Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli

Riepilogo

Gli attuali metodi di analisi dell'aderenza dei pazienti ai complessi regimi di tubercolosi farmacoresistente (DR-TB) possono essere imprecisi e dispendiosi in termini di risorse. Il nostro metodo analizza i capelli, una matrice facilmente raccolta e conservata, per concentrazioni di 11 farmaci DR-TB. Utilizzando LC-MS/MS, possiamo determinare i livelli di farmaci sub-nanogrammi che possono essere utilizzati per comprendere meglio l'aderenza ai farmaci.

Abstract

La tubercolosi resistente ai farmaci (DR-TB) è una crescente minaccia per la salute pubblica e la valutazione dei livelli terapeutici di farmaci può avere importanti benefici clinici. I livelli di plasma sono l'attuale valutazione del gold standard, ma richiedono flebotomia e una catena del freddo, e catturano solo aderenza molto recente. Il nostro metodo utilizza i capelli, una matrice che è facilmente raccolta e riflettente di aderenza a lungo termine, per testare per 11 farmaci anti-TB. Il lavoro precedente del nostro gruppo mostra che i livelli di farmaci antiretrovirali nei capelli sono associati ai risultati dell'HIV. Il nostro metodo per i farmaci DR-TB utilizza 2 mg di capelli (3 cm prossimali alla radice), che viene polverizzato ed estratto nel metanolo. I campioni vengono analizzati con un singolo metodo LC-MS/MS, quantificando 11 farmaci in una corsa di 16 min. Limiti più bassi di quantificazione (LLOQ) per gli 11 farmaci vanno da 0.01 ng/mg a 1 ng/mg. La presenza di farmaci è confermata confrontando i rapporti di due transizioni di spettrometria di massa. I campioni sono quantificati utilizzando il rapporto di area del farmaco per l'isotopologo del farmaco deuterato, ¹⁵N-, o ¹³etichettato C. Abbiamo usato una curva di calibrazione che va da 0.001-100 ng/mg. L'applicazione del metodo a un campione pratico di campioni di capelli raccolti da pazienti affetti da DR-TB su terapia direttamente osservata (DOT) ha indicato i livelli di droga nei capelli all'interno della gamma dinamica lineare di nove degli undici farmaci (isoniatria, pirazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimina, bedaquiline, premanido). Nessun paziente era in prothionamide, e i livelli misurati per l'etionamide erano vicini al suo LLOQ (con ulteriori lavori invece di esaminare l'idoneità del metabolita dell'etionamide per monitorare l'esposizione). In sintesi, descriviamo lo sviluppo di un pannello multi-analita per i farmaci DR-TB nei capelli come tecnica per il monitoraggio terapeutico dei farmaci durante il trattamento della TB resistente ai farmaci.

Introduzione

Nel XXI secolo, la TB resistente ai farmaci (DR-TB) è una catastrofe in evoluzione per i programmi nazionali di controllo della tubercolosi già deboli, con casi confermati che raddoppiano solo negli ultimi 5 anni, rappresentando quasi un terzo di tutti i decessi legati alla resistenza agli antimicrobici a livello globale^1,2. Il successo del trattamento della DR-TB ha richiesto convenzionalmente regimi di seconda linea più lunghi e tossici rispetto al trattamento per la TB sensibile ai farmaci. Inoltre, i pazienti con DR-TB hanno spesso significative sfide preesistenti per l'aderenza, che hanno contribuito all'emergere di resistenza inizialmente³.

A differenza dell'infezione da HIV in cui i carichi virali possono essere utilizzati per monitorare il trattamento, gli endpoint surrogati della risposta al trattamento nella TB sono ritardati e inaffidabili su un livello individuale⁴. Anche il monitoraggio dell'aderenza del paziente, un importante predittore della concentrazione subterapeutica di farmaci anti-TB e del fallimento del trattamento, è anche impegnativo. L'aderenza auto-segnalata soffre di pregiudizi di richiamo e il desiderio di soddisfare i fornitori^5,6. I conteggi delle pillole e i sistemi di monitoraggio degli eventi farmacologici (MEMS) possono essere più^{oggettivi 7} ma non misurano il consumo effettivo di droga^8,9,10. I livelli di farmaci nelle biomatrici possono fornire sia l'aderenza che i dati farmacoretici. Pertanto, i livelli di farmaci al plasma sono comunemente utilizzati nel monitoraggio terapeutico dei farmaci^11,12. Nel contesto del monitoraggio dell'aderenza ai farmaci, tuttavia, i livelli di plasma rappresentano un'esposizione a breve termine e sono limitati da una significativa variabilità intra e interpaziente nel determinare un intervallo di riferimento adeguato per l'aderenza. Effetti "Mantello bianco", dove l'aderenza migliora prima delle visite in clinica o di studio, complica ulteriormente la capacità dei livelli di plasma di fornire modelli di aderenza ai farmaci accurati¹³.

I capelli sono una biomatrice alternativa in grado di misurare l'esposizione a lungo termine ai farmaci^14,15. Molti farmaci e metaboliti endogeni incorporano nella matrice delle proteine dei capelli dalla circolazione sistemica man mano che i capelli crescono. Come questo processo dinamico continua durante la crescita dei capelli, la quantità di droga depositata nella matrice dei capelli dipende dalla presenza continua del farmaco in circolazione, rendendo i capelli un'eccellente lettura temporale dell'assunzione di droga. Capelli come una biomatrice ha il vantaggio aggiuntivo di essere facilmente raccolti senza la necessità di catena del freddo per lo stoccaggio e la spedizione rispetto al sangue. Inoltre, i capelli non sono biopericolosi, il che fornisce ulteriori vantaggi di fattibilità nel campo.

I livelli di droga dei capelli sono stati a lungo utilizzati in applicazioni forensi¹⁶. Nell'ultimo decennio, i livelli di antiretrovirale dei capelli (ARV) hanno dimostrato utilità nella valutazione dell'aderenza ai farmaci nel trattamento e nella prevenzione dell'HIV, a cui il nostro gruppo ha contribuito. I livelli di ARV nei capelli hanno dimostrato di essere i più forti predittori indipendenti degli esiti del trattamento nell'infezione da HIV^{17,18,19,20,21}. Per determinare se i livelli di capelli dei pazienti affetti da DR-TB avranno la stessa utilità nella previsione dell'esito del trattamento, abbiamo usato LC-MS/MS per sviluppare e convalidare un metodo per l'analisi di 11 farmaci DR-TB in piccoli campioni di capelli. Come valutazione iniziale delle prestazioni della analisi, abbiamo misurato i livelli di farmaci DR-TB in un campione pratico di pazienti con DR-TB che ricevono una terapia osservata direttamente (DOT) nel Capo Occidentale, Sud Africa²².

Protocollo

Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima della raccolta dei campioni di capelli. Abbiamo ottenuto l'approvazione del Institutional Review Board dall'Università di Città del Capo e dall'Università della California, San Francisco.

1. Campionamento dei capelli

1. Ottenere il consenso informato scritto.
2. Utilizzare forbici pulite per tagliare circa 20-30 ciocche di capelli del cuoio capelluto dalla regione occipitale il più vicino possibile al cuoio capelluto.
3. Posizionare il nastro intorno al lato distale dei capelli per indicare la direzionalità. Piegare il campione di capelli in un quadrato di foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente. Etichettare l'estremità dissinale dei capelli per evitare possibili contaminazioni da un'ulteriore manipolazione dell'estremità prossimale.
4. Oltre ai campioni di pazienti, raccogliere "capelli vuoti": un campione di capelli del cuoio capelluto da qualcuno che non ha preso farmaci tb. Raccogliere una grande quantità (>30 mg capelli vuoti per ogni 20 campioni di pazienti).

2. Estrazione di farmaci

1. Etichettare tubi di perline. Ogni campione di paziente richiede un tubo. Etichetta 12 tubi da "C0" a "C11", uno per ciascuno dei 12 punti di calibrazione. Etichettare un tubo per il controllo di bassa qualità, un tubo per il controllo di qualità medio e un tubo per il controllo di alta qualità. Infine, etichettare un tubo per Matrix Blank.
2. Aprire il quadrato di lamina di alluminio contenente il campione di capelli. Se il campione di capelli è più lungo di 3 cm, tagliare i capelli a 3 cm dall'estremità prossimale e utilizzare quella porzione prossimale per l'analisi.
3. Pesare 2 mg del campione di capelli in un tubo di perline.
4. Pesare 2 mg di capelli vuoti in 16 tubi di perlina aggiuntivi. Questi verranno utilizzati come punti di calibrazione, controlli di qualità e matrice vuota. I tubi seguiranno la stessa procedura di estrazione dei campioni del paziente, oltre ad essere con chilo provenienti da standard di riferimento farmacologici ai livelli indicati nei passaggi 2.8 e 2.9.
5. Inserire tutti i tubi di perline nell'omogeneizzatore. Eseguire l'omogeneizzatore alla velocità 6,95 m/s. Correre per due cicli di 30 s ciascuno, con un periodo di riposo di 15 s tra i due cicli.
6. Fare il mix standard interno e aggiungerlo ai campioni.
   1. Aggiungere 40 mL di metanolo a un flacone volumetrico da 50 ml.
   2. Nelle fiale in vetro ambrato, fare le miscele degli standard interni mostrati nella Tabella 1,utilizzando il metanolo come solvente.
      NOTA: il metanolo è molto volatile. Lasciare tutte le fiale chiuse durante questo processo per evitare la perdita dovuta all'evaporazione.
   3. Da queste miscele, aggiungere il volume mostrato nella tabella 1 al flacone volumetrico da 50 ml. Quindi, riempire il pallone a 50 mL con metanolo.
   4. Far cappa e mescolare il pallone volumetrico. Aggiungere 500 l l della miscela ad ciascuno dei tubi per capelli polverizzati, ad eccezione del tubo bianco a matrice. Aggiungere 500 l metanolo al tubo vuoto a matrice.
7. Creare miscele standard di riferimento.
   1. Costituire standard di riferimento pulito dei seguenti farmaci con metanolo per ottenere la concentrazione mostrata nella tabella nel passaggio 2.7.2. È necessario solo 1 mL delle seguenti concentrazioni.
   2. Aggiungere 1768 luna di metanolo a una fiala, quindi aggiungere le quantità di standard di riferimento elencate nella tabella 2 alla stessa fiala per ottenere 2 mL di volume finale. Etichettare questa fiala "Ref Std Mix 1x". Vortice.
   3. Spike 100 -L da "Ref Std Mix 1x" a 900 .L metanolo in una nuova fiala. Etichettare questa fiala "Ref Std Mix 10x". Vortice.
   4. Spike 100 -L da "Ref Std Mix 10x" a 900 .L metanolo in una nuova flaconfia. Etichettare questa fiala "Ref Std Mix 100x". Vortice.
   5. Spike 100 -L da "Ref Std Mix 100x" a 900 .L metanolo in una nuova flaconce. Etichettare questa fiala "Ref Std Mix 1000x". Vortice.
8. Asfondete i tubi della curva di calibrazione aggiungendo la quantità di Miscela di Ref Std descritta nella Tabella 3.
9. Creare miscele QC e tubi di controllo qualità a spillo.
   1. Etichetta 5 fiale da "QC-A" a "QC-E".
   2. Aggiungere le seguenti quantità di metanolo alle cinque fiale etichettate:
      QC-A: 990 -L
      QC-B: 940 ll
      QC-C: 950 ll
      QC-D: 980 ll
      QC-E: 950 -L
       
   3. Utilizzando gli stock di 1 mg/mL di droga creati al passo 2.7.1, aggiungere 10 L alle fiale specifiche elencate di seguito. Per le scorte BDQ e CLF, che sono a 0,5 mg/mL, aggiungere 20 l alle fiale elencate di seguito.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, L'D, MFX, P-A
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM
      
      NOTA: Alcuni farmaci sono presenti in più miscele.
   4. Etichettare una fiala come "QC-A df100". Diluire 10 l di QC-A in 990 l metanolo.
   5. Etichettare una fiala come "Low QC stock". Aggiungere 1832 metonia a questa fiala. Aggiungere le quantità di mix QC dettagliate di seguito:
      QC-A df100: 80 L
      QC-B: 8 ll
      QC-C: 80 ll
       
   6. Etichettare una fiala come "Mid QC stock". Aggiungere 760 l metanolo a questa fiala. Aggiungere le quantità di mix QC dettagliate di seguito:
      QC-A df100: 800 L
      QC-B: 40 ll
      QC-C: 400 ll
       
   7. Etichettare una fiala come "High QC stock". Aggiungere 1376 l metanolo a questa fiala. Aggiungere le quantità di mix QC dettagliate di seguito:
      QC-D: 160 ll
      QC-E: 320 lL
      MFX, 1mg/mL di magazzino: 16 l
      InH, 1mg/mL stock: 32 l
      LFX, 1mg/mL di magazzino: 32 l
      Lo d.L, 1mg/mL di stock: 32 l
      10/mL di stock: 32 l
       
   8. Picco 10 -L basso qC stock nel tubo di perlina QBasso.
   9. Spike 10L Mid QC stock nel tubo di perlina QC medio.
   10. Picco 10 - Massimo QC nel tubo di perlina High QC.
10. Mettere tutti i tubi in agitatore a caldo per 2 h a 37 . Agitare dovrebbe essere abbastanza lento che l'acqua non spruzzi sui tubi.
11. Rimuovere i tubi dallo shaker. Trasferire il liquido dai tubi di perline in nuovi tubi di microcentrifuga. Etichettare questi tubi di microcentrifuga nello stesso modo.
12. Aggiungere 500 .l di metanolo ai vecchi tubi. Cap e vortice.
13. Per la seconda volta, trasferire il liquido dai tubi di perline nel tubo di microcentrifuga corrispondente. Va bene trasferire i capelli polverizzati. Questo alla fine sarà centrifugato.
14. Centrifugare i tubi di microcentrifuga per 10 min a 2.800 x g.
15. Rimuovere con cura il liquido e trasferirlo in nuovi tubi di centrifuga con etichette corrispondenti. Fare attenzione a non disturbare o trasferire il pellet di capelli.
16. Far evaporare il liquido nei tubi di centrifuga fino alla secchezza a 32 gradi centigradi.
17. Ricostituire i campioni aggiungendo ai tubi asciutti 200 gradi di fase A mobile (acqua di qualità HPLC con 1% di acido formico). Vortice.
18. Trasferire il liquido su fiale d'ambra con inserti da 250.

3. Preparazione LC-MS/MS

1. Fai un litro di fase A mobile (acqua di grado HPLC con 1% di acido formico) aggiungendo un po 'd'acqua di grado HPLC a un flacone volumetrico da un litro. Quindi aggiungere 10 mL di >95% di acido formica a quel pallone, quindi riempire la linea con acqua di grado HPLC.
   1. Fai un litro di fase B mobile (acetonitrile con 0,1% di acido formico) aggiungendo un po 'di acetonitrile a un flacone volumetrico da un litro. Quindi aggiungere 1 mL di >95% di acido formica a quel pallone, e quindi riempire alla linea con acetonitrile.
2. Installare una colonna di 2 x 100 mm con una dimensione di particelle di 2,5 m e una dimensione di pori di 100 gradi con perline fenili polari cablate e collegate all'etere completamente in silice porosa nel vano colonna. Assicurarsi che nella colonna sia installata anche la cartuccia di protezione consigliata dal produttore.
3. Aprire il software di acquisizione dati e fare doppio clic su Configurazione hardware. Evidenziare LCMS e fare clic su Attiva profilo.
   1. Fare clic su Nuovo sottoprogettooppure, se esistono già altri sottoprogetti, fare clic su Copia sottoprogetto. Assegnare un nome al sottoprogetto.
   2. Fare clic su Nuovo documento. Fare doppio clic su Metodo di acquisizione. Fare clic su Specifica di massa all'interno della finestra Metodo di acquisizione.
   3. Modificare l'elenco a discesa Tipo di scansione in Gestione record di messaggistica (MRM). Assicurarsi che Polarity sia impostato su Positivo.
   4. Fare clic su Importa elenco e selezionare il file .csv MDR-TB Metodo transitions.csv incluso in Materiali supplementari.
   5. Scorrere verso il basso e impostare Durata a 16.751 min. Il tempo di ciclo appropriato e il numero di cicli verranno popolati automaticamente.
   6. Nella barra laterale sinistra, fai clic su Valvola Valco integrata. Assicurarsi che il nome della posizione per il passaggio 0 sia A. Nella colonna Tempo totale (min) digitare 0,4 nella prima riga e 13 nella seconda riga.
   7. Nella colonna Posizione impostare la riga uno su B e la riga due su A.
   8. Nella barra laterale sinistra, fai clic su Pompa binaria. Impostare la tabella di gradiente e portata in base alla tabella 4.
   9. Nella barra laterale sinistra, fai clic su Autosampler. Modificare il volume di iniezione a 10. Fare clic su Controllo temperatura abilitato e impostare 4 .
   10. Nella barra laterale sinistra, fai clic su Compartimenti colonne. Impostare le temperature destra e sinistra a 50 gradi centigradi.
   11. Metodo Close e save.
4. Creare un batch facendo clic su Nuovo documento e selezionando Batch di acquisizione. Digitare un nome di set e selezionare il metodo appena creato dalla barra a discesa.
   1. In un foglio di calcolo, creare un batch che segue questo ordine: curva di calibrazione, controlli di qualità, campioni di pazienti, curva di calibrazione, controlli di qualità, campioni di pazienti, curva di calibrazione, controlli di qualità. Aggiungere iniezioni di vuoto solvente all'inizio e alla fine della corsa, nonché prima e dopo la curva di calibrazione, i controlli di qualità e i campioni di pazienti. Mettere almeno otto iniezioni di vuoto solvente dopo le iniezioni della curva di calibrazione e fiala di controllo di alta qualità al fine di ridurre il riporto dell'analita.
      NOTA: potrebbe essere necessario aggiungere altre iniezioni vuote solventi a seconda dell'età della colonna.
   2. Nella colonna adiacente ai nomi di esempio, digitare la posizione di autosampler appropriata per la fiala corrispondente.
   3. Fare clic su Aggiungi set. Nella finestra popup, digitare il numero di campioni nel batch.
   4. Copiare e incollare i nomi di esempio e le posizioni delle fiale dal foglio di calcolo al batch appena creato.
   5. Vai alla scheda Invia. Submit
5. Sistema Equilibrate inserendo la linea di solvente A nella fase a mobile e la linea B solvente nella fase mobile B. Aprire la valvola di spurgo sulla pompa binaria.
   1. Impostare la composizione del solvente al 50% B a 4 mL/velocità di flusso min. Attivare la pompa binaria.
   2. Dopo 5 min, diminuire il flusso a 0,3 mL/min. Chiudere la valvola di spurgo. Verificare la presenza di eventuali perdite.
   3. Nel software, premere Equilibrate sulla barra degli strumenti superiore. Impostare l'ora su >5 min, premere OK.
   4. Dopo che lo strumento è equilibrato, i moduli in basso a destra della finestra appariranno verdi. Verificare che la pressione si sia stabilizzata, quindi avviare il batch facendo clic su Avvia esempio.

4. Analisi dei dati

1. Al termine del batch, aprire il software di quantificazione. Fare clic sull'icona della bacchetta per creare una nuova tabella Risultati.
   1. Fare clic su Sfoglia per passare alla cartella appropriata, quindi evidenziare il file di dati e fare clic sulla freccia rivolta verso destra per spostare i dati nell'area Selezionata. Fare clic su Avanti.
   2. Selezionare Crea nuovo metodo e fare clic su Nuovo. Immettere il nome del nuovo metodo di quantificazione e premere Salva e quindi Avanti.
   3. Selezionare la prima iniezione del punto di calibrazione centrale. Premere Avanti.
   4. Selezionare tutte le transizioni degli standard interni nella colonna IS.
   5. Per le transizioni del quantificatore per gli standard di riferimento, selezionare l'IS corrispondente nella colonna Nome IS. Fare clic su Avanti.
   6. Scorrere le transizioni per assicurarsi che il tempo di conservazione selezionato automaticamente sia accurato. Assicurarsi che l'arrotondamento gaussiano sia impostato su 1,5. Tutte le altre impostazioni predefinite possono rimanere invariate (ad esempio, Percentuale rumore 100%, Baseline Sub. Finestra 2.00 min, Picco Divisione 2 punti).
      NOTA: se lo si desidera, modificare i parametri di integrazione automatica a questo punto. Dal momento che questi parametri cambiano in base alla configurazione dello strumento, non abbiamo incluso il nostro qui.
   7. Fare clic su Fine per applicare il metodo di quantificazione al batch.
2. Fare clic in alto a sinistra Visualizza il pulsante di verifica del picco per visualizzare i cromatogrammi. Naviga tra le transizioni usando la barra laterale sinistra. Scorrere ogni iniezione di ogni transizione del quantificatore e integrare manualmente il picco corretto, se necessario.
   1. Per integrare manualmente un picco, fare clic sul pulsante Abilita modalità di integrazione manuale, ingrandire il cromatogramma facendo clic e trascinando lungo l'asse x o y, quindi tracciare una linea da una linea di base all'altra, definendo il picco. Figura 3 Mostra due cromatogrammi: uno che ha INH, e quindi è stato integrato manualmente, e un altro che non ha INH.
      NOTA: Tutte le iniezioni devono essere integrate utilizzando gli stessi parametri. La larghezza di picco può fornire una linea guida per aderire a questi parametri, ma a volte la larghezza di picco sarà diversa. Per quantificare un picco, il tempo di conservazione deve essere compreso tra 0,15 min del tempo di conservazione previsto per tale analita (come definito dai picchi standard di riferimento), qualitativamente confermato come con il quantificatore previsto al rapporto di qualificatore (come illustrato nella Figura 2) e avere un rapporto segnale-rumore maggiore di 10.
3. Nella colonna Tipo di campione, impostare le iniezioni della curva di calibrazione (ad eccezione delle iniezioni di curva di calibrazione vuota) su Standard. Impostare le iniezioni di controllo qualità su Controllo qualità. Lasciare le iniezioni rimanenti come Sconosciuto.
   NOTA: questo verrà impostato su tutte le transizioni.
4. Nella colonna Concentrazione effettiva, digitare le concentrazioni trovate nella tabella 5 per tutte le iniezioni di curva di calibrazione e controllo qualità.
5. Fare clic sul secondo in alto a sinistra Visualizza il pulsante della curva di calibrazione. Fare clic sul pulsante Regressione.
6. Impostare Tipo ponderazione su 1/x e premere OK.
7. Convalidare la curva di calibrazione e i campioni di controllo qualità per assicurarsi che il batch sia stato eseguito correttamente.
   1. Per ogni transizione di riferimento del quantificatore (non le transizioni standard interne), osservare la precisione dell'iniezione di ogni curva di calibrazione (nella colonna Precisione). Almeno due terzi dei punti di calibrazione devono avere una precisione entro l'80-120%.
   2. Per i punti di calibrazione ben al di fuori della precisione prevista, l'iniezione può essere un outlier. Escludere gli outlier se la loro concentrazione calcolata è più di due deviazioni standard lontano dalle altre due iniezioni di quella fiala. Facendo clic sul pulsante "et picco a 'non trovato sopra ogni cromatogramma.
   3. Verificare che il valore R visualizzato sopra la curva di calibrazione sia >0.975.
   4. Controllare che tutte le iniezioni di controllo di qualità abbiano una precisione entro 80-120%.
8. Se tutte le condizioni di cui sopra sono soddisfatte, il batch è passato e i campioni possono essere quantificati. Fare clic su Modifica nella barra degli strumenti, quindi fare clic su Copia intera tabella. Incollare la tabella in un foglio di calcolo.
9. Prendere la media della concentrazione calcolata delle due iniezioni di campione per determinare la concentrazione riportata di ogni campione.

Risultati

Un'illustrazione di un cromatogramma con livelli confermati di tutti gli 11 farmaci DR-TB è mostrata figura 1. Il tempo di conservazione per ogni analita può cambiare quando si utilizzano diversi strumenti e colonne, quindi il tempo di conservazione esatto deve essere determinato individualmente.

I chromatogrammi ioni di estrazione (EIC) per un particolare farmaco (isoniazid, INH) in uno dei calibratori (campione di capelli vuoti con picchi di DR-TB) sono mostra...

Discussione

Riportiamo qui il protocollo per il metodo che abbiamo sviluppato e convalidato per quantificare 11 farmaci anti-TB utilizzati nel trattamento della DR-TB in piccoli campioni di capelli utilizzando LC-MS/MS. Nessun altro metodo per quantificare questi 11 farmaci nei capelli è stato precedentemente sviluppato, convalidato e pubblicato. Il nostro metodo può quantificare i livelli di sotto-nanogramma dei farmaci in soli 20-30 ciocche di capelli di circa 3 centimetri (cm) di lunghezza (2 mg) ed è già stato convalidato

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL injection vials	Agilent Technologies	5182-0716
250 uL injection vial inserts	Agilent Technologies	5181-8872
Bead ruptor 24	OMNI International	19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)	OMNI International	19628
Bedaquiline	Toronto Research Chemicals	B119550
Bedaquiline-d6	Toronto Research Chemicals	B119552
Clofazimine	Toronto Research Chemicals	C324300
Clofazimine-d7	Toronto Research Chemicals	C324302
Disposable lime glass culture tubes	VWR	60825-425
Ethambutol	Toronto Research Chemicals	E889800
Ethambutol-d4	Toronto Research Chemicals	E889802
Ethionamide	Toronto Research Chemicals	E890420
Ethionamide-d5	ClearSynth	CS-O-06597
Formic acid	Sigma-Aldrich	F0507-100mL
Glass bottles	Corning	1395-1L
Hot Shaker	Bellco Glass Inc	7746-32110
HPLC	Agilent Technologies	Infinity 1260
HPLC grade acetonitrile	Honeywell	015-4
HPLC grade methanol	Honeywell	230-1L
HPLC grade water	Aqua Solutions Inc	W1089-4L
Isoniazid	Toronto Research Chemicals	I821450
Isoniazid-d4	Toronto Research Chemicals	I821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm	Phenomenex	00D-4371-B0
LC guard cartridge	Phenomenex	AJ0-8788
LC guard cartridge holder	Phenomenex	AJ0-9000
LC-MS/MS quantitation software	Sciex	Multiquant 2.1
Levofloxacin	Sigma-Aldrich	1362103-200MG
Levofloxacin-d8	Toronto Research Chemicals	L360002
Linezolid	Toronto Research Chemicals	L466500
Linezolid-d3	Toronto Research Chemicals	L466502
Micro centrifuge tubes	E&K Scientific	695554
Moxifloxacin	Toronto Research Chemicals	M745000
Moxifloxacin-13C, d3	Toronto Research Chemicals	M745003
MS/MS	Sciex	Triple Quad 5500
OPC 14714	Toronto Research Chemicals	O667600
Pretomanid (PA-824)	Toronto Research Chemicals	P122500
Prothionamide	Toronto Research Chemicals	P839100
Prothionamide-d5	Toronto Research Chemicals	P839102
Pyrazinamide	Toronto Research Chemicals	P840600
Pyrazinamide-15N, d3	Toronto Research Chemicals	P840602
Septum caps for injection vials	Agilent Technologies	5185-5862
Turbovap LV evaporator	Biotage	103198/11