת הגנים לטרנספורמציה

הערה: המאמץ של א. ריזוגנס ACCC10060 הסופק באדיבות המכון לפיתוח צמחי מרפא ושמור ב--80 ° c. א. ריזוזוגנס השתנה עם וקטור בינארי pK7GWIWG2D (II) כי הנמלים T-DNA נושאת את הגן b4 ליווי gfp כמו גן אינדיקטור ואת הגן ההתנגדות קאן כסמן לבחירה. הגן b4 הוא חבר של משפחת שעתוק משפחה, אשר עדיין לא פורסם. כדי להעריך את הפוטנציאל של שורשים שעירים שחפת, א. ריזוזוגנים הוסב עם וקטור בינארי pK7WG2D המכיל את הגן MYB116 כדי לחקור את השפעתו על ייצור של מטבוליטים משניים כגון פלבנואידים ברמה של ביטוי גנים ועל ידי ניתוחים מטבוליים. הופעל . ריזוזוגנים צריך להיות מוכן היטב באותו הזמן עם explants.

  1. הפעלה של א. ריזוזוגנס
    1. הפשרת הגנים על הקרח
    2. לטבול את החיידקים קו אותם באופן שווה על מדיום ניטול שמרים (אייב) שיושלם עם 15 g/L אגר אבקה, 50 mg/l גריסופלובין, ו 50 mg/l spectinomycin (yebars, pH 7.0).
    3. מודיית את החיידקים ב 28 ° צ' עבור 12-16 h.
    4. בחר מושבה חד-שבטיים ותרבות אותו בצלחת פטרי אחרת באותה צורה שתוארה לעיל.
    5. בחר מושבות חד שבטיים ותרבות אותם ב-100 mL מעוקר בקבוקון חרוטי המכיל 20 מ ל של מדיום של אייב שיושלם עם 50 mg/L גריסופלובין ו 50 mg/L spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) ב 28 ° c ו-6 סל ד עבור 16 – 18 h עד הערך של OD200 מגיע 600.
    6. מיכל התרבות 2% – 4% מהתרבות הנ ל ב-100-mL בקבוקון נוסף המכיל 20 מ ל של YEBRS בינוני ב 28 ° צ' ו 200 rpm עבור 4-5 h עד הערך של OD600 מגיע כ 0.5 (איור 1ד).

3. זיהום והקרנה של הרחבות TB

הערה: מטרת פרוטוקול זה היא להשיג שורשים שעירים גנטית השתנה. השורשים מסוג פראי שימשו כפקד שלילי כדי להעריך את הביטוי הטרנסגניים. בפרוטוקול זה, א. ריזוגנס השתנה עם וקטור בינארי או pK7WG2D נושאת את הגן של FtMYB116 או pK7GWIWG2D (II) נושאת את הגן של b4 מראש.

  1. השעיית מחדש של א. ריזוגנס
    1. להעביר את התרבות המתקבלת בשלב 2.1.6 לתוך צינור צנטריפוגלי 50-mL מעוקר.
    2. ספין ב 4,000 x g עבור 10 דקות ב 20 ° c.
    3. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה החיידקית עם MS בינונית בתוספת עם 30 g/L סוכרוז ו 300 μM acetosyringone (AS) (ב-MSSAS, pH 5.8) כדי OD600 ≈ 0.2.
  2. זיהום של הרחבות
    1. להחדיר את ההשעיה חיידקים שהושג צעד 3.1.3 לתוך בקבוקון חרוט המכיל את explants מוכן בשלב 1.4.6 עבור 10 דקות (איור 1E).
    2. להוציא את האקסוצמחים, ולמחוק אותם יבש באמצעות נייר bibulous סטרילי.

4. התרבות של האקסוצמחים עם . ריזוגנס

  1. מניחים נייר סטרילי 9 ס מ בקוטר מסנן על מדיום MS, אשר מתחזק באמצעות 7 g/L אגר אבקה בתוספת עם 30 g/L סוכרוז ו-100 μM AS (MSSAAS בינונית, pH 5.2).
  2. שכבת החפירה על נייר הסינון ב -25 ° c למשך 3 ימים בחשיכה (איור 1F).

5. השראה ותרבות סלקטיבית

  1. מקום כ 20 explants נגועים על בינוני MSSA בתוספת עם 500 mg/L cefoסעה ו 50 mg/L kanamycin (הקאנון) (MSSACK, pH 5.8) (איור 1G).
  2. מודחלת אותם באופן אנכי תחת תנאי האור ב 25 ° c ± 1 ° צ'. השורשים שעירים מתרחשים בערך 1 שבוע לאחר הדגירה (איור 1שחור חצים ראשי להצביע על התרחשות של שורשים שעירים).
    הערה: החלף מדיום MSSACK כל 15 יום במידת הצורך.

6. השורשים השעירים של TB

הערה: הליך זה נועד לקצור את השורשים השעירים נמרץ. באופן קבוע להתבונן בצמיחה של שורשים שעירים במהלך ההפצה, ולהסיר את אלה מזוהמים ובלתי פעיל בזמן. במקרה הצורך, חזרו על השלבים הבאים כדי להפיץ שורשים שעירים יותר. זה לוקח בערך 10 – 14 ימים מ subculturing לקצור.

  1. בחר את השורשים שעירים מראה המראה הלבן וצמיחה מהירה.
  2. חותכים אותם לחתיכות של 2-3 ס מ.
  3. . ברור שמספר אותם על ספסל נקי
  4. תת-תרבות אותם ב-100 mL מעוקר בקבוקון חרוטי המכיל 5 מ ל של MS בינוני בתוספת 30 g/L סוכות ו 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) במהירות רוטרי של 80 rpm ב 25 ° c בחשכה עד שהם מתפשטים לתחתית הבקבוקון (איור 1I).

7. הזדהות עם שורשים שעירים משתנים ושימור

הערה: ניתן לזהות שורשים שעירים בהתאם להיבטים של מורפולוגיה ורמת הגנים. זיהוי יכול להתבצע גם על פי הגנום שורש התנגדות, אשר אינם מכוסים בפרוטוקול זה. הליך זה מתמקד בעיקר בגנים כתבת וזיהוי גנים מטרה.

  1. להסיר שורשים שעירים מזוהמים ולבחור את אלה עם המראה הלבן.
  2. הערכה אם יש זריחה ירוקה תחת כחול/אור אולטרה סגול כפול ממאיר.
  3. בחר את השורשים השעירים מציג אות זריחה חזקה בצינורות ממוספרים או עטוף באמצעות נייר כסף מסומן לאחר ייבוש אותם עם מסמך סופג.
  4. ליאופליז בחנקן נוזלי, ולאחריה מאחסנים את כל היבול ב-80 ° c לחקירה נוספת.
  5. זיהוי גנטי
    1. Triturate 0.1 גרם של שורשים שעירים לאבקה משובחת בחנקן נוזלי.
    2. הכינו את ה-DNA גנומית של קווי טרנסגניים עצמאיים של TB באמצעות cetyltrimethylammonium ברומיד שונה (CTAB) שיטה25 על פי ההוראה של היצרן של ערכת ה-dna צמח גנומית.
    3. לבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות 100 ng של תבנית ה-DNA גנומית ומפורטות בטבלה 2.
    4. בצע את מחזור הגברה כדלקמן: predenaturation ב 94 ° צ' עבור 5 דקות, הדנטורציה ב 94 ° c עבור 30 s, פריימר ריפוי ב 55 ° צ' עבור 30 s, והארכה פריימר ב 72 ° c עבור 30 s. לאחר 36 מחזורים וצעד הארכה הסופי ב 72 ° צ' עבור 10 דקות, לנתח את מוצרי הגברה על 1% agarose ג ' לים.
    5. כתם את ג'לים עם חומצת גרעין כתמי ולדמיין אותם תחת אור UV.

תוצאות

אגרואכטריום-מתווכת שורש של TB שעיר המרה
מחקר זה מתאר את הפרוטוקול צעד אחר צעד אשר הוקמה כדי להשיג שורשים מהונדסים גנטית שינה באמצעות . ריזוגנים. זה לקח כ 5-6 שבועות מן החיסונים של שחפת הזרעים לקציר של שורשים שעירים מזוהה, וכמה צעדים מרכזיים מתוארים באיור 1 ...

Discussion

TB נעשה שימוש בכמה מחקרים הקשורים מטבוליטים משני ברמות גנטיות ומטבולית1,2,5,27,28. תרבות שורש שעירים, כמקור ייחודי עבור ייצור מטבוליזם, ממלא תפקיד מרכזי בהנדסה מטבולית29 והוא יכול לשמש כדי לשנ...

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

עבודה זו תמכה בקרנות המחקר הבסיסיות של מכוני מחקר בתחום הרווחה המרכזית ZXKT17002.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

References

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157GFPAgrobacterium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved