لوحة LC-MS/MS المعتمدة لقياس 11 دواءً مقاومًا للأدوية في عينات الشعر الصغيرة

Andrew Reckers; Anita Wen; David Aguilar; Peter Bacchetti; Monica Gandhi; John Metcalfe; Roy Gerona

doi:10.3791/60861

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يمكن أن تكون الطرق الحالية لتحليل التزام المرضى بأنظمة السل المقاوم للأدوية المعقدة غير دقيقة وكثيفة الموارد. تقوم طريقتنا بتحليل الشعر، وهو مصفوفة يتم جمعها وتخزينها بسهولة، لتركيزات 11 دواءً من أدوية السل المقاوم للأدوية. باستخدام LC-MS/MS، يمكننا تحديد مستويات المخدرات دون نانوغرام التي يمكن استخدامها لفهم أفضل للتقيد المخدرات.

Abstract

يشكل السل المقاوم للأدوية تهديداً متزايداً للصحة العامة، وقد يكون لتقييم مستويات الأدوية العلاجية فوائد سريرية هامة. مستويات البلازما المخدرات هي التقييم القياسي الذهب الحالي، ولكن تتطلب فليبوتوبضع وسلسلة التبريد، والتقاط الالتزام فقط الأخيرة جدا. تستخدم طريقتنا الشعر، وهو مصفوفة يتم جمعها بسهولة وتعكس الالتزام على المدى الطويل، لاختبار 11 دواءً مضادًا للسل. ويبين العمل السابق الذي قامت به مجموعتنا أن مستويات العقاقير المضادة للفيروسات العكوسة في الشعر ترتبط بنتائج فيروس نقص المناعة البشرية. لدينا طريقة لأدوية السل المقاوم للأدوية يستخدم 2 ملغ من الشعر (3 سم قريبة من الجذر)، والتي يتم سحقها واستخراجها في الميثانول. يتم تحليل العينات باستخدام طريقة LC-MS/MS واحدة ، مما يحدد 11 دواءً في تشغيل 16 دقيقة. وتتراوح الحدود الدنيا للقياس الكمي للأدوية الإحدى عشرة من 0.01 نانوغرام/ملغم إلى 1 نانوغرام/ملغم، ويؤكد وجود المخدرات بمقارنة نسب انتقالين من انتقالي قياس الطيف الكتلي. يتم قياس العينات باستخدام نسبة مساحة الدواء إلى المتجانس ، ¹⁵N - أو ¹³isotopologue المخدرات المسمى C. استخدمنا منحنى معايرة يتراوح بين 0.001-100 نانوغرام/ملغ. تطبيق الأسلوب على عينة الراحة من عينات الشعر التي تم جمعها من مرضى السل المقاوم للأدوية على العلاج الخاضع للملاحظة المباشرة (DOT) أشار إلى مستويات الدواء في الشعر ضمن النطاق الديناميكي الخطي لتسعة من الأدوية الأحد عشر (isoniazid، pyrazinamide، ethambutol، linezolid، ليفوفلوكساسين، اللوكسلوكساسين، الكلوف ايزماتين، بيداكلين، pretomanid). لم يكن أي مريض على البروتيوناميد ، وكانت المستويات المقاسة للإيثيوناميد قريبة من LLOQ (مع مزيد من العمل بدلاً من ذلك دراسة مدى ملاءمة المستقلب ethionamide لرصد التعرض). وباختصار، فإننا نصف تطوير لوحة متعددة الأنالية لأدوية السل المقاوم للأدوية في الشعر كتقنية لرصد الأدوية العلاجية أثناء علاج السل المقاوم للأدوية.

Introduction

في القرن الحادي والعشرين، يشكل السل المقاوم للأدوية كارثة متطورة بالنسبة للبرامج الوطنية الضعيفة بالفعل لمكافحة السل، حيث تضاعفت الحالات المؤكدة في السنوات الخمس الماضية وحدها، وهو ما يمثل ما يقرب من ثلث جميع الوفيات المرتبطة بمقاومة مضادات الميكروبات على الصعيد العالمي^1،^,^2. وقد تطلب العلاج الناجح للسل المقاوم للأدوية تقليدياً أنظمة الخط الثاني الأطول سمية من علاج السل الحساس للأدوية. وعلاوة على ذلك، غالباً ما يواجه المرضى المصابون بالسل المقاوم للأدوية تحديات كبيرة قائمة من قبل للتمسك، مما ساهم في ظهور المقاومة في البداية^3.

على عكس عدوى فيروس نقص المناعة البشرية حيث يمكن استخدام الأحمال الفيروسية لمراقبة العلاج، يتم تأخير نقاط النهاية البديلة للاستجابة العلاجية في السل ولا يمكن الاعتماد عليها على المستوى الفردي^4. كما أن مراقبة التزام المرضى، وهو مؤشر هام على تركيز الأدوية المضادة للسل دون العلاجية وفشل العلاج، أمر صعب أيضاً. الالتزام الذاتي المبلغ عنها يعاني من التحيز استدعاء والرغبة في إرضاء مقدمي⁵^,⁶. يمكن أن يكون عدد حبوب منع الحمل وأنظمة مراقبة الأحداث الدوائية (MEMS) أكثر موضوعية⁷ ولكن لا تقيس الاستهلاك الفعلي للأدوية⁸^،⁹^،¹⁰. يمكن أن توفر مستويات الدواء في المصفوفات الحيوية كل من الالتزام والبيانات الدوائية. لذلك ، تستخدم مستويات أدوية البلازما عادة في مراقبة الأدوية العلاجية¹¹^،^12. غير أنه في سياق رصد التقيد بالمخدرات، تمثل مستويات البلازما التعرض القصير الأجل وتحد منها تفاوتات كبيرة داخل المريض وفيما بين المرضى عند تحديد النطاق المرجعي المناسب للتقيد. آثار "معطف أبيض"، حيث يتحسن الالتزام قبل العيادة أو زيارات الدراسة، يزيد من تعقيد قدرة مستويات البلازما لتوفير أنماط دقيقة الالتزام المخدرات¹³.

الشعر هو مصفوفة بيولوجية بديلة يمكن قياس التعرض للأدوية على المدى الطويل¹⁴^،¹⁵. العديد من الأدوية والأيض الذاتي دمج في مصفوفة بروتين الشعر من الدورة الدموية الجهازية كما ينمو الشعر. كما تستمر هذه العملية الديناميكية خلال نمو الشعر، كمية الدواء المودعة في مصفوفة الشعر يعتمد على وجود مستمر للدواء في الدورة الدموية، مما يجعل الشعر قراءة زمنية ممتازة من تناول المخدرات. الشعر كمصفوفة حيوية لديه ميزة إضافية من يجري جمعها بسهولة دون الحاجة إلى سلسلة التبريد للتخزين والشحن مقارنة بالدم. وعلاوة على ذلك، الشعر غير خطرة بيولوجيا، والتي توفر مزايا جدوى إضافية في هذا المجال.

وقد استخدمت مستويات المخدرات الشعر منذ فترة طويلة في تطبيقات الطب الشرعي¹⁶. وعلى مدى العقد الماضي، أثبتت مستويات مضادات الفيروسات العكوسة للشعر فائدة في تقييم مدى التزام هاوية المخدرات في علاج فيروس نقص المناعة البشرية والوقاية منه، وهو ما أسهمت فيه مجموعتنا. وقد ثبت أن مستويات ARV في الشعر لتكون أقوى المؤشرات المستقلة لنتائج العلاج في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية¹⁷^,18^,¹⁹¹⁹^,²⁰^,²¹. لتحديد ما إذا كانت مستويات الشعر من مرضى السل المقاوم للأدوية سيكون لها نفس الأداة المساعدة في التنبؤ بنتائج العلاج، استخدمنا LC-MS/MS لتطوير والتحقق من صحة طريقة لتحليل 11 دواء ً من أدوية السل المقاوم للأدوية في عينات الشعر الصغيرة. كتقييم أولي لأداء القياس ، قمنا بقياس مستويات أدوية السل المقاوم للأدوية في عينة مريحة من المرضى الذين يعانون من السل المقاوم للأدوية الذين يتلقون العلاج الملاحظة مباشرة (DOT) في كيب الغربية ، جنوب أفريقيا²².

Protocol

وقدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة قبل جمع عينات الشعر. حصلنا على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية من جامعة كيب تاون وجامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو.

1. أخذ عينات الشعر

الحصول على موافقة خطية مستنيرة.
استخدم مقصًا نظيفًا لقطع ما يقرب من 20-30 خصلات شعر فروة الرأس من المنطقة القذالية بالقرب من فروة الرأس قدر الإمكان.
ضع الشريط حول الجانب المنفّر من الشعر للإشارة إلى الاتجاه. أضعاف عينة الشعر في مربع احباط الألومنيوم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تسمية نهاية القاصي من الشعر لتجنب التلوث المحتمل من التعامل مع نهاية قريبة إضافية.
بالإضافة إلى عينات المريض، جمع "الشعر الفارغ": عينة شعر فروة الرأس من شخص لم يتناول أدوية السل. جمع كمية كبيرة (> 30 ملغ الشعر الفارغ لكل 20 عينة المريض).

2- استخراج المخدرات

أنابيب القمسة التسمية. كل عينة المريض يتطلب أنبوب واحد. تسمية 12 أنابيب من "C0" إلى "C11"، واحدة لكل من نقاط المعايرة 12. قم بتسمية أنبوب لمراقبة الجودة المنخفضة، وأنبوب لمراقبة الجودة المتوسطة، وأنبوب لمراقبة الجودة العالية. وأخيرا، تسمية أنبوب لمصفوفة فارغة.
فتح مربع احباط الألومنيوم التي تحتوي على عينة الشعر. إذا كانت عينة الشعر أطول من 3 سم، اقص الشعر على بعد 3 سم من الطرف القريب واستخدم هذا الجزء القريب للتحليل.
وزن 2 ملغ من عينة الشعر في أنبوب من نوع البزة.
وزن 2 ملغ من الشعر الفارغ في 16 أنابيب زى إضافية. سيتم استخدام هذه كنقاط معايرة وضوابط الجودة ومصفوفة فارغة. ستتبع الأنابيب نفس إجراءات الاستخراج مثل عينات المريض ، بصرف النظر عن ارتفاعها مع المعايير المرجعية للأدوية عند المستويات المشار إليها في الخطوتين 2.8 و 2.9.
ضع كل أنابيب الخرز في المتجانس. تشغيل المتجانس بسرعة 6.95 م/ ث. تشغيل لدورتين من 30 s لكل منهما، مع فترة راحة 15 s بين الدورتين.
جعل مزيج القياسية الداخلية وإضافته إلى العينات.
1. إضافة ~ 40 مل من الميثانول إلى قارورة حجمية 50 مل.
2. في قوارير الزجاج العنبر، وجعل يمزج من المعايير الداخلية الموضحة في الجدول 1،وذلك باستخدام الميثانول كمذيب.
  ملاحظة: الميثانول متقلب جداً. ترك جميع القوارير توج خلال هذه العملية لمنع الخسارة بسبب التبخر.
3. من تلك الخلطات، أضف وحدة التخزين الموضحة في الجدول 1 إلى قارورة الحجم 50 مل. ثم، ملء قارورة إلى 50 مل مع الميثانول.
4. كاب وخلط قارورة الحجم. أضف 500 ميكرولتر من الخليط إلى كل من أنابيب الشعر المسحوقة ، باستثناء أنبوب المصفوفة الفارغ. إضافة 500 ميكرولتر الميثانول إلى أنبوب مصفوفة فارغة.
جعل يمزج القياسية المرجعية.
1. تشكل معايير مرجعية متقنة للأدوية التالية مع الميثانول للحصول على التركيز المبين في الجدول في الخطوة 2.7.2. فقط 1 مل من التركيزات التالية ضروري.
2. أضف 1768 ميكرولتر من الميثانول إلى قارورة، ثم أضف كميات المعيار المرجعي المدرج في الجدول 2 إلى نفس القارورة للحصول على 2 مل الحجم النهائي. تسمية هذه القارورة "المرجع Std ميكس 1x". دوامه.
3. سبايك 100 ميكرولتر من "المرجع Std Mix 1x" إلى 900 ميكرولتر الميثانول في قارورة جديدة. تسمية هذه القارورة "المرجع Std ميكس 10x". دوامه.
4. سبايك 100 ميكرولتر من "Ref Std Mix 10x" إلى 900 ميكرولتر الميثانول في قارورة جديدة. تسمية هذه القارورة "المرجع Std ميكس 100x". دوامه.
5. سبايك 100 ميكرولتر من "Ref Std Mix 100x" إلى 900 ميكرولتر الميثانول في قارورة جديدة. تسمية هذه القارورة "المرجع Std ميكس 1000x". دوامه.
ارتفاع أنابيب منحنى المعايرة عن طريق إضافة كمية من المرجع Std ميكس الموضحة في الجدول 3.
إنشاء يمزج مراقبة الجودة وأنابيب مراقبة الجودة ارتفاع.
1. التسمية 5 قوارير "QC-A" من خلال "QC-E".
2. أضف الكميات التالية من الميثانول إلى القنينات الخمس المسماة:
  QC-A: 990 ميكرولتر
  QC-B: 940 ميكرولتر
  QC-C: 950 ميكرولتر
  QC-D: 980 ميكرولتر
  QC-E: 950 ميكرولتر
3. باستخدام مخزون الأدوية 1 ملغم/مل تم إنشاؤه في الخطوة 2.7.1، أضف 10 ميكرولتر إلى القنينات المحددة المذكورة أدناه. بالنسبة لمخزونات BDQ و CLF، التي تبلغ 0.5 ملغم/مل، أضف 20 ميكرولتر إلى القنينات المذكورة أدناه.
  QC-A: PTH
  QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
  QC-C: INH، LFX، LZD، MFX، PZA
  QC-D: PTH, EMB
  QC-E: CLF، BDQ، PTM
  
  ملاحظة: توجد بعض الأدوية في خلطات متعددة.
4. تسمية قارورة باسم "QC-A df100". تمييع 10 ميكرولتر من QC-A إلى 990 ميكرولتر الميثانول.
5. تسمية قارورة باسم "انخفاض مخزون مراقبة الجودة". أضف الميثانول 1832 ميكرولتر إلى هذه القارورة. إضافة كميات من يمزج QC مفصلة أدناه:
  QC-A df100: 80 ميكرولتر
  QC-B: 8 ميكرولتر
  QC-C: 80 ميكرولتر
6. تسمية قارورة باسم "مخزون QC منتصف". أضف الميثانول 760 ميكرولتر إلى هذه القارورة. إضافة كميات من يمزج QC مفصلة أدناه:
  QC-A df100: 800 ميكرولتر
  QC-B: 40 ميكرولتر
  QC-C: 400 ميكرولتر
7. تسمية قارورة باسم "الأسهم عالية مراقبة الجودة". أضف الميثانول 1376 ميكرولتر إلى هذه القارورة. إضافة كميات من يمزج QC مفصلة أدناه:
  QC-D: 160 ميكرولتر
  QC-E: 320 ميكرولتر
  MFX، 1mg/mL الأسهم: 16 ميكرولتر
  INH، 1mg/mL الأسهم: 32 ميكرولتر
  LFX، 1mg/mL الأسهم: 32 ميكرولتر
  LZD، 1mg/mL الأسهم: 32 ميكرولتر
  PZA، 1mg/mL الأسهم: 32 ميكرولتر
8. سبايك 10 μL انخفاض QC الأسهم في أنبوب زى QC منخفضة.
9. سبايك 10 μL منتصف QC الأسهم في منتصف QC أنبوب البزة.
10. سبايك 10 μL عالية QC الأسهم في أنبوب عالية QC الزى.
ضع جميع الأنابيب في شاكر ساخن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. يجب أن يكون الاهتزاز بطيئابما فيه الكفاية أن الماء لا يرش حتى على الأنابيب.
إزالة أنابيب من شاكر. نقل السائل من أنابيب البزات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة. تسمية هذه أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بنفس الطريقة.
إضافة 500 ميكرولتر الميثانول إلى الأنابيب القديمة. كاب ودوامة.
للمرة الثانية، نقل السائل من أنابيب البزات إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيقة المقابلة. لا بأس من نقل الشعر المسحوق. وسيتم في نهاية المطاف طرد مركزي.
الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 2800 × ز.
قم بإزالة السائل بعناية ونقله إلى أنابيب طرد مركزي جديدة مع ملصقات مقابلة. يجب الحرص على عدم إزعاج أو نقل بيليه الشعر.
يتبخر السائل في أنابيب الطرد المركزي إلى جفاف عند 32 درجة مئوية.
إعادة تشكيل العينات بإضافة 200 ميكرولتر من المرحلة المتنقلة A (المياه من الدرجة HPLC مع حمض الفورميك 1٪) إلى الأنابيب الجافة. دوامه.
نقل السائل إلى قوارير العنبر مع إدراج 250 ميكرولتر.

3. LC-MS/ MS إعداد

جعل لتر واحد من المرحلة المتنقلة A (HPLC الصف المياه مع حمض الفورميك 1٪) عن طريق إضافة بعض المياه HPLC الصف إلى قارورة حجمية لتر واحد. ثم أضف 10 مل من حمض الفورميك إلى تلك القارورة، ثم املأه على الخط بالماء من الدرجة HPLC.
1. جعل لتر واحد من المرحلة المتنقلة B (acetonitrile مع 0.1٪ حمض الفورميك) عن طريق إضافة بعض الأسيتونتريل إلى قارورة حجمية سعة لتر واحد. ثم إضافة 1 مل من > 95٪ حمض الفورميك إلى أن قارورة، ومن ثم ملء إلى خط مع الأسيتونتريل.
قم بتثبيت عمود 2 × 100 مم بحجم جسيمات 2.5 ميكرومتر وحجم مسام 100 Å مع حبات الفينيل المغطاة بالأثير القطبية المصنوعة بالكامل من السيليكا المسامية في مقصورة العمود. تأكد من أن العمود يحتوي أيضًا على خرطوشة حراسة موصى بها من قبل الشركة المصنعة مثبتة.
افتح برنامج الحصول على البيانات وانقر نقراً مزدوجاً على تكوين الأجهزة. تسليط الضوء على LCMS وانقر فوق تنشيط الملف الشخصي.
1. انقر فوق مشروع فرعي جديد،أو، إذا كانت هناك مشاريع فرعية أخرى موجودة بالفعل، انقر فوق نسخ المشروع الفرعي. قم بتسمية المشروع الفرعي.
2. انقر فوق مستند جديد. انقر نقرا مزدوجا على طريقة الاستحواذ. انقر فوق المواصفات الشامل داخل إطار أسلوب الاستحواذ.
3. تغيير نوع المسح المنسدل إلى MRM (MRM). تأكد من تعيين القطبية إلى إيجابية.
4. انقر فوق استيراد قائمة وحدد ملف .csv MDR-TB LCMS أسلوب transitions.csv المضمنة في المواد التكميلية.
5. مرر لأسفل وحدد المدة إلى 16.751 دقيقة. سيتم ملء وقت الدورة المناسب وعدد الدورات تلقائيًا.
6. في الشريط الجانبي الأيسر، انقر فوق صمام فالكو المتكامل. تأكد من أن اسم الموضع للخطوة 0 هو A. في عمود إجمالي الوقت (دقيقة) ، اكتب في 0.4 في الصف الأول و 13 في الصف الثاني.
7. في عمود الموضع، قم بتعيين الصف الأول إلى B والصف الثاني إلى A.
8. في الشريط الجانبي الأيسر، انقر فوق مضخة ثنائية. تعيين جدول معدل التدرج والتدفق وفقًا للجدول 4.
9. في الشريط الجانبي الأيسر، انقر فوق Autosampler. تغيير حجم الحقن إلى 10 ميكرولتر. انقر فوق التحكم في درجة الحرارة تمكين وتعيين إلى 4 درجات مئوية.
10. في الشريط الجانبي الأيسر، انقر فوق مقصورة العمود. تعيين كل من درجات الحرارة اليمنى واليسرى إلى 50 درجة مئوية.
11. إغلاق وحفظ الأسلوب.
إنشاء دفعة بالنقر فوق مستند جديد وتحديد دفعة الاستحواذ. اكتب اسم مجموعة وحدد الأسلوب الذي تم إنشاؤه حديثًا من الشريط المنسدل.
1. في جدول البيانات، قم بإنشاء دفعة تتبع هذا الترتيب: منحنى المعايرة، وضوابط الجودة، وعينات المريض، ومنحنى المعايرة، وضوابط الجودة، وعينات المرضى، ومنحنى المعايرة، وضوابط الجودة. إضافة حقن فارغة المذيبات في بداية ونهاية المدى، وكذلك قبل وبعد منحنى المعايرة، وضوابط الجودة وعينات المريض. وضع ما لا يقل عن ثمانية حقن فارغة المذيبات بعد حقن منحنى المعايرة وقارورة مراقبة الجودة العالية من أجل الحد من الحمل اللايليت.
  ملاحظة: قد تحتاج إلى إضافة المزيد من الحقن الفارغة المذيبة اعتمادًا على عمر العمود.
2. في العمود المجاور لأسماء العينة، اكتب موضع العينات التلقائية المناسبة للقارورة المقابلة.
3. انقر فوق إضافة مجموعة. في الإطار المنبثق، اكتب عدد العينات في الدفعة.
4. نسخ ولصق أسماء العينات ومواقع القارورة من جدول البيانات إلى الدفعة التي تم إنشاؤها حديثًا.
5. انتقل إلى علامة التبويب إرسال. انقر على زر إرسال.
نظام Equilibrate عن طريق إدراج خط المذيبات A في المرحلة المتنقلة A وخط المذيبات B في المرحلة المتنقلة B. افتح صمام التطهير على المضخة الثنائية.
1. تعيين تكوين المذيبات إلى 50٪ B بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة. تشغيل مضخة ثنائية.
2. بعد 5 دقيقة، وانخفاض تدفق إلى 0.3 مل / دقيقة. إغلاق صمام التطهير. تحقق من وجود أي تسريبات.
3. في البرنامج، اضغط على Equilibrate على شريط الأدوات العلوي. تعيين الوقت إلى > 5 دقيقة، اضغط موافق.
4. بعد أن يكون الجهاز مُتوازنًا، ستظهر الوحدات الموجودة في أسفل يمين النافذة باللون الأخضر. تأكد من استقرار الضغط، ثم ابدأ الدفعة بالنقر فوق نموذج البدء .

4 - تحليل البيانات

بعد اكتمال الدفعة، افتح برنامج الكمية. انقر فوق رمز العصا لإنشاء جدول نتائج جديد.
1. انقر فوق استعراض للانتقال إلى المجلد المناسب، ثم قم بتمييز ملف البيانات وانقر فوق السهم الذي يشير إلى اليمين لنقل البيانات إلى المنطقة المحددة. انقر فوق التالي.
2. حدد إنشاء طريقة جديدة وانقر فوق جديد. إدخال اسم أسلوب الكمية الجديدة واضغط على حفظ ثم التالي.
3. حدد الحقنة الأولى لنقطة المعايرة الوسطى. اضغط التالي.
4. علامة علامة كافة التحولات من المعايير الداخلية في العمود IS.
5. بالنسبة لانتقالات الكمية للمعايير المرجعية، حدد IS المطابق في عمود اسم IS. انقر فوق التالي.
6. مرر خلال الانتقالات للتأكد من دقة وقت الاحتفاظ المحدد تلقائيًا. تأكد من تعيين التنعيم الغاوسي إلى 1.5. يمكن أن تبقى كافة الإعدادات الافتراضية الأخرى كما هي (أي نسبة الضوضاء 100٪، والفرعية الأساسية. نافذة 2.00 دقيقة، ذروة تقسيم 2 نقطة).
  ملاحظة: إذا أردت، قم بتعديل معلمات التكامل التلقائي عند هذه النقطة. منذ تغيير هذه المعلمات على أساس إعداد الصك، ونحن لم تدرج لنا هنا.
7. انقر فوق إنهاء لتطبيق أسلوب الكمية على الدفعة.
انقر فوق أعلى اليسار يعرض زر مراجعة الذروة لعرض الكروماتوجرام. التنقل خلال التحولات باستخدام الشريط الجانبي الأيسر. انتقل من خلال كل حقنة من كل انتقال الكمية ودمج يدويا الذروة الصحيحة إذا لزم الأمر.
1. لدمج الذروة يدويًا، انقر على زر تمكين وضع التكامل اليدوي، وقم بالتكبير في الرسم البياني عن طريق النقر والسحب على طول المحور x أو y، ثم ارسم خطًا من خط أساس إلى خط الأساس الآخر، مع تحديد الذروة. ويبين الشكل 3 اثنين من الكروماتوغرام: واحد يحتوي على INH، وبالتالي تم دمجه يدوياً، وآخر لا يحتوي على INH.
  ملاحظة: يجب دمج كافة الحقن باستخدام نفس المعلمات. يمكن أن يوفر عرض الذروة إرشادات للالتزام بهذه المعلمات، ولكن في بعض الأحيان سيختلف عرض الذروة. ولتحديد مقدار الذروة، يجب أن يكون وقت الاحتفاظ في حدود ± 0.15 دقيقة من وقت الاحتفاظ المتوقع لذلك الأنعاض (كما هو محدد بالقمم القياسية المرجعية)، والتأكد نوعياً من أن لديه النسبة الكمية المتوقعة إلى النسبة المؤهلة (كما هو مبين في الشكل 2)،وأن تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء أكبر من 10.
في عمود نوع العينة، قم بتعيين حقن منحنى المعايرة (باستثناء حقن منحنى المعايرة الفارغة) إلى قياسي. تعيين حقن مراقبة الجودة لمراقبة الجودة. ترك الحقن المتبقية كما غير معروف.
ملاحظة: سيتم تعيين هذا عبر كافة الانتقالات.
في عمود التركيز الفعلي، اكتب التركيزات الموجودة في الجدول 5 لجميع منحنيات المعايرة وحقن مراقبة الجودة.
انقر فوق الثاني من أعلى اليسار يعرض زر منحنى المعايرة. انقر على زر الانحدار.
تعيين نوع الترجيح إلى 1/x واضغط موافق.
التحقق من صحة منحنى المعايرة وعينات مراقبة الجودة للتأكد من أن الدفعة ركض بنجاح.
1. لكل انتقال مرجع كمي (وليس التحولات القياسية الداخلية)، انظر إلى كل دقة حقن منحنى معايرة (في عمود الدقة). يجب أن يكون لثلثي نقاط المعايرة على الأقل دقة في حدود 80-120%.
2. بالنسبة لنقاط المعايرة خارج الدقة المتوقعة، قد تكون الحقنة شاذة. استبعاد القيم المتطرفة إذا كان تركيزها المحسوب هو أكثر من انحرافين معياريين بعيدا عن الحقنتين الأخريين من تلك القارورة. النقر على "et الذروة إلى 'لم يتم العثور على زر فوق كل كروماتوغرام.
3. تأكد من أن قيمة R المعروضة فوق منحنى المعايرة هي > 0.975.
4. تأكد من أن جميع حقن مراقبة الجودة لها دقة في حدود 80-120٪.
إذا تم استيفاء جميع الشروط المذكورة أعلاه، فقد مرت الدفعة، ويمكن قياس العينات. انقر فوق تحرير في شريط الأدوات، ثم انقر فوق نسخ الجدول بأكمله. لصق الجدول في جدول بيانات.
خذ متوسط التركيز المحسوب لحقن العينتين لتحديد التركيز المبلغ عنه لكل عينة.

النتائج

ويرد في الشكل 1رسم توضيحي لكروماتوغرام مع مستويات مؤكدة من جميع أدوية السل المقاوم للأدوية البالغ عددها 11 دواء. يمكن أن يتغير وقت الاحتفاظ لكل منافيعند استخدام أدوات وأعمدة مختلفة، لذلك يجب تحديد وقت الاحتفاظ الدقيق بشكل فردي.

وترد في الشكل 2

Discussion

نحن نبلغ هنا عن بروتوكول الطريقة التي طورناها والتحقق من صحتها لتحديد 11 دواءً مضادًا للسل تستخدم في علاج السل المقاوم للأدوية في عينات الشعر الصغيرة باستخدام LC-MS/MS. لم يتم تطوير أي طريقة أخرى لقياس هذه الأدوية الـ 11 في الشعر من قبل والتحقق من صحتها ونشرها. يمكن لطريقتنا قياس مستويات الأدوي?...

Disclosures

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية RO1 AI123024 (شارك في تنظيم القاعدة: جون ميتكالف ومونيكا غاندي).

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا البروفيسور ة كيرتان ديدا، والدكتور علي إسماعيل، وماريتجي بريتوريوس في معهد الرئة بجامعة كيب تاون، الذين سهلوا جمع عينات الشعر من أجل الدراسة. كما أن المؤلفين يكرّدون بامتنان مساهمات المشاركين في هذه الدراسة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL injection vials	Agilent Technologies	5182-0716
250 uL injection vial inserts	Agilent Technologies	5181-8872
Bead ruptor 24	OMNI International	19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)	OMNI International	19628
Bedaquiline	Toronto Research Chemicals	B119550
Bedaquiline-d6	Toronto Research Chemicals	B119552
Clofazimine	Toronto Research Chemicals	C324300
Clofazimine-d7	Toronto Research Chemicals	C324302
Disposable lime glass culture tubes	VWR	60825-425
Ethambutol	Toronto Research Chemicals	E889800
Ethambutol-d4	Toronto Research Chemicals	E889802
Ethionamide	Toronto Research Chemicals	E890420
Ethionamide-d5	ClearSynth	CS-O-06597
Formic acid	Sigma-Aldrich	F0507-100mL
Glass bottles	Corning	1395-1L
Hot Shaker	Bellco Glass Inc	7746-32110
HPLC	Agilent Technologies	Infinity 1260
HPLC grade acetonitrile	Honeywell	015-4
HPLC grade methanol	Honeywell	230-1L
HPLC grade water	Aqua Solutions Inc	W1089-4L
Isoniazid	Toronto Research Chemicals	I821450
Isoniazid-d4	Toronto Research Chemicals	I821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm	Phenomenex	00D-4371-B0
LC guard cartridge	Phenomenex	AJ0-8788
LC guard cartridge holder	Phenomenex	AJ0-9000
LC-MS/MS quantitation software	Sciex	Multiquant 2.1
Levofloxacin	Sigma-Aldrich	1362103-200MG
Levofloxacin-d8	Toronto Research Chemicals	L360002
Linezolid	Toronto Research Chemicals	L466500
Linezolid-d3	Toronto Research Chemicals	L466502
Micro centrifuge tubes	E&K Scientific	695554
Moxifloxacin	Toronto Research Chemicals	M745000
Moxifloxacin-13C, d3	Toronto Research Chemicals	M745003
MS/MS	Sciex	Triple Quad 5500
OPC 14714	Toronto Research Chemicals	O667600
Pretomanid (PA-824)	Toronto Research Chemicals	P122500
Prothionamide	Toronto Research Chemicals	P839100
Prothionamide-d5	Toronto Research Chemicals	P839102
Pyrazinamide	Toronto Research Chemicals	P840600
Pyrazinamide-15N, d3	Toronto Research Chemicals	P840602
Septum caps for injection vials	Agilent Technologies	5185-5862
Turbovap LV evaporator	Biotage	103198/11

References

Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: