Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטות נוכחיות של ניתוח הדבקות של המטופלים בטיפול תרופתי מורכב-שחפת (DR-TB) משטרי יכול להיות לא מדויק ואינטנסיבי משאבים. השיטה שלנו מנתחת שיער, מטריצה בקלות שנאסף ומאוחסן, עבור ריכוזי של 11 תרופות DR-TB. באמצעות LC-MS/MS, אנחנו יכולים לקבוע את רמות התרופות תת-ננוגרמה שניתן לנצל כדי להבין טוב יותר את הדבקות בסמים.

Abstract

עמיד בפני סמים-שחפת (DR-TB) הוא איום בריאות הציבור הולך וגדל, והערכה של רמות תרופות טיפוליות אולי הטבות קליניות חשוב. רמות התרופה פלזמה הם הערכה התקן הזהב הנוכחי, אבל דורשים כריתת-פלבוטומיה ושרשרת קרה, וללכוד רק לאחרונה הדבקות. השיטה שלנו משתמשת שיער, מטריצה כי הוא נאסף בקלות רפלקטיבית של הדבקות לטווח ארוך, כדי לבדוק 11 נגד שחפת תרופות. העבודה הקודמת של הקבוצה שלנו מראה כי רמות התרופה תרופתי בשיער קשורים לתוצאות HIV. השיטה שלנו לתרופות DR-TB משתמשת 2 מ"ג של שיער (3 ס מ האבותיים לשורש), אשר מרוסק ומופק ב מתנול. דגימות מנותח עם שיטת LC-MS/MS יחידה, כימות 11 תרופות ב 16 דקות לרוץ. המגבלות הנמוכות יותר של כימות (יוסה) עבור 11 התרופות נעות בין 0.01 ng/mg ל-1 ng/mg. נוכחות התרופה מאושרת על ידי השוואת היחס בין שני מעברים בעלי ספקטרומטר מסה. דגימות הן כימות באמצעות יחס האזור של התרופה הדאובטים, 15N-, או 13C התווית איזוטופולוג התרופה. השתמשנו עקומת כיול החל מ-0.001-100 ng/mg. יישום השיטה למדגם נוחות של דגימות שיער שנאספו מחולים DR-TB על טיפול ישירות נצפתה (DOT) המצוין רמות הסמים בשיער בתוך טווח דינמי ליניארי של תשעה התרופות 11 (isoniazid,, מlevofloxacin, מmoxifloxacin, קלופצין. בדקווינין, פרטואיד (מחלקה) החולה לא היה על prothionamide, ואת רמות נמדד עבור ethionamide היו קרובים ל-יוסה שלה (עם עבודה נוספת במקום לבחון את ההתאמה של המטאווליט של ethionamide לניטור החשיפה). לסיכום, אנו מתארים את ההתפתחות של פאנל רב תכליתי עבור תרופות DR-TB בשיער כטכניקה עבור ניטור התרופה הטיפולית במהלך טיפול עמיד בפני תרופות נגד שחפת.

Introduction

במאה העשרים ואחת, עמיד בפני תרופות tb (ד ר-TB) הוא אסון מתפתח עבור תוכניות שליטה הלאומי חלש כבר שחפת, עם המקרים אישר הכפלת בעבר 5 שנים בלבד, חשבונאות כמעט שליש ממקרי המוות הקשורים להתנגדות מיקרוביאלית גלובלית1,2. הטיפול המוצלח של DR-TB נדרש בדרך הנדרשת יותר ויותר רעיל קו השני משטרי מאשר טיפול עבור התרופה רגיש TB. יתר על כן, חולים עם DR-TB לעתים קרובות יש אתגרים משמעותיים מראש קיימים לדבקות, אשר תרמו הופעתה של התנגדות בתחילה3.

בניגוד לזיהום HIV שבו נטען ויראלי ניתן להשתמש כדי לפקח על הטיפול, נקודות קצה פונדקאית של תגובת הטיפול בשחפת מתעכב ולא אמין על רמה הפרט4. מעקב הקפדה על המטופל, מנבא חשוב של ריכוז תרופות נגד שחפת וכישלון הטיפול, הוא גם מאתגר. הדבקות מדווחת בעצמו סובלת מאחזור הטיה והרצון לספק את הספקים5,6. ספירות הגלולה ותרופות מערכות ניטור אירועים (mems) יכול להיות אובייקטיבי יותר7 אך לא למדוד את צריכת התרופה בפועל8,9,10. רמות התרופות ב-ביואטריסס יכולות לספק גם נתונים הניתנים לדבקות ולשני הפרמקוקינטיים. לכן, רמות התרופות פלזמה משמשות בדרך כלל בניטור תרופות טיפולית11,12. עם זאת, בהקשר של ניטור הדבקות בסמים, רמות הפלזמה מייצגות חשיפה לטווח קצר ומוגבלות על-ידי שינויים משמעותיים בפנים ובבין המטופלים בעת קביעת טווח התייחסות מתאים לדבקות. אפקטים של "מעיל לבן", כאשר הדבקות משתפרת לפני ביקורי מרפאה או לימודים, מסבך עוד יותר את יכולתם של רמות פלזמה לספק דפוסי הדבקות בסמים מדויקים13.

שיער הוא ביומטריקס אלטרנטיבי שיכול למדוד לטווח ארוך14חשיפהלסמים 14,15. תרופות רבות חילוף החומרים האנדוגניים לשלב לתוך מטריצת חלבון השיער מן המחזור מערכתית כמו שיער צומח. כאשר תהליך דינמי זה נמשך במהלך צמיחת השיער, כמות התרופה שהופקדו במטריקס שיער תלוי בנוכחות רציפה של התרופה במחזור, הפיכת שיער בדיקה טמפורלית מעולה של צריכת התרופה. שיער כמו ביומטריקס יתרון נוסף של להיות נאסף בקלות ללא צורך שרשרת קר לאחסון ומשלוח בהשוואה לדם. כמו-כן, השיער אינו ביולוגי, המספק יתרונות נוספים של היתכנות בתחום.

רמות הסמים בשיער שימשו זמן רב ביישומים משפטיים16. במהלך העשור האחרון, השיער תרופתי (arv) רמות הפגינו השירות בהערכת דבקות התרופה ב-HIV טיפול ומניעה, אשר הקבוצה שלנו תרמו. רמות arv בשיער הוכחו להיות החזק ביותר הפרמנטורים עצמאיים של תוצאות הטיפול בנגיף HIV17,18,19,20,21. כדי לקבוע אם רמות השיער של חולים DR-TB יהיה שירות זהה בניבוי תוצאת הטיפול, השתמשנו LC-MS/MS כדי לפתח ולאמת שיטה לניתוח 11 התרופות DR-TB בדגימות שיער קטן. כהערכה ראשונית של ביצועי הטיפול, אנו מודדים DR-TB רמות התרופות במדגם הנוחות של חולים עם DR-TB מקבל טיפול ישיר (DOT) בקייפ המערבי, דרום אפריקה22.

Protocol

כל המטופלים סיפקו הסכמה מושכלת בכתב לפני איסוף דגימת שיער. הצלחנו לקבל אישור מוסדי מועצת המנהלים מאוניברסיטת קייפטאון ואוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.

1. דגימת שיער

  1. קבל הסכמה מושכלת בכתב.
  2. השימוש מספריים נקיים לחתוך כ 20-30 קווצות שיער הקרקפת מהאזור העורף קרוב לקרקפת ככל האפשר.
  3. הציבו את הקלטת סביב הצד המרוחק. של השיער כדי להצביע על כיווניות מקפלים דגימת שיער לתוך כיכר רדיד אלומיניום ולאחסן בטמפרטורת החדר. סמן את הקצה המרוחק של השיער כדי למנוע זיהום אפשרי מטיפול נוסף של הקצה האבובי.
  4. בנוסף דגימות החולה, לאסוף "שיער ריק": דגימת שיער הקרקפת ממישהו שלא לקח תרופות נגד שחפת. לאסוף כמות גדולה (> 30 mg שיער ריק עבור כל 20 המטופל דגימות).

2. חילוץ הסמים

  1. תווית מנורות חרוז. כל דגימת מטופל. דורשת צינורית אחת תווית 12 צינורות מ-"C0" ל-"C11", אחת עבור כל אחת מ -12 נקודות כיול. סמן שפופרת לבקרת איכות נמוכה, צינור לבקרת איכות בינונית ושפופרת לבקרת איכות גבוהה. לבסוף, סמן צינור עבור מטריצה ריק.
  2. פתחו את כיכר רדיד האלומיניום המכילה דגימת שיער. אם דגימת שיער ארוכה מ-3 ס מ, שיער חתוך בגובה 3 ס מ מהקצה האבובי והשתמש בחלק האבובי לניתוח.
  3. שוקלים 2 מ ג של דגימת השיער לתוך שפופרת חרוז.
  4. שוקלים 2 מ"ג של שיער ריק לתוך 16 שפופרות חרוז נוספות. אלה ישמשו כנקודות כיול, פקדי איכות ומטריצה ריקה. הצינורות יעברו את ההליך החילוץ אותו כמו דגימות המטופל, מלבד להיות מחודדים עם סטנדרטים התייחסות סמים ברמות המצוין בשלבים 2.8 ו 2.9.
  5. מניחים את כל שפופרות החרוזים לתוך ההומוגניצר. הפעל הומוגניצר במהירות 6.95 מ מ. הפעלה עבור שני מחזורים של 30 כל אחד, עם תקופה של 15 מנוחה בין שני מחזורי.
  6. הפוך תמהיל תקני פנימי והוסף אותו לדגימות.
    1. הוסף ~ 40 mL של מתנול בקבוקון מנפח 50 mL.
    2. בבקבוקונים זכוכית ענבר, להפוך את mixes של הסטנדרטים הפנימיים המוצגים בטבלה 1, באמצעות מתנול כמו הממס.
      הערה: מתנול הוא נדיף מאוד. להשאיר את כל הבקבוקונים הכתיר במהלך תהליך זה כדי למנוע אובדן עקב אידוי.
    3. מאותם תערובות, להוסיף את עוצמת הקול המוצג בטבלה 1 כדי 50 mL נפח בקבוקון. ואז, למלא את הבקבוקון כדי 50 mL עם מתנול.
    4. קאפ ומערבבים את הבקבוקון הנפחי. הוסף 500 μL של התערובת לכל הצינורות שיער מרוסק, למעט צינור ריק מטריצה. הוסף 500 μL מתנול אל השפופרת הריקה של המטריצה.
  7. הפוך תערובות סטנדרטיות לייחוס.
    1. מהווים סטנדרטים התייחסות מסודר של התרופות הבאות עם מתנול כדי לקבל את הריכוז המוצג בטבלה בשלב 2.7.2. יש צורך רק ב-1 mL של הריכוזים הבאים.
    2. הוסף 1768 μL של מתנול לבקבוקון, ולאחר מכן הוסף את כמויות תקן הייחוס המפורטות בטבלה 2 לאותו בקבוקון כדי לקבל את הנפח הסופי בשני mL. סמן בבקבוקון זה "Ref מיקס לתקן 1x". ערבולת.
    3. ספייק 100 μL מ "Ref מיקס לתקן 1x" לתוך 900 μL מתנול בבקבוקון חדש. סמן במבחנה זו "Ref מיקס לערבב 10x". ערבולת.
    4. ספייק 100 μL מ-"Ref מיקס למיקס 10x" לתוך 900 μL מתנול בבקבוקון חדש. סמן במבחנה זו "Ref שילוב מיקס 100 x". ערבולת.
    5. ספייק 100 μL מ-"Ref מיקס למיקס 100x" לתוך 900 μL מתנול בבקבוקון חדש. סמן במבחנה זו "Ref מיקס לערבב 1000x". ערבולת.
  8. ספייק צינורות עקומת הכיול על ידי הוספת כמות Ref מיקס שתוארו בטבלה 3.
  9. צור מתערובות QC ושפופרות בקרת איכות ספייק.
    1. תווית 5 במבחנות "קוו-א" דרך קוו-אי
    2. הוסף את הכמויות הבאות של מתנול לתוך חמשת הבקבוקונים שסומנו:
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      קוו-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. באמצעות 1 mg/mL מניות סמים שנוצרו בשלב 2.7.1, להוסיף 10 μL לבקבוקונים הספציפיים המפורטים להלן. עבור מניות BDQ ו CLF, אשר נמצאים ב 0.5 mg/mL, להוסיף 20 μL לבקבוקונים המפורטים להלן.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      קוו-E: CLF, BDQ, PTM

      הערה: חלק מהסמים נמצאים בתערובות מרובות.
    4. סמן בקבוקון בתור "QC-A df100". לדלל 10 μL של QC-A לתוך 990 μL מתנול.
    5. סמן בקבוקון בתור "מניות QC נמוכות". הוסף 1832 μL מתנול לבקבוקון זה. הוסף את הכמויות של מתערבב QC מפורט להלן:
      QC-A df100:80 μL
      QC-B: 8 μL
      קוו-C: 80 μL
       
    6. סמן בקבוקון כ-"מלאי QC בינוני". הוסף 760 μL מתנול לבקבוקון זה. הוסף את הכמויות של מתערבב QC מפורט להלן:
      QC-A df100:800 μL
      QC-B: 40 μL
      קוו-C: 400 μL
       
    7. סמן בקבוקון כ-"מלאי QC גבוה". הוסף 1376 μL מתנול לבקבוקון זה. הוסף את הכמויות של מתערבב QC מפורט להלן:
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/mL מלאי: 16 μL
      INH, 1mg/mL מלאי: 32 μL
      LFX, 1mg/mL מלאי: 32 μL
      LZD, 1mg/mL מלאי: 32 μL
      PZA, 1mg/mL מלאי: 32 μL
       
    8. ספייק 10 μL מלאי QC נמוכה לתוך צינור ה-QC באיכות נמוכה.
    9. ספייק 10 μL באמצע מניות QC לתוך צינור ה-QC באמצע.
    10. ספייק 10 μL גבוהה במלאי QC לתוך שפופרת ה-QC גבוהה.
  10. מניחים את כל הצינורות בשייקר חם עבור 2 h ב 37 ° c. לרעוד צריך להיות איטי מספיק כי המים לא להתיז על הצינורות.
  11. להסיר צינורות מ שייקר. העברת נוזל מצינורות חרוז לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים. תייג את הצינורות. המיקרוצנטריפוגה האלה באותו אופן
  12. הוסף 500 μL מתנול לצינורות הישנים. . כובע ומערבולת
  13. בפעם השנייה, להעביר נוזל מצינורות חרוז לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה המקביל. . זה בסדר להעביר שיער מרוסק זה יהיה בסופו של דבר centrifuged החוצה.
  14. צנטריפוגה את צינורות המיקרוצנטריפוגה עבור 10 דקות ב 2,800 x g.
  15. בזהירות להסיר את הנוזל ולהעביר אותו צינורות צנטריפוגה חדשים עם תוויות המקביל. להיזהר לא להפריע או להעביר את השיער שיער.
  16. מתנדפים את הנוזל בצינורות הצנטריפוגה ליובש ב 32 ° c.
  17. מרכיבים את הדגימות על-ידי הוספת 200 μL של השלב הנייד A (בדיקות-כיתה-מים עם חומצה פורמית 1%) לצינורות היבשים. ערבולת.
  18. העבר את הנוזל לבקבוקונים עם הענבר עם מוסיף 250 μL.

3. הכנה LC-MS/MS

  1. הפוך ליטר אחד של השלב הנייד A (מיים בכיתות עם חומצה פורמית של 1%) על ידי הוספת מספר כלים לבקבוקון נפחי של ליטר אחד. ואז להוסיף 10 מ ל של > 95% החומצה פורמית לבקבוקון זה, ולאחר מכן למלא את הקו עם המים באמצעות כיתות.
    1. לעשות ליטר אחד של שלב נייד B (acetonitrile עם 0.1% פורמית חומצה) על ידי הוספת כמה acetonitrile ל בקבוקון נפחי ליטר אחד. ואז להוסיף 1 mL של > 95% החומצה פורמית לבקבוקון הזה, ולאחר מכן למלא את הקו עם acetonitrile.
  2. התקנת עמודת 2 x 100 מ"מ עם גודל החלקיקים 2.5 יקרומטר ו 100 בגודל הנקבוביות Å עם endcapped קוטב, האתר מקושר חרוזים מקושרים במלואו של סיליקה נקבובי בתא הטור. ודא שלעמודה יש גם מחסנית שמירה מומלצת ליצרן.
  3. פתח את תוכנת רכישת הנתונים ולחץ פעמיים על תצורת חומרה. סמן Lcms ולחץ על הפעל פרופיל.
    1. לחץ על תת פרוייקט חדש, או אם כבר קיימים פרוייקטים משניים אחרים, לחץ על העתק פרוייקט משנה. . נקוב בשמו של פרוייקט המשנה
    2. לחץ על מסמך חדש. לחץ פעמיים על שיטת הרכישה. לחץ על Spec מסה בתוך חלון שיטת הרכישה.
    3. שנה את הרשימה הנפתחת ' סוג סריקה ' ל- mrm (mrm). ודא שהקוטביות מוגדרת כחיובית.
    4. לחץ על ייבוא רשימה ובחר בקובץ. Csv MDR-TB lcms שיטה מעברים. csv הנכלל בחומרים משלימים.
    5. גלול מטה והגדר את המשך ל 16.751 דקות. זמן המחזור המתאים ומספר המחזורים יאכלס אוטומטית.
    6. בסרגל הצידי השמאלי, לחץ על שסתום Valco משולב. ודא ששם המיקום עבור שלב 0 הוא A. בעמודה סה כ זמן (דקות) , הקלד ב-0.4 בשורה הראשונה ו-13 בשורה השניה.
    7. בעמודה מיקום , הגדר שורה אחת ל-B ושורה שתיים ל-A.
    8. בסרגל הצידי השמאלי, לחץ על משאבה בינארית. הגדר את טבלת קצב המעבר והזרימה לפי טבלה 4.
    9. בסרגל הצידי השמאלי, לחץ על דוגם אוטומטי. שנה את נפח ההזרקה ל-10 μL. לחץ על בקרת טמפרטורה זמינה והגדר ל-4 ° c.
    10. בסרגל הצידי השמאלי, לחץ על תא עמודה. הגדר את הטמפרטורה הימנית והשמאלית ל-50 ° c.
    11. שיטת סגירה ושמירה.
  4. צור אצווה על-ידי לחיצה על מסמך חדש ובחירת אצוות רכישה. הקלידו שם ערכה ובחרו בשיטה החדשה שנוצרה מסרגל הנפתח.
    1. בגיליון אלקטרוני, צור אצווה העוקבת אחר סדר זה: עקומת כיול, בקרת איכות, דגימות מטופלים, עקומת כיול, בקרת איכות, דגימות מטופלים, עקומת כיול, בקרת איכות. הוסף זריקות ריקות ממס בתחילתו ובסופו של ההפעלה, כמו גם לפני ואחרי עקומת הכיול, בקרת איכות ודגימות המטופל. שים לפחות שמונה זריקות ריקות ממס לאחר זריקות של עקומת כיול בקבוקון בקרת איכות גבוהה על מנת להפחית את הנושא של האנליטה.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להוסיף זריקות ריקות נוספות בהתאם לגיל העמודה.
    2. בעמודה הסמוכה לשמות המדגם, הקלד את מיקום הדוגם האוטומטי המתאים לבקבוקון המתאים.
    3. לחץ על הוסף ערכה. בחלון המוקפץ, הקלד את מספר הדגימות באצווה.
    4. העתק והדבק שמות לדוגמה ומיקומי בקבוקון מהגיליון האלקטרוני אל האצווה החדשה שנוצרה.
    5. עבור אל הכרטיסיה שליחה . לחץ על לחצן שלח .
  5. מערכת השפה על ידי הוספת קו הממס A לשלב הנייד A ו קו ממס B לשלב הנייד B. פתח את שסתום הטיהור על המשאבה הבינארית.
    1. הגדר הרכב הממס ל 50% B בקצב זרימה של 4 מ"ל/דקות. הפעל משאבה בינארית.
    2. לאחר 5 דקות, הפחת את הזרימה ל-0.3 mL/min. סגור את שסתום הטיהור. . תבדקו אם יש דליפות
    3. בתוכנה, לחץ על השפה העליונה בסרגל הכלים העליון. הגדר זמן ל> 5 דקות, לחץ על אישור.
    4. לאחר שכלי הנגינה הוצג בשפה התחתונה, המודולים בחלק הימני התחתון של החלון יופיעו ירוקים. בדוק כי הלחץ התייצב, ולאחר מכן להתחיל את האצווה על ידי לחיצה על התחל דגימה.

4. ניתוח נתונים

  1. לאחר השלמת האצווה, פתח את תוכנת הקוונטה. לחץ על סמל השרביט כדי ליצור טבלת תוצאות חדשה.
    1. לחץ על עיון כדי לנווט אל התיקיה המתאימה ולאחר מכן סמן את קובץ הנתונים ולחץ על החץ המצביע ימינה כדי להעביר את הנתונים לאזור שנבחר . לחץ על הבא.
    2. בחרו ' צור שיטה חדשה ' ולחצו על ' חדש'. כניסת שם שיטת כימות חדשה והקש שמור ואז הלאה.
    3. בחרו בזריקה הראשונה של נקודת הכיול האמצעית. לחץ על הבא.
    4. סמן שנתות את כל המעברים של התקנים הפנימיים בעמודה IS .
    5. עבור מעברים בין כימות עבור תקני הייחוס, בחר את האפשרות המתאימה היא בעמודה שם . לחץ על הבא.
    6. גלול במעברים כדי לוודא שזמן ההחזקה שנבחר באופן אוטומטי מדויק. ודא שהחלקת גאוס מוגדרת ל-1.5. כל הגדרות ברירת המחדל אחרים יכולים להישאר כפי שהוא (כלומר, רעש אחוז 100%, משנה בסיסית. חלון 2.00 min, השיא פיצול 2 נקודות).
      הערה: אם רצונך בכך, שנה את פרמטרי האינטגרציה האוטומטית בשלב זה. מאחר שפרמטרים אלה משתנים בהתאם לכיוונון הכלי, לא כללנו את שלנו כאן.
    7. לחץ על סיום כדי להחיל את שיטת הקוונטה על האצווה.
  2. לחץ על השמאלית העליונה מציג את לחצן סקירת שיא כדי להציג chromatograms. נווט בין המעברים באמצעות הסרגל הצידי השמאלי. גלול בכל הזרקה של כל מעבר כימות ולשלב באופן ידני את השיא הנכון במידת הצורך.
    1. כדי לשלב באופן ידני את השיא, לחץ על לחצן הפוך מצב שילוב ידני , התקרבות אל כרומטוגרם על-ידי לחיצה וגרירה לאורך ציר x או y, ולאחר מכן צייר קו מקו בסיס אחד אל קו הבסיס האחר, הגדרת השיא. איור 3 מראה שני כרומאטוגרמות: אחד כי יש inh, ולכן יש כבר משולב באופן ידני, ואחר כי אין inh.
      הערה: יש לשלב את כל הזריקות באמצעות אותם פרמטרים. רוחב השיא יכול לספק מנחה לדבוק בפרמטרים אלה, אך לפעמים רוחב השיא יהיה שונה. כדי לכמת את השיא, זמן ההחזקה חייב להיות בתוך ± 0.15 דקות של זמן ההחזקה הצפוי עבור האנליטה (כפי שהוגדר על-ידי הפסגות הסטנדרטיות של ההפניה), שאושרו בצורה איכותית כשיש לו את הקוונט הצפוי ליחס מזהה (כפי שמוצג באיור 2), והיחס בין האות לרעש של
  3. בעמודה סוג לדוגמה , הגדר את זריקות עקומת הכיול (למעט זריקות עקומת הכיול הריקות) לתקן. הגדר את זריקות בקרת האיכות לבקרת איכות. השאר את הזריקות הנותרות כבלתי ידועות.
    הערה: הדבר יהיה מוגדר בכל המעברים.
  4. בעמודה ריכוז בפועל , הקלד את הריכוזים שנמצאו בטבלה 5 עבור כל עקומת כיול וזריקות בקרת איכות.
  5. לחץ על השני משמאל למעלה מציג את לחצן עקומת הכיול . לחץ על לחצן הרגרסיה .
  6. הגדר סוג שקלול ל- 1/x והקש על אישור.
  7. אמת את עקומת הכיול ודגימות בקרת האיכות כדי להבטיח שהאצווה בוצעה בהצלחה.
    1. עבור כל מעבר הפניה לכמת (לא מעברים סטנדרטיים פנימיים), הבט בכל דיוק של הזרקה של עקומת כיול (בעמודת הדיוק ). לפחות שני שלישים מנקודות הכיול חייבים להיות בעלי דיוק בתוך 80-120%.
    2. עבור נקודות כיול הרחק מחוץ לדיוק הצפוי, ההזרקה עשויה להיות מדויקת יותר. הוצא החוצה אם הריכוז המחושב שלהם הוא יותר משתי סטיות סטנדרטיות הרחק משתי הזריקות האחרות של הבקבוקון. לחיצה על "et שיא כדי" לא נמצא לחצן מעל כל chromatogram.
    3. בדוק כי ערך ה-R המוצג מעל עקומת הכיול הוא > 0.975.
    4. בדוק כי כל זריקות בקרת איכות יש דיוק בתוך 80-120%.
  8. אם כל התנאים לעיל מסופקים, האצווה עברה, וניתן לכמת דגימות. לחץ על עריכה בסרגל הכלים ולאחר מכן לחץ על העתק טבלה שלמה. הדבקת הטבלה בגיליון אלקטרוני.
  9. קח את הממוצע של הריכוז המחושב של שתי זריקות לדוגמה כדי לקבוע את הריכוז המדווח של כל מדגם.

תוצאות

איור של כרומוטוגרמה עם רמות מאושרות של כל 11 התרופות DR-TB מוצג באיור 1. זמן השמירה עבור כל אנליטה יכול להשתנות בעת שימוש בכלים ובעמודות שונים, כך שזמן השמירה המדויק ייקבע בנפרד.

מחולץ יון כרומטוגרמות (EICs) עבור תרופה אחת מסוימת (isoniazid, INH) באחד הכפויי (דגימת שיער רי?...

Discussion

אנו מדווחים כאן פרוטוקול עבור השיטה שפיתחנו ואומת עבור כימות 11 נגד שחפת תרופות מנוצל בטיפול של DR-TB דגימות שיער קטנות באמצעות LC-MS/MS. אין שיטה אחרת עבור כימות אלה 11 תרופות בשיער פותחה בעבר, מאומת ופורסם. השיטה שלנו יכולה לכמת תת-ננו רמות של תרופות רק 20-30 קווצות שיער של כ 3 סנטימטרים (cm) אורך (~ 2 מ"?...

Disclosures

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות RO1 AI123024 (Co-פיס: ג'ון מטסואפה ומוניקה גנדי).

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לפרופסור Keertan Dheda, ד ר עלי Esmail, ו מאריטג'יאה פרטוריוס באוניברסיטת קייפ טאון המכון לריאות שהקל על אוסף דגימות שיער למחקר. המחברים מכירים בהכרת העבודה את התרומות של המשתתפים במחקר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL injection vialsAgilent Technologies5182-0716
250 uL injection vial insertsAgilent Technologies5181-8872
Bead ruptor 24OMNI International19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)OMNI International19628
BedaquilineToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquiline-d6Toronto Research ChemicalsB119552
ClofazimineToronto Research ChemicalsC324300
Clofazimine-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Disposable lime glass culture tubesVWR60825-425
EthambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EthionamideToronto Research ChemicalsE890420
Ethionamide-d5ClearSynthCS-O-06597
Formic acidSigma-AldrichF0507-100mL
Glass bottlesCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
HPLC grade acetonitrileHoneywell015-4
HPLC grade methanolHoneywell230-1L
HPLC grade waterAqua Solutions IncW1089-4L
IsoniazidToronto Research ChemicalsI821450
Isoniazid-d4Toronto Research ChemicalsI821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
LC guard cartridgePhenomenexAJ0-8788
LC guard cartridge holderPhenomenexAJ0-9000
LC-MS/MS quantitation softwareSciexMultiquant 2.1
LevofloxacinSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacin-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Micro centrifuge tubesE&K Scientific695554
MoxifloxacinToronto Research ChemicalsM745000
Moxifloxacin-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanid (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProthionamideToronto Research ChemicalsP839100
Prothionamide-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PyrazinamideToronto Research ChemicalsP840600
Pyrazinamide-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Septum caps for injection vialsAgilent Technologies5185-5862
Turbovap LV evaporatorBiotage103198/11

References

  1. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  2. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
  3. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
  4. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
  5. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
  6. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
  7. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
  8. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  9. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
  10. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
  11. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
  12. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
  13. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
  14. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
  15. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
  16. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
  17. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
  18. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
  19. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  20. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
  21. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
  22. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159LC MS MSMDR TBTB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved