JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz Agrobacterium rhizogenestarafından kıllı kökleri indükleyen bir yöntem tarif -Tartary karabuğday aracılı dönüşüm (Fagopyrum tataricum). Bu gen fonksiyonları ve Tartary karabuğday ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için kullanılabilir, herhangi bir genetik dönüşüm için kabul edilebilir, ya da iyileştirme den sonra diğer tıbbi bitkiler için kullanılır.

Özet

Tartary karabuğday (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] flavonoidler gibi bol ikincil metabolitleri içerdiğinden çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetlere sahip, özellikle rutin. Agrobacterium rhizogenes yavaş yavaş gen fonksiyonlarını araştırmak ve ikincil metabolitlerin verimini artırmak için tıbbi bitkilerde kıllı kökleri ikna etmek için dünya çapında kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Tüberkülozda A. rhizogenesaracılı kıllı kökler oluşturmak için ayrıntılı bir yöntem tanımlanmıştır. 7-10 günde cotyledons ve hipokotendoner eksen eksektive 1 hafta sonra ortaya çıkan adventif tüylü kökleri indükleyen ikili vektör taşıyan A. rhizogenes ile enfekte edildi. Oluşturulan kıllı kök dönüşümü morfolojisi, direnç seçimi (kanamisin) ve muhabir gen ekspresyonu (yeşil floresan protein) temelinde tanımlanmıştı. Daha sonra, dönüştürülmüş kıllı kökleri gerektiği gibi kendini yayılım edildi. Bu arada, bir myeloblastoz (MYB) transkripsiyon faktörü, FtMYB116, A. rhizogeneskullanarak TB genomuna dönüştürüldü -flavonoidlerin sentezinde FtMYB116 rolünü doğrulamak için aracılı tüylü kökler. Sonuçlar flavonoid ile ilgili genlerin ekspresyonu ve flavonoid bileşiklerin verimi (rutin ve quercetin) önemli ölçüde (p < 0.01) FtMYB116tarafından teşvik olduğunu gösterdi , A. rhizogenes-aracılıtüylü kökleri gen fonksiyonları ve ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için etkili bir alternatif araç olarak kullanılabilir gösteren. Bu çalışmada kıllı kökler üretmek için açıklanan ayrıntılı adım adım protokol, ayarlamadan sonra herhangi bir genetik dönüşüm veya diğer tıbbi bitkiler için kabul edilebilir.

Giriş

Tartary karabuğday (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) Fagopyrum ve familya polygonaceae1familyasına ait bir dicotyledon türüdür. Çin tıbbı homolog gıda bir tür olarak, Tüberküloz kendine özgü kimyasal bileşimi ve hastalıklara karşı çeşitli biyofaaliyetleri nedeniyle önemli ilgi almaktadır. Tüberküloz öncelikle karbonhidratlar, proteinler, vitaminler ve karotenoidler yanı sıra fenolik asitler ve flavonoidler 11gibi polifenoller açısından zengindir. Antioksidatif, antihipertansif2ve anti-inflamatuar yanı sıra antikanser ve antidiyabetik özellikleri de dahil olmak üzere flavonoidlerin çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetleri,gösterilmiştir 3.

Agrobacterium rhizogenes yara siteleri 4 enfekte tarafından birkaç yüksek bitkilerde kıllı kök hastalığı gelişimine katkıda bulunan bir toprak bakterisidir, özellikle dicotyledons,.,5 Bu süreç kök indükleyici T-DNA transferi ile başlatılan (Ri) plazmid5,6 ve genellikle entegrasyonu ve Ri plazmid bir eksojen genin ekspresyonu ve tüylü kök fenotip üreten sonraki adımları eşlik eder7. A. rhizogenes-aracılıtransgenik tüylü kökleri, bitki biyoteknolojisi alanında güçlü bir araç olarak, en yaygın olarak istikrarlı ve yüksek verimlilik ve kısa bir süre içinde kolay elde edilmesi nedeniyle kullanılmaktadır. Ayrıca, A. rhizogenes tarafından indüklenen kıllı kökleri verimli bir hormonsuz orta8onların plagiotropic kök gelişimi ve yüksek dallanma büyüme ile ayırt edilir. Yapay tohum üretimi, kök nodül araştırmaları ve mikorbozial mantarlar, nematodlar ve kök patojenleri gibi diğer organizmalarla etkileşimleri inceleyerek7,9. Buna ek olarak, tüylü kök dönüşüm kültürleri yaygın biyokimyasal yollar ve kimyasal sinyalaraştırmak ve ilaç, kozmetik ve gıda katkı maddeleri8,,10olarak kullanılan bitki ikincil metabolitleri üretmek için deneysel bir sistem olarak kullanılmıştır. Indole alkaloidler, aconites, tropane alkaloidler, terpenoidler ve flavonoidler de dahil olmak üzere değerli ikincil metabolitleri, yabani tip tüylü kökleri sentezlenen çok sayıda tür için birkaç on yıl için araştırılmıştır, Panax ginseng ginsensidegibi11, Ammi majuscoumarine12, ve TB fenolik bileşikler2,13.

Tüylü kökler 27 aileden 79 bitki türünde A. rhizogenes kullanılarak üretilmiştir14. Örneğin, A. rhizogenes-aracılı kıllı kök dönüşümü soya fasulyesi bildirilmiştir15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, ve hindiba(Cichorium intybus L.) 20. Tüberküloz kıllı kök dönüşümü de araştırılmıştır2. Birkaç ayrıntılı protokoller A. rhizogenes ya bir ikili vektör taşıyan ya da taşıma aracılık kıllı köklerin gelişimi ile ilgili mevcuttur. Örneğin, Sandra ve ark.21 yabani tip sürgünler sürdürülen transgenik patates kıllı kökleri üreten bir yöntem tanıttı. Tamamen gelişmiş kıllı kökler, gus muhabiri genini taşıyan A. rhizogenes'in enjekte edilmesinden 5-6 hafta sonra patates bitkilerinin kök internodlarına görselleştirilebilir. Başka bir çalışmada da jüt gusA muhabiri gen barındıran A. rhizogenes tarafından indüklenen bir transgenik kıllı kök sistemi bildirilmiştir(Corchorus capsularis L.) 22- Ayrıca, Supaart ve ark.23 elde transgenik tütün tüylü kökleri A. rhizogenes ifade vektörü pBI121 δ1-tetrahidrokanabinolik asit (THCA) synthase gentaşıyan ile dönüştürülmüş thca üretmek için dönüştürülmüştür.

Ancak, özellikle Tüberküloz'da etkili bir kıllı kök dönüşümü nesli için adım adım bir süreç nispeten daha az gösterilmiştir. Bu çalışmada, TB'de kıllı kök genetik dönüşümü oluşturmak için muhabiri gen(GFP), seçici bir belirteç(Kan)ve bir ilgi geni(b4), grubumuzdan tanımlanan ancak temel sarlis-döngü-sarlis(bHLH)ailesinden yayınlanmamış gen) taşıyan A. rhizogenes kullanılarak ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Deney, tohumların aşılanmasından, eksplant hazırlama, enfeksiyon, koculturing, subculturing ve daha sonraki yayılmayı içeren kıllı köklerin oluşumuna kadar 5-6 hafta sürdü. Ayrıca, FtMYB116'nın tüberküloz kökü dönüşümü yoluyla tb ve metabolik düzeyde flavonoidlerin, özellikle rutin olarak, flavonoidlerin birikimini teşvik edip edemeyeceğini belirlemek için myeloblastoz transgene116(FtMYB116)tb transgenesini taşıyan ikili plazmid içeren arhizogenler kullanıldı. FtMYB116, ışık kaynaklı transkripsiyonel bir faktördür, farklı ışık koşullarında rutin sentezini düzenler5. Chalcone synthase(CHS), flavanon-3-hidroksilaz (F3H), flavonoid-3'-hidroksilaz (F3'H), ve flavonol synthase (FLS)24 rutin biyosentezin metabolik yolu ile ilgili anahtar enzimlerdir. Bu nedenle, bu çalışma FtMYB116'nın TB kıllı köklerinde aşırı ekspresyonu ve anahtar enzim genlerinin ekspresyonunu ve quercetin gibi rutin ve diğer flavonoidlerin içeriğini göstermektedir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan Tüberküloz BT18 olarak adlandırılmıştır, hangi "JinQiao No.2" Shanxi Tarım Bilimleri Akademisi Küçük Çeşitli Tahıl Araştırma Merkezi tarafından yetiştirilen cins kökenli. Bu protokolün birincil adımları Şekil 1'degösterilmiştir.

NOT: Ekstelasyonla ilgili manipülasyonu hızlı bir şekilde çalıştırın ve mümkün olduğunda solma ve kontaminasyonu önlemek için Petri kaplarını kapalı tutun. Aksi belirtilmedikçe, tüm eksplant kuluçkaları 14 saat ışık ve 25 °C'de 10-h karanlık fotoperiod koşuluyla gerçekleştirilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm eksplants- veya bakteri ile ilgili operasyonlar bir laminar akış kaputunda aseptik koşullar altında yapıldı. A. rhizogenes ve in vitro bitki kültürleri için tüm ortam malzemeleri Tablo 1'deverilmiştir. pH ayarlandıktan sonra, tüm ortam 120 °C'de 20 dk. Katılaşmış ortam, 25 mL'lik ortamın 9 cm çapındaki petri kabına doldurularak ve katılaşmasına izin vererek otoklavhaline getirilmiş.

DİkKAT: Genetiği değiştirilmiş tüm bakteri ve bitkileri uygun atık kabına yatırın. Tüm tehlikeli kimyasalları bir duman dolabında çalıştırın ve bunları tehlikeli atık kabına yatırın.

1. Tüberküloz eksplantlarının hazırlanması

  1. Tüberküloz tohumlarının hazırlanması
    1. −20 °C'den daha düşük bir sıcaklıkta 2 yıldan fazla olmayan tombul ve hasarsız TB tohumlarını(Şekil 1A1)seçin.
    2. Tohumları 28 °C'de yaklaşık 20 dakika suda bekletin, böylece tohum kat kolayca soyulabilir (Şekil 1A2). Gerekirse, soyma kolaylaştırmak için tohumlar üzerinde bir yuva kesmek için makas kullanın.
  2. Tüberküloz tohumlarının sterilizasyonu
    1. 100-200 soyulmuş tohumu 100 mL steril konik şişeye yerleştirin.
    2. 30 s için% 75 etanol kullanarak tohumları dezenfekte.
    3. % 5 sodyum hipoklorit ve 15 dakika dezenfekte ile etanol değiştirin.
      NOT: 8 dk için 1 g/L konsantrasyonda cıva biklorür kullanılarak yapılan dezenfeksiyon, yetersiz sterilizasyon durumunda sodyum hipokloritin yerine alternatif sterilizatör olarak kullanılabilir.
      DİkKAT: Cıva biklorür tehlikelidir ve çevre dostu bir malzeme değildir. Cıva biklorür her durumda kullanılırsa, fuming dolap ta çalıştırın ve tehlikeli atık konteyner içine yatırın.
    4. Sodyum hipoklorit dökün.
    5. Tohumları steril deiyonize su kullanarak 5 kez yıkayın.
    6. Blot tohumları steril bibulous kağıt ile kuru.
  3. Tüberküloz fidelerinin hazırlanması
    1. Hazırlamak 50 mL Murashige ve Skoog (MS) bazal orta (1962) 30 g / L sakkaroz ve 7 g / L agar tozu (MSSA) (Tablo 1) ile takviye 300 mL bitki doku kültür şişesi.
    2. Otomatik otoklavlamadan önce pH'ı 5,8'e ayarlayın.
    3. MSSA orta şişe başına eşit olarak 10 tohum dağıtın.
    4. Tohumları 25 °C ± 1 °C'deki bir kültür odasında 7-10 gün boyunca ışık koşulunda çimleştirin.
  4. Steril eksplantların hazırlanması
    1. 2 adet karyola açıldığında, 2 adet karyola açığa çıktığında, Sağlam TB fidelerini(Şekil 1C)seçin.
    2. Köklerden fideler kesin (Şekil 1C kırmızı çizgi ok başları),orta ile temas kaçınarak.
    3. Steril petri kabına koyun.
    4. Hipokotilleri 0,8-1 cm segmentler halinde kesin ve karyolaları yaklaşık 0,5 cm'lik parçalara ayırın.
    5. Preculture bu explants MSSA ortamda 24 saat hafif koşullar altında.
    6. 100 mL steril konik şişeiçine aktarın, hangi şimdi enfeksiyon için hazır.

2. Dönüşüm için A. rhizogenes hazırlanması

NOT: A. rhizogenes suşu ACCC10060 Tıbbi Bitki Geliştirme Enstitüsü tarafından sağlanmış ve −80 °C'de korunmuştur. A. rhizogenes, bir gösterge geni olarak GFP'ye eşlik eden b4 geni taşıyan bir T-DNA'yı barındıran ikili pK7GWIWG2D (II) ve seçilebilir bir belirteç olarak Kan direnç geni ile dönüştürüldü. B4 geni henüz yayınlanmamış transkripsiyon faktörü bHLH ailesinin bir üyesidir. Tüberküloz kıllı köklerin potansiyelini değerlendirmek için A. rhizogenes MYB116 geni içeren ikili vektör pK7WG2D ile dönüştürülerek gen ekspresyonu düzeyinde flavonoidler gibi sekonder metabolitlerin üretimi üzerindeki etkisini araştırmak ve metabolik analizlerle dönüştürüldü. Aktive A. rhizogenes eksekslerle aynı anda iyi hazırlanmalıdır.

  1. A. rhizogenes aktivasyonu
    1. Buz üzerinde çözülme A. rhizogenes
    2. Bakterileri batırın ve 15 g/L agar tozu, 50 mg/L rifampisin ve 50 mg/L spektinomisin (YEBARS, pH 7.0) ile takviye edilmiş maya mannitol ortamına (YEB) eşit olarak yerleştirin.
    3. Bakterileri 28 °C'de 12-16 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Bir monoklonal koloni seçin ve aynı yukarıda açıklanan şekilde başka bir Petri çanak kültür.
    5. 20 mg/L rifampisin ve 50 mg/L spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) ile takviye edilmiş 20 mL'lik steril konik şişede monoklonal kolonileri seçin ve 16-18 saat od600 değeri 2.0'a ulaşana kadar 200 rpm'de seçin.
    6. OD600 değeri yaklaşık 0.5'e ulaşana kadar 28 °C'de 20 mL YEBRS orta ve 4-5 saat için 200 rpm içeren başka bir 100 mL konik şişede yukarıda bahsedilen kültürün %2-4'ünü kuluçkaya yatırın(Şekil 1D).

3. Tüberküloz eksektirlerinin enfeksiyonu ve taranması

NOT: Bu protokolün amacı genetik olarak dönüştürülmüş kıllı kökler elde etmektir. Yabani tip kökler transgenik ifadeyi değerlendirmek için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde A. rhizogenes ftmyb116 genini taşıyan pK7WG2D veya önceden b4 genini taşıyan pK7GWIWG2D (II) ikili vektörü ile dönüştürüldü.

  1. A. rhizogenes resuspension
    1. Adım 2.1.6'da elde edilen kültürü 50 mL steril santrifüj tüpe aktarın.
    2. 20 °C'de 10 dakika boyunca 4.000 x g'de spin.
    3. Supernatant çıkarın ve MS orta 30 g / L sakaroz ve 300 μM asetoziringon (AS) (MSSAS, pH 5.8) ile OD600 ile takviye ile bakteriyel pelet resuspend .
  2. Eksbitki enfeksiyonu
    1. Adım 3.1.3'te elde edilen bakteriyel süspansiyonu, 10 dakika boyunca 1.4.6'da hazırlanan eksplanda hazırlanan eksplorları içeren konik bir şişeye aşılayın(Şekil 1E).
    2. Ekstesyonları alın ve steril bibulous kağıt kullanarak kuru lekeler.

4. A. rhizogenes ile eksedek yetiştiriciliği

  1. 30 g/L sakaroz ve 100 μM AS (MSSAAS orta, pH 5.2) ile takviye edilmiş 7 g/L agar tozu kullanılarak katılaştırılan MS ortamına 9 cm çapında steril bir filtre kağıdı yerleştirin.
  2. 25 °C'de filtre kağıdına eksmeciyi karanlıkta 3 gün boyunca(Şekil 1F)yerle bir edin.

5. İndüksiyon ve seçici kültür

  1. MSSA ortamına 500 mg/L sefotaksim ve 50 mg/L kanamisin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) ile takviye edilmiş yaklaşık 20 enfekte eksbitki yerleştirin(Şekil 1G).
  2. 25 °C ± 1 °C'de ışık koşulunda dikey olarak kuluçkaya yatırın. Tüylü kökler kuluçkadan yaklaşık 1 hafta sonra ortaya çıkar (Şekil 1H siyah çizgi ok uçları tüylü köklerin oluşumunu gösterir).
    NOT: Gerekirse her 15 günde bir MSSACK ortamını değiştirin.

6. TB kıllı kökleri alt küle

NOT: Bu işlem güçlü kıllı kökleri hasat etmeyi amaçlamaktadır. Düzenli olarak yayılma sırasında kıllı köklerin büyümesini gözlemleyin ve kirlenmiş ve inaktive olanları zamanında çıkarın. Gerekirse, daha kıllı kökleri yaymak için aşağıdaki adımları tekrarlayın. Bu hasat için subculturing yaklaşık 10-14 gün sürer.

  1. Beyaz görünüm ve hızlı büyüme gösteren tüylü kökleri seçin.
  2. 2-3 cm parçalar halinde kesin.
  3. Açıkça temiz bir bankta numaralandırmak.
  4. 30 g/L sakaroz ve 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) ile takviye edilmiş 5 mL MS orta içeren 100 mL steril konik şişede alt kültür, karanlıkta 25 °C'de 80 rpm'lik bir döner hızda şişenin dibine kadar geniş bir alana yayılana kadar(Şekil 1I).

7. Dönüştürülmüş kıllı köklerin belirlenmesi ve korunması

NOT: Dönüştürülmüş kıllı kökler morfoloji ve gen düzeyi ne göre tanımlanabilir. Tanımlama, bu protokolde yer almayan kıllı kök genomu ve direncine göre de yapılabilir. Bu prosedür öncelikle muhabir gen ve hedef gen tanımlama üzerinde duruluyor.

  1. Tawny ve kontamine kıllı kökleri çıkarın ve beyaz görünüme sahip olanları seçin.
  2. Mavi/ışık çift ultraviyole transilluminator altında yeşil floresan olup olmadığını değerlendirin.
  3. Numaralı tüplerde güçlü bir floresan sinyali sergileyen veya emici bir kağıtla kuruttuktan sonra işaretli bir folyo kullanılarak sarılmış tüylü kökleri seçin.
  4. Lyophilize sıvı azot, daha fazla araştırma için −80 °C tüm hasat depolama takip.
  5. Gen tanımlama
    1. Tüylü köklerin 0,1 g'ını sıvı nitrojende ince toz haline getirin.
    2. Bitki genomik DNA kiti üreticisinin talimatına göre modifiye cetyltrimethylammonium bromür (CTAB) yöntemi25 kullanarak TB bağımsız transgenik hatlarıgenomik DNA hazırlayın.
    3. Tablo 2'delistelenen 100 ng genomik DNA şablonu ve astar kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
    4. Amplifikasyon döngüsünü aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 94 °C'de 5 dk için predenatürasyon, 30 s için 94 °C'de denatürasyon, 30 s için 55 °C'de astar lama ve 30 s için 72 °C'de astar uzatma. 36 döngü ve 10 dakika için 72 °C'de son uzatma adımından sonra amplifikasyon ürünlerini %1 agarose jelüzerinde analiz edin.
    5. Jelleri nükleik asit le bezle boyandın ve UV ışığı altında görselleştirin.

Sonuçlar

Agrobacterium rhizogenes-aracılı Tüberküloz kıllı kök dönüşümü
Bu çalışma, A. rhizogeneskullanarak genetik olarak dönüştürülmüş kıllı kökleri elde etmek için kurulan adım adım protokolü açıklar. Tüberküloz tohumlarının aşılanmasından tespit edilen kıllı köklerin hasadına kadar yaklaşık 5-6 hafta sürdü ve bazı önemli adımlar Şekil 1'de (A-H)gösterilmiştir. Kısaca, steril kabuklu tohumla...

Tartışmalar

Tüberküloz genetik ve metabolik düzeylerde sekonder metabolitleri ile ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır1,2,5,27,,28. Kıllı kök kültürü, metabolit üretimi için benzersiz bir kaynak olarak, metabolik mühendislik önemli bir rol oynar29 ve ilgili genler ekleyerek metabolik yolları değiştirmek için kullanı...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Merkezi kamu refahı araştırma enstitüleri ZXKT17002 için Temel Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

Referanslar

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 157Tartary karabu dayk ll k klerigenetik d n mGFPAgrobacterium rhizogenessekonder metabolitgen fonksiyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır