Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hastaların kompleks ilaca dirençli tüberküloz (DR-TB) rejimlerine bağlılığını analiz etme yöntemleri yanlış ve kaynak yoğun olabilir. Yöntemimiz, 11 DR-TB ilaç konsantrasyonları için kolayca toplanan ve depolanan bir matris olan saçı analiz eder. LC-MS/MS kullanarak, uyuşturucuya bağlılığı daha iyi anlamak için kullanılabilen alt nanogram ilaç düzeylerini belirleyebiliriz.

Özet

Ilaca dirençli tüberküloz (DR-TB) giderek büyüyen bir halk sağlığı tehdididir ve terapötik ilaç düzeylerinin değerlendirilmesi önemli klinik yararları olabilir. Plazma ilaç düzeyleri mevcut altın standart değerlendirme, ancak flebotomi ve soğuk zincir gerektirir, ve sadece çok yakın bağlılık yakalamak. Yöntemimiz saç kullanır, kolayca toplanan ve uzun vadeli bağlılık yansıtıcı bir matris, 11 anti-TB ilaçlar için test etmek. Grubumuz tarafından önceki çalışma saç antiretroviral ilaç düzeyleri HIV sonuçları ile ilişkili olduğunu göstermektedir. DR-TB ilaçlar için yöntemimiz 2 mg saç (kök için 3 cm proksimal), hangi pulverize ve metanol ayıklanır kullanır. Numuneler tek bir LC-MS/MS yöntemi ile analiz edilir ve 16 dk'lık bir çalışmada 11 ilaç ölçülür. 11 ilaç için daha düşük nicelik sınırları (LLOQs) 0.01 ng/mg ile 1 ng/mg arasında değişmektedir. İki kütle spektrometresi geçişinin oranları karşılaştırılarak ilaç varlığı doğrulanır. Örnekler, ilacın deuterated, 15N-veya 13C etiketli ilaç isotopolog için alan oranı kullanılarak ölçülür. 0.001-100 ng/mg arasında değişen bir kalibrasyon eğrisi kullandık. Dr-TB hastalarından doğrudan gözlenen tedavi (DOT) üzerine toplanan saç örneklerinden alınan kolaylık örneğine yöntemin uygulanması, on bir ilacın dokuzu (izoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloksasin, moksifloksasin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid) lineer dinamik aralığında saçtaki ilaç düzeylerini göstermiştir. Hiçbir hasta protionamide değildi ve etionamid için ölçülen düzeyler LLOQ'ya yakındı (daha fazla çalışma yerine etionamid'in metabolitinin maruziyeti izlemek için uygunluğu nun incelenmesi). Özetle, saçlarda DR-TB ilaçları için çok analit panelinin geliştirilmesini ilaca dirençli tüberküloz tedavisi sırasında terapötik ilaç izleme tekniği olarak tanımlıyoruz.

Giriş

Yirmi birinci yüzyılda, ilaca dirençli Tüberküloz (DR-TB) zaten zayıf ulusal Tüberküloz kontrol programları için gelişen bir felaket, teyit durumlarda sadece son 5 yıl içinde iki katına ile, tüm ölümlerin yaklaşık üçte biri için muhasebe küresel antimikrobiyal direnç ile ilgili1,2. DR-TB'nin başarılı tedavisi, geleneksel olarak ilaca duyarlı tüberküloz tedavisinden daha uzun ve daha toksik ikinci basamak rejimlere ihtiyaç dalmıştır. Ayrıca, DR-TB olan hastalar genellikle başlangıçta direnç ortaya çıkmasına katkıda bağlılık için önemli önceden varolan zorluklar var3.

Viral yüklertedaviizlemek için kullanılabilir HIV enfeksiyonu aksine, Tüberküloz tedavi yanıtı vekil uç noktaları gecikmiş ve bireysel düzeyde güvenilmez4. Subterapötik anti-TB ilaç konsantrasyonu ve tedavi başarısızlığının önemli bir belirleyicisi olan hasta bağlılığının izlenmesi de zordur. Kendi kendine bildirilen bağlılık geri çağırma önyargı ve istek sağlayıcıları5,,6lütfen muzdarip. Hap sayıları ve ilaç olay izleme sistemleri (MEMS) daha objektifolabilir 7 ama gerçek ilaç tüketimi ölçmek yok8,9,10. Biyomatrises ilaç düzeyleri hem bağlılık ve farmakokinetik veri sağlayabilir. Bu nedenle, plazma ilaç düzeyleri yaygın terapötik ilaç izleme kullanılır11,12. Ancak, ilaç bağlılığı izleme bağlamında, plazma düzeyleri kısa süreli maruziyeti temsil eder ve uygun bağlılık referans aralığı belirlenirken hastalar arası ve hastalar arası önemli değişkenlikle sınırlıdır. "Beyaz ceket" etkileri, nerede bağlılık klinik veya çalışma ziyaretleri öncesinde geliştirir, daha doğru ilaç yapışma desenleri sağlamak için plazma düzeylerinin yeteneğini zorlaştırır13.

Saç uzun vadeli ilaç maruziyeti ölçebilirsiniz alternatif bir biyomatrik olduğunu14,15. Birçok ilaç ve endojen metabolitleri saç büyüdükçe sistemik dolaşımdan saç protein matris içine dahil. Bu dinamik süreç saç büyüme sırasında devam ederken, saç matris yatırılan ilaç miktarı dolaşımda ilacın sürekli varlığına bağlıdır, saç ilaç alımının mükemmel bir zamansal okuma yapma. Bir biyomatris olarak Saç kolayca depolama ve sevkiyat için soğuk zincir için kana göre gerek kalmadan toplanan ek avantajı vardır. Ayrıca, saç alanında ek fizibilite avantajları sağlayan, biyolojik olmayan tehlikelidir.

Saç ilaç düzeyleri uzun adli uygulamalarda kullanılmıştır16. Son on yılda, saç antiretroviral (ARV) düzeyleri HIV tedavisi ve önleme de uyuşturucu bağlılığını değerlendirmede yarar göstermiştir, hangi grubumuzun katkıda bulunmuştur. Saçarv,düzeyleri HIV enfeksiyonu17,,18,19,,20,,21tedavi sonuçlarının en güçlü bağımsız belirleyicileri olduğu gösterilmiştir. DR-TB hastalarının saç düzeylerinin tedavi sonucunu tahmin etmede aynı faydaya sahip olup olmadığını belirlemek için, küçük saç örneklerinde 11 DR-TB ilaçlarını analiz etmek için bir yöntem geliştirmek ve doğrulamak için LC-MS/MS kullandık. Testperformansının ilk değerlendirmesi olarak, Dr-TB'li hastaların batı cape, Güney Afrika22'dedoğrudan gözlenen tedavi (DOT) alan bir kolaylık örneğinde DR-TB ilaç düzeylerini ölçtük.

Protokol

Tüm hastalar saç örneği toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verilmiştir. Cape Town Üniversitesi ve San Francisco California Üniversitesi'nden Kurumsal İnceleme Kurulu onayı aldık.

1. Saç örneklemesi

  1. Yazılı bilgilendirilmiş onay alın.
  2. Mümkün olduğunca kafa derisi yakın oksipital bölgeden yaklaşık 20-30 kafa derisi saç telleri kesmek için temiz makas kullanın.
  3. Yönü belirtmek için saçın distal tarafının etrafına bant yerleştirin. Kat saç örneği bir alüminyum folyo kare içine ve oda sıcaklığında saklayın. Proksimal ucun ek kullanımından kaynaklanan olası kontaminasyonu önlemek için saçın distal ucunu etiketleyin.
  4. Hasta örneklerine ek olarak, "boş saç" toplamak: Tüberküloz ilaç almamış birinden bir kafa derisi saç örneği. Her 20 hasta örneği için büyük miktarda (>30 mg boş saç) toplayın.

2. İlaç çıkarma

  1. Etiket boncuk tüpleri. Her hasta örneğine bir tüp gerekiyor. 12 kalibrasyon noktasının her biri için bir tane olan "C0"den "C11"e kadar 12 tüpü etiketle. Düşük Kalite Kontrolü için bir tüp, Orta Kalite Kontrol için bir tüp ve Yüksek Kalite Kontrol için bir tüp etiketlayın. Son olarak, Matrix Blank için bir tüp etiket.
  2. Saç örneği içeren alüminyum folyo kareaçın. Saç örneği 3 cm'den uzunsa, proksimal ucundan 3 cm'de saç kesin ve analiz için bu proksimal kısmı kullanın.
  3. Bir boncuk tüpü içine saç örneğinin 2 mg tartın.
  4. 16 ek boncuk tüpleri içine boş saç 2 mg tartın. Bunlar kalibrasyon noktaları, kalite kontrolleri ve matris boş olarak kullanılacaktır. Tüpler, 2.8 ve 2.9 adımlarında belirtilen seviyelerde ilaç referans standartları yla çivilenmenin yanı sıra, hasta örnekleriyle aynı ekstraksiyon prosedürünü izleyecektir.
  5. Tüm boncuk tüplerini homogenizer yerleştirin. Homogenizer'i 6,95 m/s. Hızda çalıştırın.
  6. Dahili standart karışımı olun ve örneklere ekleyin.
    1. 50 mL hacimsel şişeye ~40 mL metanol ekleyin.
    2. Kehribar cam şişelerde, çözücü olarak metanol kullanarak Tablo 1'degösterilen iç standartların karışımlarını yapın.
      NOT: Metanol çok uçucudur. Buharlaşma nedeniyle kaybı önlemek için bu işlem sırasında tüm şişeleri kapaklı bırakın.
    3. Bu karışımlardan Tablo 1'de gösterilen hacmi 50 mL hacimsel şişeye ekleyin. Sonra, metanol ile 50 mL için şişe doldurun.
    4. Volumetrik şişeyi kaplayıp karıştırın. Matris boş tüp hariç, toz haline getirilmiş saç tüplerinin her birine karışımın 500 0L'sini ekleyin. Matris boş tüpe 500 μL metanol ekleyin.
  7. Referans standart karışımları olun.
    1. Adım 2.7.2 tabloda gösterilen konsantrasyonu elde etmek için metanol ile aşağıdaki ilaçların düzgün referans standartlarını oluşturmaktadır. Aşağıdaki konsantrasyonların sadece 1 mL'si gereklidir.
    2. Bir şişeye 1768 μL metanol ekleyin ve 2 mL son hacmi elde etmek için Tablo 2'de listelenen referans standart miktarlarını aynı şişeye ekleyin. Etiket bu şişe "Ref Std Mix 1x". Girdap.
    3. "Ref Std Mix 1x"ten yeni bir şişede 900 μL metanol'e 100°L'lik bir artış. Etiket bu şişe "Ref Std Mix 10x". Girdap.
    4. "Ref Std Mix 10x"ten yeni bir şişede 900 μL metanol'e 100°L'lik bir artış. Etiket bu şişe "Ref Std Mix 100x". Girdap.
    5. "Ref Std Mix 100x"ten yeni bir şişede 900 μL metanol'e 100°L'lik bir artış. Etiket bu şişe "Ref Std Mix 1000x". Girdap.
  8. Tablo 3'teaçıklanan Ref Std Mix miktarını ekleyerek kalibrasyon eğrisi tüplerini dikin.
  9. QC karışımları ve başak kalite kontrol tüpleri oluşturun.
    1. Etiket 5 şişeleri "QC-A" ile "QC-E".
    2. Beş etiketli şişeye aşağıdaki miktarda metanol ekleyin:
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. Adım 2.7.1'de oluşturulan 1 mg/mL ilaç stoklarını kullanarak, aşağıda listelenen belirli şişelere 10 μL ekleyin. 0,5 mg/mL olan BDQ ve CLF stokları için, aşağıda listelenen şişelere 20 μL ekleyin.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      NOT: Bazı ilaçlar birden fazla karışımda mevcuttur.
    4. Bir şişeyi "QC-A df100" olarak etiketlendirin. 990 μL metanol içine QC-A 10 μL seyreltin.
    5. Bir şişeyi "Düşük QC stoku" olarak etiketle. Bu şişeye 1832 μL metanol ekleyin. Aşağıda ayrıntılı QC karışımları miktarları ekleyin:
      QC-A df100: 80 μL
      QC-B: 8 μL
      QC-C: 80 μL
       
    6. Bir şişeyi "Mid QC stoku" olarak etiketle. Bu şişeye 760 μL metanol ekleyin. Aşağıda ayrıntılı QC karışımları miktarları ekleyin:
      QC-A df100: 800 μL
      QC-B: 40 μL
      QC-C: 400 μL
       
    7. Bir şişeyi "High QC stoku" olarak etiketle. Bu şişeye 1376 μL metanol ekleyin. Aşağıda ayrıntılı QC karışımları miktarları ekleyin:
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/mL stok: 16 μL
      INH, 1mg/mL stok: 32 μL
      LFX, 1mg/mL stok: 32 μL
      LZD, 1mg/mL stok: 32 μL
      PZA, 1mg/mL stok: 32 μL
       
    8. Low QC boncuk tüpü içine Spike 10 μL Düşük QC stok.
    9. Spike 10 μL Mid QC stok Mid QC boncuk tüpü içine.
    10. Yüksek QC boncuk tüpü içine Spike 10 μL High QC stok.
  10. Tüm tüpleri 37 °C'de 2 saat sıcak çalkalayıcıya yerleştirin. Sallayarak su tüpler üzerine sıçramaz yeterince yavaş olmalıdır.
  11. Tüpleri çalkalayıcıdan çıkarın. Boncuk tüplerinden sıvıyı yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın. Bu mikrosantrifüj tüplerini aynı şekilde etiketle.
  12. Eski tüplere 500 μL metanol ekleyin. Şapka ve girdap.
  13. İkinci kez, ilgili mikrocentrifuge tüp içine boncuk tüpleri sıvı aktarın. Toz haline getirilmiş saç transferi tamamdır. Bu eninde sonunda santrifüj edilecek.
  14. 2.800 x g10 dakika mikrosantrifüj tüpleri santrifüj .
  15. Sıvıyı dikkatlice çıkarın ve ilgili etiketlere sahip yeni santrifüj tüplere aktarın. Saç peletini rahatsız etmemeye veya aktarmamaya dikkat edin.
  16. Santrifüj tüplerinde bulunan sıvıyı 32 °C'de kuruluğa kadar buharlaştırın.
  17. Kuru tüplere 200 μL mobil faz A (%1 formik asitli HPLC sınıfı su) ekleyerek numuneleri yeniden oluşturun. Girdap.
  18. Sıvıyı 250°L'lik kesici uçlarla kehribar şişelerine aktarın.

3. LC-MS/MS hazırlığı

  1. Bir litrelik hacimsel şişeye hplc dereceli su ekleyerek bir litre lik mobil faz A (%1 formik asitli HPLC dereceli su) yapın. Daha sonra bu şişeye 10 mL >%95 formik asit ekleyin ve sonra hplc dereceli su ile çizgiye doldurun.
    1. Bir litrelik hacimsel şişeye bazı asetonitril ekleyerek bir litre mobil faz B (%0.1 formik asit ile asetonitril) yapın. Daha sonra bu şişeye 1 mL >%95 formik asit ekleyin ve sonra asetonitril ile çizgiye doldurun.
  2. 2,5 μm partikül boyutuve 100 şgözenek boyutunda polar kapaklı, eter bağlantılı fenil boncuklar kolektüste gözenekli silikadan yapılmış 2 x 100 mm'lik bir kolon kurun. Bu sütunun üretici tarafından önerilen koruma kartuşu da takıldığından emin olun.
  3. Veri toplama yazılımını açın ve Donanım Yapılandırması'nı çift tıklatın. LCMS'yi vurgulayın ve Profili Etkinleştir'itıklatın.
    1. Yeni Alt Proje'yitıklatın veya diğer alt projeler zaten varsa, Alt Projekopyala'yıtıklatın. Alt projeyi adlandırın.
    2. Yeni Belge'yitıklatın. Çift tıklatma Edinme Yöntemi. Edinme yöntemi penceresinde Kütle Spec'i tıklatın.
    3. Scan Type açılır düşüşünü MRM (MRM)olarak değiştirin. Polarite Pozitifolarak ayarlandıemin olun.
    4. İçe Aktarma Listesi'ni tıklatın ve Tamamlayıcı Malzemeler'de yer alan .csv dosyası MDR-TB LCMS yöntem geçişleri.csv'yi seçin.
    5. Aşağı kaydırın ve Süreyi 16.751 dk olarak ayarlayın. Uygun döngü süresi ve döngü sayısı otomatik olarak doldurulur.
    6. Sol kenar çubuğunda Entegre Valco Vana'yıtıklatın. Adım 0'ın pozisyon adının A olduğundan emin olun. Toplam Süre (min) sütununda, ilk satırda 0,4 ve ikinci satırda 13 yazın.
    7. Konum sütununda, satırı 1'den B'ye, ikinci satırı da A'ya ayarlayın.
    8. Sol kenar çubuğunda, İkili Pompa'yıtıklatın. Degrade ve akış hızı tablosunu Tablo 4'egöre ayarlayın.
    9. Sol kenar çubuğunda Autosampler'ıtıklatın. Enjeksiyon hacmini 10 μL'ye değiştirin. Sıcaklık kontrolü etkin ve 4 °C olarak ayarlayın tıklatın.
    10. Sol kenar çubuğunda Sütun Bölmesi'nitıklatın. Hem sağ hem de sol sıcaklıkları 50 °C'ye ayarlayın.
    11. Yöntemi kapatın ve kaydedin.
  4. Yeni Belge'yi tıklatarak ve Edinme Toplu İşleminiseçerek toplu iş oluşturun. Bir ayar adı yazın ve açılır bırakma çubuğundan yeni oluşturulan yöntemi seçin.
    1. Elektronik tabloda, bu sırayı takip eden bir toplu iş oluşturun: kalibrasyon eğrisi, kalite kontrolleri, hasta örnekleri, kalibrasyon eğrisi, kalite kontrolleri, kalibrasyon eğrisi. Çalışma başında ve sonunda solvent boş enjeksiyonlar ekleyin, yanı sıra öncesi ve kalibrasyon eğrisi, kalite kontrolleri ve hasta örnekleri sonra. Analit taşımayı azaltmak için kalibrasyon eğrisi ve yüksek kaliteli kontrol şişesi enjeksiyonlarından sonra en az sekiz solvent boş enjeksiyon koyun.
      NOT: Sütun yaşına bağlı olarak daha fazla solvent boş enjeksiyon eklenmesi gerekebilir.
    2. Örnek adlara bitişik sütunda, ilgili şişe için uygun autosampler konumunu yazın.
    3. Set Ekle'yitıklatın. Açılır pencerede, toplu işteki örnek sayısını yazın.
    4. Örnek adları ve şişe konumlarını elektronik tablodan yeni oluşturulan toplu işleme kopyalayın ve yapıştırın.
    5. Gönder sekmesine gidin. Submit
  5. Çözücü a hattını mobil faz A'ya ve b çözücü hattını mobil fazA takarak sistemi dengeleyin.
    1. Solvent bileşimini 4 mL/dk akış hızında %50 B'ye ayarlayın. İkili pompayı açın.
    2. 5 dk sonra, 0.3 mL/dk. Herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
    3. Yazılımda, üst araç çubuğunda Equilibrate tuşuna basın. Zamanı >5 dk olarak ayarlayın, Tamamtuşuna basın.
    4. Cihaz dengeledikten sonra, pencerenin sağ alt kısmındaki modüller yeşil görünür. Basıncın sabitlendiğini kontrol edin ve Ardından Örnek Başlat'ı tıklatarak toplu işlemi başlatın.

4. Veri analizi

  1. Toplu işlem tamamlandıktan sonra nicelik lendirme yazılımını açın. Yeni bir Sonuç tablosu oluşturmak için değnek simgesini tıklatın.
    1. Uygun klasöre gitmek için Gözat'ı tıklatın ve ardından veri dosyasını vurgulayın ve verileri Seçili alana taşımak için sağ işaret ok'una tıklayın. İleri'yitıklatın.
    2. Yeni Yöntem Oluştur'u seçin ve Yeni'yitıklatın. Yeni quantitation yöntemi adı giriş ve Kaydet ve sonra Sonrakituşuna basın.
    3. Orta kalibrasyon noktasının ilk enjeksiyonunu seçin. İlerituşuna basın.
    4. Is sütunundaki tüm iç standartların IS geçişlerini işaretleyin.
    5. Referans standartları için niceleyici geçişleri için, IS Adı sütunundaki ilgili IS'yi seçin. İleri'yitıklatın.
    6. Otomatik olarak seçilen bekletme süresinin doğru olduğundan emin olmak için geçişler arasında ilerleyin. Gaussian Smoothing'in 1,5 olarak ayarlandıklarından emin olun. Diğer tüm varsayılan ayarlar olduğu gibi kalabilir (örneğin, Gürültü Yüzdesi %100, Temel Alt. Pencere 2.00 dk, Tepe Bölme 2 puan).
      NOT: İstenirse, bu noktada otomatik tümleştirme parametrelerini değiştirin. Bu parametreler alet kurulumuna bağlı olarak değiştiğinden, bizimkini buraya dahil etmedik.
    7. Toplu iş için niceliklendirme yöntemini uygulamak için Bitiş'i tıklatın.
  2. Sol üstteki kromatogramları görüntülemek için en yüksek inceleme düğmesini görüntüler'i tıklatın. Sol kenar çubuğunu kullanarak geçişler arasında ilerleyin. Her niceleyici geçişinin her enjeksiyonunda ilerleyin ve gerekirse doğru tepeyi el ile tümleştirin.
    1. Bir tepeyi el ile tümleştirmek için, el ile tümleştirme modunu etkinleştir düğmesine tıklayın, x veya y eksenini tıklatıp sürükleyerek kromatogramı yakınlaştırın ve ardından bir taban çizgisinden diğerine bir çizgi çizerek tepeyi tanımlayın. Şekil 3 iki kromatogram gösterir: biri INH'si olan ve bu nedenle el ile entegre edilmiş, diğeri de INH'si olmayan.
      NOT: Tüm enjeksiyonlar aynı parametreler kullanılarak entegre edilmelidir. En yüksek genişlik bu parametrelere bağlı kalmak için bir kılavuz sağlayabilir, ancak bazen tepe genişliği farklılık gösterir. Bir tepeyi ölçmek için, bekletme süresi o analiz için beklenen bekletme süresinin ±0,15 dakika içinde (referans standart zirveleri ile tanımlandığı gibi), yeterlik oranına beklenen niceleyiciye sahip olduğu niteliksel olarak doğrulanmış olmalıdır (Şekil 2'degösterildiği gibi ), ve sinyal-gürültü oranı 10'dan büyükolmalıdır.
  3. Örnek Tipi sütununda kalibrasyon eğrisi enjeksiyonlarını (boş kalibrasyon eğrisi enjeksiyonları hariç) Standartolarak ayarlayın. Kalite kontrol enjeksiyonlarını Kalite Kontrol'e ayarlayın. Kalan enjeksiyonları bilinmiyorolarak bırakın.
    NOT: Bu tüm geçişler arasında ayarlanır.
  4. Gerçek Konsantrasyon sütununda, tüm kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrol enjeksiyonları için Tablo 5'te bulunan konsantrasyonları yazın.
  5. Sol üstten ikinciyi tıklatın Kalibrasyon eğrisi düğmesini görüntüler. Regresyon düğmesini tıklatın.
  6. Ağırlık Türünü Type 1/x olarak ayarlayın ve Tamamtuşuna basın.
  7. Toplu iş başarılı bir şekilde koştuemin olmak için kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrol örnekleri doğrulayın.
    1. Her niceleyici referans geçişi (dahili standart geçişler değil) için, her kalibrasyon eğrisi enjeksiyon doğruluğuna (Doğruluk sütununda) bakın. Kalibrasyon noktalarının en az üçte ikisi %80-120 arasında doğruluk payına sahip olmalıdır.
    2. Kalibrasyon noktaları beklenen doğruluğun çok dışında için, enjeksiyon bir aykırı olabilir. Hesaplanan konsantrasyonları, o şişenin diğer iki enjeksiyonundan iki standart sapmadan daha fazlaysa, aykırıları hariç taçıklar. Her kromatogramın üstünde'bulunamadı düğmesine " et tepesine tıklayarak.
    3. Kalibrasyon eğrisinin üzerinde görüntülenen R değerinin >0.975 olup olmadığını kontrol edin.
    4. Tüm kalite kontrol enjeksiyonları% 80-120 içinde bir doğruluk olup olmadığını kontrol edin.
  8. Yukarıdaki tüm koşullar yerine getirilirse, toplu iş geçti ve örnekler ölçülebilir. Araç çubuğunda Edit'i tıklatın ve ardından tüm tabloyu kopyala'yıtıklatın. Tabloyu elektronik tabloya yapıştırın.
  9. Her numunenin bildirilen konsantrasyonunu belirlemek için iki numune enjeksiyonunun hesaplanan konsantrasyonunun ortalamasını alın.

Sonuçlar

11DR-TB ilacının tümünün doğrulanmış düzeylerine sahip bir kromatogram ın bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Her analyte için bekletme süresi farklı araçlar ve sütunlar kullanırken değişebilir, bu nedenle tam bekletme süresi ayrı ayrı belirlenmelidir.

Kalibratörlerden birinde belirli bir ilaç için çıkarılan Iyon Kromatogramları (EICs), (DR-TB ilaç referans standartları ile çivilenmiş boş saç örneği) ...

Tartışmalar

Burada, LC-MS/MS kullanılarak küçük saç örneklerinde DR-TB tedavisinde kullanılan 11 anti-TB ilaçlarının ölçülmesi için geliştirdiğimiz ve doğruladığımız yöntemin protokolünü rapor ediyoruz. Saçta bu 11 ilaç ölçmek için başka bir yöntem daha önce geliştirilmiş, doğrulanmış ve yayınlanmıştır. Yöntemimiz yaklaşık 3 santimetre (cm) uzunluğunda (~2 mg) sadece 20-30 saç teli ilaçların alt nanogram düzeylerini ölçebilir ve zaten22doğrulanmıştır . İ...

Açıklamalar

Bu çalışma Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe ve Monica Gandhi) tarafından desteklenmiştir.

Teşekkürler

Yazarlar Profesör Keertan Dheda, Dr Ali Esmail ve Marietjie Pretorius University of Cape Town Akciğer Enstitüsü olan çalışma için saç örnekleri nin toplama kolaylaştırdı teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar daha minnetle bu çalışmanın katılımcıların katkılarını kabul.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL injection vialsAgilent Technologies5182-0716
250 uL injection vial insertsAgilent Technologies5181-8872
Bead ruptor 24OMNI International19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)OMNI International19628
BedaquilineToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquiline-d6Toronto Research ChemicalsB119552
ClofazimineToronto Research ChemicalsC324300
Clofazimine-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Disposable lime glass culture tubesVWR60825-425
EthambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EthionamideToronto Research ChemicalsE890420
Ethionamide-d5ClearSynthCS-O-06597
Formic acidSigma-AldrichF0507-100mL
Glass bottlesCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
HPLC grade acetonitrileHoneywell015-4
HPLC grade methanolHoneywell230-1L
HPLC grade waterAqua Solutions IncW1089-4L
IsoniazidToronto Research ChemicalsI821450
Isoniazid-d4Toronto Research ChemicalsI821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
LC guard cartridgePhenomenexAJ0-8788
LC guard cartridge holderPhenomenexAJ0-9000
LC-MS/MS quantitation softwareSciexMultiquant 2.1
LevofloxacinSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacin-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Micro centrifuge tubesE&K Scientific695554
MoxifloxacinToronto Research ChemicalsM745000
Moxifloxacin-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanid (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProthionamideToronto Research ChemicalsP839100
Prothionamide-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PyrazinamideToronto Research ChemicalsP840600
Pyrazinamide-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Septum caps for injection vialsAgilent Technologies5185-5862
Turbovap LV evaporatorBiotage103198/11

Referanslar

  1. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  2. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
  3. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
  4. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
  5. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
  6. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
  7. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
  8. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  9. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
  10. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
  11. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
  12. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
  13. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
  14. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
  15. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
  16. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
  17. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
  18. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
  19. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  20. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
  21. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
  22. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 159LC MS MSMDR TB ila larSa analiziBa l l k takibiTerap tik ila takibiIlaca diren li T berk loz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır