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요약

우리는 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-타르타르메밀(Fagopyrum tataricum)에서매개 변형된 변종에 의해 털이 많은 뿌리를 유도하는 방법을 설명합니다. 이 유전자 기능 및 타르타리 메밀에서 이차 대사 산물의 생산을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 어떤 유전 변환에 대 한 채택, 또는 개선 후 다른 약용 식물에 대 한 사용.

초록

타르타리 메밀 (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] 그것은 플라보노이드, 특히 루틴과 같은 풍부한 이차 대사 산물을 포함하기 때문에 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가지고 있습니다. Agrobacterium 뿌리 줄기 유전자 유전자 기능을 조사 하 고 이차 대사 산물의 수율을 증가 하는 약용 식물에 털이 뿌리를 유도 하기 위해 전세계적으로 점차적으로 사용 되었습니다. 본 연구에서, 우리는 결핵에서 A. 근위축성-매개털뿌리를 생성하는 상세한 방법을 기술하였다. 7-10일 에서 코틸레톤 및 hypocotyledonary 축은 이식으로 선택되고 1 주 후에 나타난 모험적인 털이 뿌리를 유도하는 이진 벡터를 운반하는 A. 뿌리 줄기 유전자에 감염되었습니다. 생성된 털이 많은 뿌리 형질전환은 형태, 저항성 선택(kanamycin), 및 리포터 유전자 발현(녹색 형광 단백질)에 기초하여 확인되었다. 그 후, 변형 된 털이 뿌리는 필요에 따라 자기 전파되었다. 한편, 골수모세포증(MYB) 전사 인자 인, FtMYB116은 A. 뿌리줄기-매개된 털뿌리를 이용하여 결핵 게놈으로 변형되어 플라보노이드합성에서 FtMYB116의 역할을 검증하였다. 결과는 플라보노이드 관련 유전자의 발현 및 플라보노이드 화합물(루틴 및 케르세틴)의 수율이 FtMYB116에의해 촉진된 유의한(p&0.01)이었으며, 이는 A. rhizogenes-매개털이 뿌리가 유전자 기능 및 이차 대사 산물의 생산을 조사하는 효과적인 대체 도구로 사용될 수 있음을 나타낸다. 털이 많은 뿌리를 생성하기 위한 본 연구에서 기술된 상세한 단계별 프로토콜은 조정 후 임의의 유전적 변형 또는 다른 약용 식물에 대해 채택될 수 있다.

서문

타르타리 메밀(TB)(파고피룸타타리쿰(L.) 가에르트른)은 파고피룸 속과 가족다각과1에속하는 디코틸레돈의 일종이다. 한의학 상동성 식품의 일종으로, 결핵은 독특한 화학 성분과 질병에 대한 다양한 생체 활동으로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. 결핵은 주로 탄수화물, 단백질, 비타민 및 카로티노이드뿐만 아니라 페놀산 및 플라보노이드와 같은 폴리페놀이 풍부합니다1. 항산화,항고혈압제 2,항염증제, 항암 및 항당뇨 특성을 포함한 플라보노이드의 다양한 생물학적 및 약리학적 활동이3가지입증되었다.

아그로박테리움 뿌리줄기는 상처부위4,,5를감염시킴으로써 여러 고식물, 특히 디코틸레톤에서 털이 많은 뿌리질환의 발병에 기여하는 토양 세균이다. 이러한 과정은 뿌리 유도(Ri) 플라스미드5,,6에서 T-DNA의 전달에 의해 개시되고 일반적으로 리플라스미드로부터 의 외인성 유전자의 통합 및 발현및 털이 많은 뿌리 표현형을 생성하는 후속 단계를 수반한다.7 A. 뿌리 줄기-매개 형질 전환 털이 뿌리, 식물 생명 공학 분야에서 강력한 도구로, 가장 널리 때문에 그들의 안정적이고 높은 생산성과 짧은 기간에 쉽게 얻을 수 사용되었다. 더욱이, A. 뿌리줄기유전자에 의해 유도된 털이 많은 뿌리는 호르몬이 없는 배지에서 그들의 배기류 발달 및 고도로 분지성장에 의해 효율적으로 구별된다8. 그들은 인공 종자 생산, 뿌리 작은혹 연구를 포함하여 연구의 몇몇 필드에서 이용될 수 있고, 진균균균균, 선충 및 근병원체 와 같은 그밖 유기체와의 상호 작용을 공부하기에서7,,9. 또한, 털이 많은 뿌리 형질전환 배양물들은 생화학적 경로 및 화학적 신호질과 의약품, 화장품 및 식품 첨가물로서 사용되는 식물 이차 대사산물을 생산하기 위한 실험 시스템으로 광범위하게 사용되고 있다8,,10. 인돌 알칼로이드, 아코마이트, 트로판 알칼로이드, 테르페노이드 및 플라보노이드를 포함한 귀중한 이차 대사산물은 야생형 털뿌리에서 합성되어2,수십 년 동안 파낙스인삼11의인삼, 쿠마린12, 암미12,13,

털이 많은 뿌리는 27가구14종에서79종의 식물로 A. 뿌리줄기를 사용하여 생산되었다. 예를 들어, A. 뿌리 줄기-매개 털이 뿌리 변환 대두15,16, 살비아17, 플럼바 고 인디카18, 연꽃 japonicus19,그리고 치커리(Cichorium intybus L.), 20. 결핵 털이 뿌리 변환도 조사되었다2. A. 근위대 유전자에 의해 매개된 털이 많은 뿌리의 발달에 관하여 몇몇 상세한 프로토콜은 이진 벡터를 들고 있거나 하지 않습니다. 예를 들어, Sandra et al.21은 야생형 싹에서 지속되는 형질전환 감자 털이 많은 뿌리를 생산하는 방법을 도입하였다. 완전히 발달된 털이 많은 뿌리는 감자 식물의 줄기 인터노드로 거스 리포터 유전자를 운반하는 A. 뿌리줄기 유전자를 주사한 후 5-6주 후에 시각화될 수 있었다. 또 다른 연구는 또한 황마에 gusA 기자 유전자를 품고 A. 뿌리 줄기에 의해 유도 된 형질 전환 털이 뿌리 시스템을보고했다(코코러스 capsularis L.) 22.또한, Supaart 외23은 ThCA를 생성하기 위해 Δ 1-테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 신타제의 유전자를 운반하는 발현 벡터 pBI121로 형질전환된 A. 뿌리줄기유전자를 이용하여 형질전환 담배 털뿌리를 수득하였다.1

그러나, 털이 뿌리 변환의 효과적인 생성을 위한 단계별 프로세스, 특히 결핵에서, 상대적으로 덜 입증 되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 기자유전자(GFP),선택적마커(Kan),및 관심 유전자(b4) 및 관심유전자(b4)및 관심 유전자를 이용하여 상세한 프로토콜을 설명하였고, 우리 그룹에서 확인된 기본 나선-루프-나선(bHLH) 패밀리로부터 확인되지 않은 유전자는 결핵에서 털이 많은 뿌리 유전적 변형을 생성한다.bHLH 실험은 5-6 주 동안 지속, 씨앗의 접종에서 털이 뿌리의 생성에, 이식 준비를 포함, 감염, coculturing, subculturing, 및 후속 전파. 더욱이, A. 골수모세포증 전사인자(116)의 결핵 이식유전자를 운반하는 이진 플라스미드를 함유하는뿌리줄기유전자(FtMYB116)는 FTMYB116이 결핵에서 결핵 및 대사 수준에서 결핵에서 의 한 모발 기근 변환을 통해 플라보노이드, 특히 루틴의 축적을 촉진할 수 있는지 여부를 결정하는데 사용되었다. A. rhizogenes FtMYB116은빛 유도 전사 인자이며, 다른 빛 조건 하에서 루틴의 합성을조절한다 5. 찰콘신타제(CHS),플라바노네-3-하이드록실라제(F3H), 플라보노이드-3'-하이드록실라제(F3'H), 플라보놀HF3신타제(FLS)24는 루틴 생합성의 대사 경로에 관여하는 주요 효소이다.F3HFLS 따라서, 본 연구는 결핵 털이 많은 뿌리에서 FtMYB116의 과발현과 주요 효소 유전자의 발현뿐만 아니라 루틴 및 퀘르세틴과 같은 다른 플라보노이드의 함량을 입증한다.

프로토콜

이 연구에 사용된 결핵은 BT18로 명명되었으며, 이는 산시 농업 과학 아카데미의 소규모 기타 곡물 연구 센터에서 재배한 "JinQiao No.2"의 품종에서 유래되었습니다. 이 프로토콜의 기본 단계는 그림 1에나와 있습니다.

참고: 이식 과 관련된 조작을 신속하게 운영하고 가능하면 페트리 접시를 닫아 서 시동및 오염을 피하십시오. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양 배양은 25°C에서 14-h 빛 및 10-h 어두운 광주기의 조건하에서 수행되었다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 이식- 또는 박테리아 관련 작업은 층류 후드의 무균 조건하에서 수행되었다. A. 뿌리줄기 유전자 및 시험관 내 식물 배양에 대한 모든 배지 성분은 표 1에제공된다. pH를 조정한 후, 모든 배지를 20분 동안 120°C에서 오토클레이브하였다.

주의: 모든 유전자 변형 박테리아와 식물을 적절한 폐기물 용기에 보관하십시오. 모든 유해 화학물질을 연기 찬장에 넣고 유해 폐기물 용기에 보관하십시오.

1. 결핵 이식의 준비

  1. 결핵 씨앗의 준비
    1. 2년 이하의 온도에서 보존된 통통하고 손상되지 않은 결핵 종자(그림1A1)를선택하십시오.
    2. 종자 털을 쉽게 벗길 수 있도록 약 20 분 동안 28 °C에서 물에 씨앗을 담급니다(그림 1A2). 필요한 경우, 박리를 용이하게하기 위해 씨앗에 슬롯을 잘라 가위를 사용합니다.
  2. 결핵 종자의 살균
    1. 껍질을 벗긴 씨앗 100-200개에 100 mL의 멸균 된 원추형 플라스크에 넣습니다.
    2. 30s에 대한 75 % 에탄올을 사용하여 씨앗을 소독.
    3. 에탄올을 5% 하이포아염소산나트륨으로 교체하고 15분 동안 소독하십시오.
      참고: 8분 동안 1 g/L의 농도로 수은 비염산염을 사용하여 소독하면 부적절한 살균의 경우 하이포염화나트륨을 대체하는 대체 살균제로 사용될 수 있습니다.
      주의: 수은 염화물은 유해하며 환경 친화적 인 물질이 아닙니다. 어떤 경우에도 수은 비염화물을 사용하는 경우, 연기 찬장에서 작동하고 유해 폐기물 용기에 증착.
    4. 하이포염화나트륨을 붓습니다.
    5. 멸균 탈이온수를 사용하여 씨앗을 5회 세척합니다.
    6. 씨앗을 멸균 된 이중 종이로 건조시고.
  3. 결핵 모종의 준비
    1. 300 mL 식물 조직 배양 병에 50 mL 무라시게와 스쿠그 (MS) 기저 배지 (1962)를 30Table 1g/L 자당 과 7 g/L 한천 분말 (MSSA)으로 보충하였다.
    2. 오토클레이브를 하기 전에 pH를 5.8로 조정합니다.
    3. MSSA 배지 1병당 10개의 씨앗을 고르게 분배합니다.
    4. 7-10일 동안 빛의 조건하에서 25°C±1°C에서 배양실에서 종자발하였다.
  4. 멸균 이식의 준비
    1. 2개의 코틸레온이 펼쳐지면TB(그림 1C)의견고한 모종을 선택합니다.
    2. 뿌리에서 모종을 잘라(그림 1C 적색 대시 화살촉),매체와의 접촉을 피.
    3. 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
    4. hypocotyls0.8-1 cm 세그먼트로 잘라, 약 0.5 cm 조각으로 코일레온을 전단.
    5. 이러한 이식을 MSSA 배지상에서 24시간 동안 광 조건하에 배양한다.
    6. 100 mL 멸균 원추형 플라스크로 옮기면 감염될 준비가 되었습니다.

2. 변형을위한 A. 뿌리 줄기 유전자의 준비

참고: A. 뿌리 줄기 균주 ACCC10060 친절 하 게 약용 식물 개발 연구소에 의해 제공 하 고 -80 °C에서 보존. A. 뿌리줄기유전자는 GFP를 수반하는 b4 유전자를 운반하는 T-DNA를 보유한 이진 벡터 pK7GWIWG2D(II)로 변형시켰으며, 칸 저항 유전자를 선택 가능한 마커로서. 유전자 b4는 아직 출판되지 않은 전사 인자 bHLH 패밀리의 일원이다. 결핵 털이 많은 뿌리의 잠재력을 평가하기 위해, A. 뿌리 줄기 유전자는 MYB116 유전자를 함유하는 이진 벡터 pK7WG2D로 변형하여 유전자 발현 수준 및 대사 분석에서 플라보노이드와 같은 이차 대사 산물의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 활성화 된 A. 뿌리 줄기는 이식과 동시에 잘 준비되어야합니다.

  1. A. 뿌리 줄기 유전자의 활성화
    1. 얼음에 A. 뿌리 줄기를 해동
    2. 박테리아를 찍어 효모 만니톨 배지(YEB)에 15 g/L 한천 파우더, 50 mg/L 리팜피신, 50 mg/L 스펙티노마이신(YEBARS, pH 7.0)으로 보충했습니다.
    3. 박테리아를 28°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
    4. 단일 클론 식민지를 선택하고 위에서 설명한 것과 동일한 방식으로 다른 페트리 접시에 배양하십시오.
    5. 단일 클론 콜로니를 선택하고 100 mL 살균 된 원추형 플라스크에서 50 mg / L 리팜피신과 50 mg / L 스펙노신 (YEBRS, pH 7.0)을 보충한 100 mL 살균 원추형 플라스크에서 28 °C및 200 rpm에서 16-18 h까지OD0값 에 도달합니다.
    6. OD600 값이 약 0.5에 도달할 때까지 4-5시간 동안 200 rpm의 YEBRS 배지의 20 mL을 함유하는 다른 100-mL 원추형 플라스크에서 상기 배양배양물 의 2%-4%를 배양한다(도1D).

3. 결핵 이식의 감염 및 검열

참고 :이 프로토콜의 목적은 유전적으로 변형 된 털이 많은 뿌리를 얻는 것입니다. 야생형 뿌리는 형질전환 발현을 평가하기 위해 음성 대조군으로서 사용되었다. 본 프로토콜에서, A. 뿌리줄기유전자는 b4의 유전자를 미리 운반하는 FtMYB116 또는 pK7GWIWG2D(II)의 유전자를 운반하는 pK7WG2D 중 하나이다.

  1. A. 뿌리 줄기 유전자의 재서스펜션
    1. 2.1.6단계에서 얻어진 배양을 50 mL 멸균 원심관으로 옮김을 옮김을 옮김.
    2. 4,000 x g에서 20°C에서 10분 동안 회전합니다.
    3. 상판액을 제거하고 30 g/L 수크로오스 및 300 μM 아세토시링곤(AS)(MSSAS, pH 5.8)을 OD600에서 0.2로 보충한 MS 배지로 세균 펠릿을 다시 중단시켰다.
  2. 이식의 감염
    1. 3.1.3단계에서 수득된 세균 현탁액을 10분 동안 1.4.6단계로 제조된 이식액을 함유하는 원추형 플라스크내로 주입한다(도1E).
    2. 이식물을 꺼내서 멸균 된 이중 종이를 사용하여 건조시십시오.

4. A. 뿌리 줄기유전자를 가진 이식물의 공동 배양

  1. 30 g/L 자당과 100 μM AS (MSSAAS 배지, pH 5.2)로 보충 된 7 g / L 한천 분말을 사용하여 고화되는 MS 매체에 멸균 9cm 직경 의 필터 종이를 놓습니다.
  2. 암흑에서 3일 동안 25°C에서 필터 용지에 이식을 중첩시(도1F).

5. 유도 및 선택적 문화

  1. 500 mg/L 세포조시메와 50 mg/L 카나마이신(칸)(MSSACK, pH 5.8)으로 보충된 MSSA 배지에 약 20개의 감염된 이식을 놓습니다(그림1G).
  2. 25 °C ± 1 °C에서 빛 조건 하에서 수직으로 배양하십시오. 털이 많은 뿌리는 배양 후 약 1주 후에 발생합니다(그림1H 흑대시 화살촉은 털이 많은 뿌리의 발생을 나타낸다).
    참고: 필요한 경우 15일마다 MSSACK 배지를 교체하십시오.

6. 결핵 털이 많은 뿌리 를 피하

참고 : 이 절차는 활발한 털이 많은 뿌리를 수확하는 것을 목표로합니다. 정기적으로 전파하는 동안 털이 뿌리의 성장을 관찰하고 적시에 오염되고 비활성화 된 뿌리를 제거하십시오. 필요한 경우 다음 단계를 반복하여 털이 많은 뿌리를 전파합니다. 그것은 약 소요 10-14 수확에 subculturing에서 일.

  1. 흰색 모양과 급속한 성장을 보여주는 털이 뿌리를 선택합니다.
  2. 2-3cm의 조각으로 잘라.
  3. 깨끗한 벤치에 명확하게 번호를 매십시오.
  4. 이를 100 mL의 멸균된 원추형 플라스크에서 30 g/L 수크로오스 및 50 mg/L 칸(MSSK, pH 5.8)을 25°C에서 80°C의 회전 속도로 보충하여 5 0mL를 함유하는 멸균원원하순 플라스크를 25°C에서 플라스크의 바닥으로 오버퍼될 때까지 배양한다(도1I).

7. 변형 된 털뿌리의 식별과 보존

참고 : 변형 된 털이 많은 뿌리는 형태학 및 유전자 수준의 양상에 따라 식별 할 수 있습니다. 식별은 또한 이 프로토콜에서 다루지 않는 털이 많은 뿌리 게놈 및 저항에 따라 수행될 수 있다. 이 절차는 주로 리포터 유전자 및 표적 유전자 식별에 초점을 맞춥니다.

  1. 황갈색과 오염된 털뿌리를 제거하고 흰 털이 있는 뿌리를 선택합니다.
  2. 청색/광 이중 자외선 트랜스밀레이터 아래에 녹색 형광이 있는지 평가합니다.
  3. 번호가 매겨진 튜브에서 강한 형광 신호를 나타내는 털이 많은 뿌리를 선택하거나 흡수성 종이로 건조한 후 표시된 tinfoil을 사용하여 감싸십시오.
  4. 액체 질소로 동호우를 친 다음 추가 조사를 위해 모든 수확을 -80 °C에 저장하십시오.
  5. 유전자 식별
    1. 액체 질소에 미세 분말로 털이 뿌리의 triturate 0.1 g.
    2. 식물 게놈 DNA 키트의 제조자의 지시에 따라 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)방법(25)을 이용하여 결핵의 독립적인 형질전환 라인의 게놈 DNA를 제조한다.
    3. 표 2에열거된 100 ng의 게놈 DNA 템플릿 및 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행한다.
    4. 다음과 같이 증폭 주기를 수행합니다: 5분 동안 94°C에서 의 예치, 30초동안 94°C에서의 변성, 30초동안 55°C에서 어닐링, 30초동안 72°C에서 프라이머 연장. 36 사이클 후 72°C에서 10분 동안 최종 연장 단계를 마친 후, 1% 아가로즈 겔에서 증폭 제품을 분석하였다.
    5. 핵산 염색으로 젤을 염색하고 자외선 아래에서 가시화하십시오.

결과

아그로박테리움 뿌리줄기-매개 결핵 털뿌리 형질전환
본 연구는 A. 뿌리줄기유전자를사용하여 유전적으로 변형된 털뿌리를 얻기 위해 설립된 단계별 프로토콜을 설명한다. 결핵 종자의 접종으로부터 확인된 털이 많은 뿌리를 수확하는 데 약 5-6주가 걸렸으며, 몇 가지 주요 단계는 그림1(A-H)에도시되어 있습니다. Figure 1 간단히, 멸균?...

토론

결핵은 유전 및 대사 수준1,,2,5,27,,28에서이차 대사 산물과 관련된 여러 연구에서 사용되어 왔다.5, 털이 많은 뿌리 문화는 대사 산물 생산을위한 고유 한 공급원으로, 대사 공학(29)에 중추적 인 역할을하고 관련 유전자를 삽입하여 신진 대사 경로를 변경하?...

공개

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 중앙 공공 복지 연구 기관 ZXKT17002에 대한 기본 연구 기금에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

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