Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

النقل المحوري هو آلية حاسمة لصحة الخلايا العصبية الحركية. في هذا البروتوكول نقدم طريقة مفصلة لتتبع النقل المحوري للمقصورات الحمضية والميتوكوندريا في محاور عصبية المحرك باستخدام غرف microfluidic.

Abstract

الخلايا العصبية الحركية (MNs) هي خلايا مستقطبة للغاية مع محاور طويلة جدا. النقل المحوري هو آلية حاسمة لصحة MN، مما يساهم في نمو الخلايا العصبية، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة. نحن نصف طريقة مفصلة لاستخدام غرف microfluidic (MFCs) لتتبع النقل المحوري للالعضيات المسماة الفلورسنت في محاور MN. هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا، ويسمح لرصد الإشارات داخل الخلايا في المكان والزمان. ونحن نصف بروتوكول خطوة بخطوة لما يلي: 1) تصنيع شركات التمويل الأصغر المتعددة الأبعاد؛ (1) تصنيع المواد متعددة الأبعاد؛ 1 2) طلاء النباتات الخارجية الحبل الشوكي البطني وMN الثقافة المنفصلة في MFCs؛ 3) وضع العلامات من الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية تليها حية confocal تخيل; 4) دليل وشبه الآلي تحليل النقل المحوري. وأخيرا، نحن نظهر فرقا في نقل الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية من HB9::GFP الحبل الشوكي البطني explant محاور عصبية كدليل على صحة النظام. وإجمالاً، يوفر هذا البروتوكول أداة فعالة لدراسة النقل المحوري لمختلف المكونات المحورية، فضلاً عن دليل مبسط لاستخدام MFC للمساعدة في اكتشاف الإمكانيات التجريبية المكانية.

Introduction

MNs هي خلايا مستقطبة للغاية مع محاور عصبية طويلة ، تصل إلى متر واحد طويل في البشر البالغين. وتخلق هذه الظاهرة تحدياً حاسماً للحفاظ على الاتصال بالشبكة ووظيفتها. وبالتالي، تعتمد MNs على النقل السليم للمعلومات والعضيات والمواد على طول المحاور من جسم الخلية إلى المشبك والظهر. يتم نقل المكونات الخلوية المختلفة ، مثل البروتينات والحمض النووي الريبي والعضيات بانتظام من خلال المحاور. الميتوكوندريا هي العضيات الهامة التي يتم نقلها بشكل روتيني في MNs. الميتوكوندريا ضرورية للنشاط السليم ووظيفة MNs ، المسؤولة عن توفير ATP ، تخزين الكالسيوم ، وعمليات الإشارة1،2. النقل المحوري للالميتوكوندريا هو عملية مدروسة جيدا3,4. ومن المثير للاهتمام، وأفادت عيوب في نقل الميتوكوندريا أن تشارك في العديد من الأمراض العصبية وعلى وجه التحديد في الأمراض MN5. المقصورات الحمضية بمثابة مثال آخر للالعضيات الجوهرية التي تتحرك على طول محاور MN. تشمل المقصورات الحمضية الليسوسوماس والإندوسوماس وجهاز ترانس غولجي وبعض الحويصلات الإفرازية6. تم العثور على عيوب في النقل المحورلل من المقصورات الحمضية في العديد من الأمراض العصبية وكذلك7، والأوراق الأخيرة تسليط الضوء على أهميتها في الأمراض MN8.

لدراسة كفاءة النقل المحوري، وتستخدم غرف microfluidic التي تفصل بين مقصورات جسدية ومحاورية بشكل متكرر9،10. الميزتين الهامتين للنظام microfluidic ، وتجزئة وعزل محاور عصبية ، تجعلها مثالية لدراسة العمليات دون الخلوية11. يمكن استخدام الفصل المكاني بين أجسام الخلايا العصبية والمحاور للتلاعب بالبيئات خارج الخلية لمقصورات الخلايا العصبية المختلفة (على سبيل المثال، محاور عصبية مقابل سوما). البيوكيميائية, نمو الخلايا العصبية / انحطاط, والصفات الفلور المناعي ة جميع الاستفادة من هذا المنبر. MFCs يمكن أن تساعد أيضا في دراسة الاتصالات بين الخلايا والخلايا عن طريق الخلايا العصبية coculturing مع أنواع الخلايا الأخرى, مثل عضلات الهيكل العظمي12,,13,,14.

هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط ولكن دقيقة لرصد الميتوكوندريا ونقل المقصورة الحمضية في الخلايا العصبية الحركية. كما نبين استخدام هذه الطريقة من خلال مقارنة النسبة المئوية النسبية للالعضيات المتحركة الرجعية والسابقة، وكذلك توزيع سرعة النقل.

Protocol

تم تنفيذ رعاية الحيوانات وعلاجها في هذا البروتوكول تحت إشراف وموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة تل أبيب.

1- إعداد MFC

  1. PDMS الصب في القوالب الأولية(الشكل 1)
    1. شراء أو إنشاء قوالب أولية (رقائق) بعد بروتوكول مفصل9.
    2. استخدام الهواء المضغوط لإزالة أي نوع من الأوساخ من منصة رقاقة قبل الشروع في خطوة الطلاء. يجب أن تبدو سطح الرقائق ناعمة وواضحة.
    3. ملء حاوية مع 50 مل من النيتروجين السائل. إعداد حقنة 10 مل و23 G إبرة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ كافة الإجراءات من هذه الخطوة إلى الأمام في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    4. في غطاء محرك السيارة الكيميائي، استخدم الحقنة والإبرة لتجميع 2 مل من النيتروجين السائل. على الرغم من أنه قد يبدو وكأنه تم رسم الهواء ، يتم تعبئة الحقنة بالنيتروجين(الشكل 1A). ضع اللوحة المحتوية على الرقاقة في حاوية قابلة للغلق.
    5. المسمار فتح زجاجة الكلوروتريميثيلسيلين، بيرس الغطاء المطاطي باستخدام حقنة مليئة النيتروجين، وحقن محتويات كامل من الحقنة في الزجاجة. دون سحب الإبرة، بدوره زجاجة رأسا على عقب ورسم الظهر 2 مل من الكلوروتريميثيلسيلين.
      ملاحظة: بسبب ضغط الحقنة، يتم رش كمية صغيرة من الكلوروتريميثيلسيلين من الإبرة. لتجنب خطر، نقطة الإبرة نحو الجدار الداخلي للغطاء محرك السيارة(الشكل 1B).
    6. نشر الكلوروتريميثيلسيلين بشكل موحد في الحاوية (من الخطوة 1.1.4)، ولكن ليس مباشرة على رقاقة أو رقاقة تحتوي على لوحة. أغلق الحاوية واحتضن لمدة 5 دقيقة لكل رقاقة.
      ملاحظة: إذا كانت هذه هي المرة الأولى المغلفة رقاقة مع الكلوروتريميثيلسيلين، ينبغي أن يسمح حضانة 1 ح لكل رقاقة.
    7. لا تأخذ الرقائق والحاوية من غطاء محرك السيارة الكيميائي لمدة 30 دقيقة.
      تنبيه: الكلوروتريميثيلسيلين شديد التقلب.
    8. وزن قاعدة PDMS (انظر جدول المواد)في أنبوب 50 مل وإضافة عامل علاج PDMS بنسبة 16:1 على التوالي (على سبيل المثال، 47.05 غرام من القاعدة و 2.95 غرام من عامل المعالجة). مزيج لمدة 10 دقيقة باستخدام دوار سرعة منخفضة.
    9. صب PDMS في كل لوحة تحتوي على رقاقة إلى الارتفاع المطلوب(الشكل 1C).
      ملاحظة: استخدام غرف دقيقة دقيقة رقيقة (تصل إلى 3-4 ملم) يحسن الالتزام بطبق الثقافة ويمنع التسرب.
    10. وضع جميع لوحات معا داخل مدي فراغ لمدة 2 ساعة(الشكل 1E). هذه العملية يزيل الهواء المحاصرين داخل PDMS، وبالتالي القضاء على فقاعات الهواء وتشكيل قالب واضح وموحد.
    11. ضع الألواح داخل الفرن لمدة 3 ساعات (أو بين عشية وضحاها) عند 70 درجة مئوية(الشكل 1E).
      ملاحظة: يجب أن تكون لوحات مستوى عند وضعها في الفرن.
  2. PDMS الصب في قوالب الايبوكسي
    ملاحظة: لأن إعداد رقاقة مكلفة، ويتطلب معدات خاصة، ويمكن أن تلحق الضرر رقائق هشة، فمن الممكن لتوليد النسخ المتماثلة الايبوكسي من رقائق. النسخ المتماثلة هي أرخص وأكثر دواما، ويمكن استخدامها لإنتاج كميات كبيرة من غرف microfluidic.
    1. المدلى بها وعلاج PDMS (كما هو موضح في 1.1.8-1.1.11) في رقاقة الأصلي.
    2. إزالة وقطع الأجزاء الزائدة من PDMS ترك فقط العناصر microfluidic والمجال الوظيفي اللازم لمعالجتها في غرف microfluidic.
    3. التفاف على الفور PDMS مع سميكة، شريط لزجة لمنعها من تراكم الغبار.
    4. اختيار الأنسجة الصف الصف طبق من البلاستيك الذي يناسب PDMS كامل داخل وترك مجالا للايبوكسي حوله. يجب أن تكون المسافة من PDMS إلى الطبق البلاستيكي أقل من 5 مم.
    5. إعداد كمية صغيرة من PDMS مختلطة في نسبة 10:1 (قاعدة: عامل المعالجة). سيتم استخدام PDMS السائل الطازج للصق PDMS الصلبة على الجزء السفلي من لوحة من البلاستيك.
    6. تطبيق الحد الأدنى من PDMS السائل إلى الجزء السفلي الأوسط من لوحة بلاستيكية ومن ثم إزالة الشريط لزجة من PDMS وتمسك به إلى أسفل الطبق البلاستيكي. تأكد من أن العناصر microfluidic تواجه صعودا.
    7. اسمحوا علاج PDMS لمدة 30 دقيقة في فرن 70 درجة مئوية.
    8. إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق خلط قاعدة وعامل علاج في نسبة 100:45 على التوالي في أنبوب اختبار. راتنجات الايبوكسي المختلفة قد يكون لها نسب خلط مختلفة. حجم المطلوبة للوحة 100 ملم العادية حوالي 40 مل.
    9. دع الايبوكسي يخلط جيدًا لمدة 10 دقيقة في دوار حتى يصبح الخليط متجانسًا بشكل واضح (أي لا توجد قطع أثرية مرئية تشبه الألياف في السائل).
    10. طرد مركزي خليط الايبوكسي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء اشتعلت في الداخل.
    11. خلال الطرد المركزي ، قم بنشر طبقة رقيقة من شحوم السيليكون حول الجدران وجميع الأجزاء البلاستيكية الأخرى المكشوفة من طبق الثقافة. وهذا سيمنع الايبوكسي من البلمرة مع البلاستيك الطبق وسوف تمكن من إزالة الايبوكسي الشفاء بسهولة في نهاية البروتوكول.
    12. صب الايبوكسي ببطء في الطبق حتى يغطي تماما PDMS ويذهب إلى أبعد من ذلك من قبل ما لا يقل عن 5 ملم. منع تشكيل أي فقاعات داخل الايبوكسي عن طريق الحفاظ على مسافة صفر بين الأنبوب ولوحة. ضع اللوحة في مكان آمن حتى لا يتم نقلها لل48 ساعة القادمة.
    13. بعد 48 ساعة ينبغي الشفاء تماما الايبوكسي. أدخل الطبق في فرن محمّى مسبقاً على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 3 س للشفاء النهائي.
    14. إزالة الايبوكسي الشفاء من لوحة وقالب PDMS الأصلي عن طريق انتزاع بلطف الجدار البلاستيكي لللوحة حتى ينكسر. وينبغي بعد ذلك فصل بسهولة من الايبوكسي وقشر قبالة.
    15. بمجرد استخراجها ، امسح الشحوم المتبقية من النسخة المتماثلة الجديدة من الايبوكسي وإيعليها رأسًا على عقب (أي مع العناصر الدقيقة المنسوخة التي تواجه) في طبق ثقافة جديد. النسخة المتماثلة الايبوكسي الآن جاهزة للصب PDMS.
    16. استخدام الهواء المضغوط أو N2 لتفجير أي بقايا PDMS أو الأوساخ قبالة قالب الايبوكسي وشطف ه 2x مع isopropanol. ملئه مرة ثالثة واحتضان لمدة 10 دقيقة على لوحة شاكر المدارية. شطف القالب مرة أخرى 3x مع isopropanol وتجاهل السائل المتبقية. تُفجر بالهواء أو N2 أو توضع في فرن 70 درجة مئوية حتى يجف.
      ملاحظة: اتبع إجراءات السلامة عند العمل مع والتخلص من isopropanol.
    17. إبقاء لوحات العفن مغلقة حتى الصب. اتبع الخطوات 1.1.8.-1.1.11.
  3. اللكم والنحت PDMS في MFC(الشكل 2)
    1. قطع وإزالة قالب PDMS من لوحة باتباع علامات (+) على رقائق باستخدام مشرط. لا تستخدم القوة ، لأن القوالب هشة(الشكل 2A).
    2. اتبع التعليمات المرسومة على رسم لكمة وقطع الغرف اعتمادا على الإعداد التجريبي(الشكل 2B-F).
      1. لثقافة explant الحبل الشوكي(الشكل 2C, E),لكمة اثنين من الآبار 7 ملم في الجانب القاصي من MFC كبيرة. حدد موقع الآبار بطريقة تتداخل مع حواف القناة. على الجانب القريب ، لكمة واحدة 7 ملم جيدا في منتصف القناة ، مع الحد الأدنى من التداخل بحيث سيتم ترك مساحة كافية للexplants. لكمة اثنين من ثقوب 1 مم إضافية في حواف اثنين من القناة القريبة. بدوره MFC مع العناصر microfluidic التي تواجه صعودا، واستخدام إبرة 20 G، نحت ثلاثة كهوف صغيرة explant على 7 مم لكمة جيدا.
      2. للثقافة MN منفصلة(الشكل 2D، F)،لكمة أربعة آبار 6 ملم في حواف قناتين من MFC صغيرة.
  4. تعقيم MFC لاستخدام زراعة الأنسجة
    1. انتشار 50 سم أشرطة الشريط لزجة طويلة على مقاعد البدلاء. اضغط واسحب الغرفة لمواجهة الشريط اللاصق (كلا الوجهين العلوي والسفلي) وإزالة الأوساخ الخام. ضع الغرف النظيفة في لوحة جديدة بطول 15 سم.
      ملاحظة: لا تضغط مباشرة على العناصر microfluidic عندما تواجه هذه صعودا.
    2. احتضان الغرف في الصف التحليلي 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة على شاكر المداري.
    3. التخلص من الإيثانول وتجفيف الغرف في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة أو في الفرن في 70 درجة مئوية.
  5. وضع MFC على طبق قاع زجاجي
    1. ضع الغرفة في وسط طبقة الأنسجة من الثقافة 35 مم/50 مم طبق قاع زجاجي وتطبيق قوة طفيفة على الحواف لجعل PDMS وطبق ربط أسفل. لتجنب كسر الجزء السفلي الزجاجي، قم دائمًا بتطبيق القوة على سطح صلب.
    2. احتضان 10 دقيقة في 70 درجة مئوية. اضغط على الغرف لتعزيز الالتزام لوحة.
    3. احتضان تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
  6. الطلاء وزراعة
    1. أضف 1.5 نانوغرام/مل بولي-L-ornithine (منظمة التحرير الفلسطينية) إلى كلا المقصورات. تأكد من أن منظمة التحرير الفلسطينية تعمل عبر القنوات عن طريق الأنابيب وسائل الإعلام الطلاء عدة مرات مباشرة في مدخل القناة.
    2. فحص غرفة microfluidic تحت المجهر الخفيف مع التكبير 10x للتحقق من وجود فقاعات الهواء. إذا كانت فقاعات الهواء تمنع الأخاجوالصغيرة ، ضع MFC في مدي فراغ لمدة 2 دقيقة. في وقت لاحق، وإزالة الهواء الزائد التي حصلت على اشتعلت في القنوات عن طريق pipetting وسائل الإعلام الطلاء من خلالهم. احتضان بين عشية وضحاها.
    3. استبدل منظمة التحرير الفلسطينية باللامينين (3 ميكروغرام/مل في DDW) للحضانة بين عشية وضحاها بنفس الطريقة.
    4. قبل الطلاء، وغسل الصفيحة مع المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية.

2. الخلايا العصبية الثقافة الطلاء

  1. ثقافة الخلايا العصبية الحركية المنفصلة
    1. باستخدام مقص مستقيم وملقط غرامة، تشريح الحبل الشوكي من E12.5 ICR-HB9::GFP الجنين الماوس. العمل في حل HBSS 1X مع 1٪ البنسلين-streptomycin (P /S)(الشكل 3A-C).
    2. باستخدام مقص الميكروديسب ، وإزالة meninges وقرون الظهر(الشكل 3D).
    3. جمع قطع الحبل الشوكي ونقل إلى أنبوب(#1)مع 1 مل HBSS + 1٪ P / S.
    4. قطع الحبال الشوكية إلى قطع صغيرة باستخدام مقص منحني وانتظر القطع لتسوية.
    5. إضافة 10 ميكرولتر من التربسين 2.5٪ ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. بعد 5 دقيقة، مزيج عن طريق النقر على أنبوب. يجب أن تشكل القطع كتلة تشبه الحلزون.
    6. نقل كتلة في أنبوب جديد(#2)التي تحتوي على 800 ميكرولتر من L-15 الدافئة مسبقا، 100 ميكرولتر من BSA 4٪، و 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل DNase. طحن 2x، ثم انتظر 2 دقيقة للسماح القطع غير المنفصم تسوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد(#3).
    7. أضف 100 ميكرولتر من BSA 4٪ ، 20 ميكرولتر من 10 ملغم / مل DNase ، و 900 ميكرولتر من الوسط العصبي القاعدي الكامل (CNB ، انظر جدول المواد والجدول 1). طحن 8x وانتظر 2 دقيقة. جمع supernatant إلى أنبوب #3.
    8. كرر الخطوة 2.1.7 وطحن 10x. جمع supernatant لأنبوب #3. وينبغي ترك كمية صغيرة من الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب.
      ملاحظة: إذا كان كتلة كبيرة لا تزال في الجزء السفلي من أنبوب #2،كرر الخطوة 2.1.8.
    9. إضافة 1 مل من وسادة BSA 4٪ إلى الجزء السفلي من أنبوب #3.
    10. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة. تخلص من supernatant.
    11. إعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق النقر بلطف على الأنبوب، ثم إضافة 1 مل من وسط CNB. Pipette 6x وإضافة 20 ميكرولتر من 10 ملغ / مل DNase.
    12. ملحق مع إضافية 5 مل من متوسطة CNB ونقل 3 مل إلى أنبوب جديد(#4).
    13. أضف 1 مل من متوسط تدرج الكثافة بنسبة 10.4٪ (انظر الجدول 2)إلى أسفل كل أنبوب(#3 #4). يجب أن يظهر فصل مرحلة حاد بين الواجهتين.
    14. الطرد المركزي في 775 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). وينبغي أن يكون تباطؤ أجهزة الطرد المركزي عند مستوى منخفض لتجنب انهيار مرحلة الفصل.
    15. يجب أن تكون الخلايا عائمة، تظهر كمرحلة غائمة بين الوسائط. جمع الخلايا من كلا الأنبوبين إلى أنبوب جديد(#5)تحتوي بالفعل على 1 مل CNB المتوسط.
    16. إضافة إضافية 4-6 مل من وسط CNB.
    17. أضف 1 مل من وسادة BSA 4٪ إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
    18. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه بلطف مع 1 مل من متوسطة CNB.
    19. عد الخلايا. ومن المتوقع أن تسفر عن 0.75-1 × 106 MN لكل الحبل الشوكي.
      ملاحظة: يحتوي الحبل الشوكي Ventral أيضًا على أنواع فرعية أخرى من الخلايا العصبية إلى جانب الخلايا العصبية الحركية (على سبيل المثال، الخلايا العصبية البينية). تعتمد نقاء MN في الغالب على إزالة المناطق الظهرية أثناء التشريح والقدرة على الوصول إلى المناطق الوردية الغنية MN. لضمان الخلايا العصبية المصوّرة هي MNs ، يوصى باستخدام سلالة فئران مع علامة MN داخلية ، مثل فئران HB9:: GFP. لتحقيق ثقافة MN نقية (ولكن مع انخفاض غلة الخلية)، واستخدام تنقية FACS15 ممكن.
    20. طلاء الثقافة MN المنفصلة في MFC
      1. ركز على 150,000 مليون متر لكل غرفة عن طريق الطرد المركزي بمعدل 400 × ز لمدة 5 دقيقة.
      2. استنشق supernatant وإعادة تعليق الخلايا بلطف في متوسطة عصبية غنية (RNB) في 4 ميكرولتر لكل MFC. RNB هو CNB تستكمل مع إضافية 2٪ B27 و 25 نانوغرام / مل BDNF.
      3. قم بإزالة الوسط من كلا المقصورات، مع ترك حجم منخفض يعادل ~ 10 ميكرولتر في آبار المقصورة المنتفخة. يبدو كحلقة رقيقة من الوسط في محيط البئر.
      4. تحميل ببطء 4 μL من الخلايا في القناة. إخراج 4 ميكرولتر من البئر في الجانب الآخر من القناة، وتحميلها ببطء مرة أخرى مباشرة في القناة لعكس التدفق الحالي وزيادة كثافة الخلية في القناة.
      5. تحقق من أن الخلايا قد دخلت القناة باستخدام مجهر خفيف 10x ووضع الغرفة في الحاضنة لمدة 30 دقيقة دون إضافة المزيد من الوسائط.
      6. إضافة ببطء ~ 10-15 ميكرولتر من RNB في الآبار القريبة والبعيدة ووضع الغرف في الحاضنة لمدة 15 دقيقة أخرى.
      7. بعد هذه الحضانة، أضف ببطء ~ 75-80 ميكرولتر من RNB إلى كل بئر.
    21. صيانة ثقافة MN المنفصلة
      1. بعد يوم واحد من الطلاء (DIV1)، استبدال المتوسطة مع RNB تكملها مع 1 ميكرومتر سيتوزين arabinoside (آرا C) لمنع نمو الدبقية.
      2. بعد يومين من تطبيق Ara-C (DIV3) استبدال المتوسطة مع متوسطة CNB جديدة في المقصورة القريبة (بدون Ara-C).
      3. من أجل تعزيز عبور محاور عصبية من خلال microgrooves, تطبيق RNB تستكمل مع 25 نانوغرام / مل من عامل العصبية المشتقة من الخلايا الدبقية (GDNF) و 25 نانوغرام / مل من عامل العصبية المستمدة من الدماغ (BDNF) فقط إلى المقصورة القاصية. الحفاظ على تدرج حجم لا يقل عن 10 ميكرولتر لكل بئر بين الآبار الزعرية المحورية (حجم أعلى) والآبار القريبة.
      4. تحديث المتوسط كل يومين. يمكن أن يستغرق محاور عصبية تصل إلى 4-6 أيام لعبور distally.
  2. زراعة الحبل الشوكي
    1. باستخدام مقص مستقيم وملقط غرامة، تشريح الحبل الشوكي من E12.5 ICR-HB9::GFP الجنين الماوس. العمل في حل HBSS 1X مع 1٪ البنسلين-streptomycin (P /S)(الشكل 3A-C).
    2. باستخدام مقص الميكروديسب ، وإزالة meninges وقرون الظهر(الشكل 3D).
    3. قطع الحبل الشوكي إلى 1 مم أقسام عرضية سميكة(الشكل 3E). تخلص من جميع الوسائط من المقصورة القريبة من MFC.
    4. التقاط explant الحبل الشوكي واحد مع ماصة في حجم إجمالي قدره 4 μL. حقن explant أقرب وقت ممكن إلى الكهف واستخلاص أي سائل مفرط من البئر القريبة عبر المنافذ الجانبية (1 ملم اللكمات). يجب أن يتم امتصاص النباتات السابقة في القناة القريبة.
    5. إضافة ببطء 150 ميكرولتر من الحبل الشوكي explant المتوسطة (SCEX، انظر جدول المواد والجدول 3)إلى البئر القريب.
    6. صيانة زراعة الحبل الشوكي
      1. إضافة SCEX المتوسطة في المقصورة القريبة، وغنية SCEX المتوسطة (SCEX مع 50 نانوغرام / مل من BDNF وGDNF) في المقصورة القاصية. الحفاظ على تدرج حجم لا يقل عن 15 ميكرولتر لكل بئر بين الآبار المنتفخة (حجم أعلى) والبئر القريب.
      2. تحديث المتوسط كل يومين. يمكن أن يستغرق محاور عصبية تصل إلى 3-5 أيام لعبور distally.

3- النقل المحوري(الشكل 4أ)

  1. وضع العلامات على الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية
    1. إعداد المتوسط SCEX جديدة (أو CNB لMN منفصلة) التي تحتوي على 100 nM Mitotracker عميق FM الأحمر و 100 nM LysoTracker الأحمر. احتضان لمدة 30-60 دقيقة في 37 درجة مئوية. يمكن استخدام الألوان الأخرى طالما أن الفلوروبورورس لا تتداخل.
    2. اغسل 3x مع وسط CNB/SCEX الدافئ. لوحات جاهزة للتصوير.
  2. التصوير المباشر
    1. الحصول على 100 سلسلة صور الفاصل الزمني من النقل المحوري في 3 فترات ثانية، مع ما مجموعه 5 دقيقة لكل فيلم.
      ملاحظة: تضمن نظام التصوير المستخدم في هذه الدراسة مجهرًا مقلوبًا مجهزًا ببؤرة أقراص دوارة، يتم التحكم فيه عبر برنامج تصوير الخلايا الخاص، وعدسة زيت 60x، وNA = 1.4، وكاميرا EMCCD. تم الحصول على الأفلام في بيئة خاضعة للرقابة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن صورة أفلام الفاصل الزمني الأطول أو الأقصر، اعتمادًا على التجربة. حتى الأفلام بين عشية وضحاها يمكن تسجيلها إذا لزم الأمر. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان محاولة تقليل وقت التعرض وقوة الليزر ، فضلا عن عدد من مجموع الصور ، للحد من السمية الضوئية والتبييض أثناء الحصول على الفيلم.

4. تحليل الصور (الأرقام 4-5)

  1. تحليل توزيع وكثافة نقل الجسيمات باستخدام تحليل الكيموغراف
    1. افتح الملف في فيجي. قنوات منفصلة تضغط على الصورة | أكوام | أدوات | deinterleave.
    2. تعيين خصائص الصورة عن طريق الضغط على الصورة | خصائص.
    3. اختر أداة الخط المجزأ بالنقر بزر الماوس الأيمن على رمز الخط. تعيين العرض إلى 8-10 بالنقر المزدوج على رمز الخط. أن تكون متسقة مع عرض الخط نفسه في جميع أنحاء التحليل بأكمله.
    4. وضع علامة على خط مجزأ يتبع مسار محور عصبي من القاصي إلى القريب. انقر نقرًا مزدوجًا لإيقاف وضع علامة على الخط.
    5. انقر فوق t لإضافة منطقة خط جديد ذات أهمية (ROI) إلى مدير عائد الاستثمار. أضف هذا إلى جدول تحليل جدول البيانات.
    6. انقر فوق m لقياس المنطقة وطول محور عصبي. أضف هذا إلى جدول التحليل.
    7. إنشاء كيموجراف بالنقر فوق الإضافات | كيمو واتبوكس | رسم كيمو. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام غيرها من الإضافات جيل kymograph المتاحة.
    8. عد يدويا تتحرك (الرجعية أو anterograde) والجسيمات غير المتحركة وإضافتها إلى الجدول في العمود الصحيح.
      ملاحظة: تصنف الجسيمات على أنها سابقة متحركة (أي تتحرك يسارًا في الكيموغراف) أو إلى الوراء (أي تتحرك يمينًا) إذا كان نزوحها أعلى من 10 ميكرومتر في الاتجاه المحدد. فمن الممكن لقياس النزوح ببساطة عن طريق وضع علامة على خط أفقي مع رمز الخط والضغط على م. يتم تعريف الجسيمات غير المتنقلة أو تلك التي لا تفي بمعايير الإزاحة بأنها غير متحركة(الشكل 4B).
  2. تتبع الجسيمات واحد: تتبع يدوي
    1. تحميل البرنامج المساعد تتبع دليل لبرنامج فيجي (التي وضعتها فابريس P. Cordelière) من http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. فتح الملف في فيجي / ImageJ. استخدم خيار التدوير لمحاذاة أخازر MFC أفقيًا.
    3. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء إذا لزم الأمر، انقر فوق عملية | طرح الخلفية.
    4. افتح البرنامج المساعد للتتبع اليدوي. تعيين المعلمات (على سبيل المثال، حجم البكسل، الفاصل الزمني، وما إلى ذلك) وفقًا للمجهر المحدد المستخدم للتصوير. بالنسبة للنتائج الموضحة هنا، كان المجهر والعدسة النسبة 0.239 ميكرومتر/بكسل وكان الفاصل الزمني للإطار 3 ثوان.
    5. الحصول على المسارات X و Y إحداثيات وحفظ النتائج عن طريق نسخ النص إلى جدول البيانات.
    6. تحليل الأفلام متعددة القنوات من خلال النقر على الصورة | اللون | دمج القنوات لدمج القنوات ثم تعقب puncta colocalized فقط.
  3. تتبع الجسيمات واحد: تتبع شبه الآلي (الشكل 5)
    1. افتح برنامج التحليل. استخدمت هذه الدراسة Bitplane Imaris البرمجيات الإصدار 8.4.1.
    2. التبديل إلى تجاوز في القائمة العليا.
    3. انقر فوق معالجة الصور | مبادلة الوقت وZ | طيب .
    4. انقر فوق تحرير | خصائص الصورة (Ctrl+I) | الهندسة | Voxel حجم الصف. تعيين خصائص الصورة وفقًا لإعداد المجهر المستخدم.
      ملاحظة: بالنسبة للبيانات المعروضة هنا، كانت نسبة المجهر والعدسة 0.239 ميكرومتر/بكسل.
    5. انقر فوق كافة المسافات المتساوية وتغيير الفاصل الزمني. على سبيل المثال، استخدم 3 s كفاصل زمني. انقر على زر إعادة التعيين في الأسفل الأيمن أو انقر فوق Ctrl+B.
    6. إضافة طبقة من البقع في أعلى اليسار عن طريق النقر على أيقونة البقع الصفراء الصغيرة. في أسفل اليسار يتم فتح قائمة جديدة لتحرير البقع.
    7. اضغط على السهم الأزرق الأيمن حتى يبدأ الكشف عن البقعة.
      ملاحظة: من المهم تصفية بعض النقاط باستخدام عامل التصفية على أسفل يسار الإطار. تحقق من الفيلم عدة مرات لمعرفة تحديد عدد كاف من النقاط.
    8. تحقق من المعلمات أو تكوينها لتتناسب مع الاحتياجات التجريبية. على سبيل المثال، المسافة القصوى = 12 ميكرومتر (الحد الأقصى المسموح له بالمسافة بين نقطتين متميزتين لا يزال تضمينها في نفس المسار الواحد)؛ الحد الأقصى لحجم الفجوة = 1 (عدد الإطارات التي يُسمح للمسار بتفويتها ولا يزال يعتبر مسارًا واحدًا).
    9. انقر فوق الإعدادات ثم تتبع نمط = إيقاف، نقاط = اسفير.
    10. باستخدام شريط التصفية،اختر فلاتر مختلفة للتعديل. على سبيل المثال، في البيانات المتوفرة هنا، قام Track Duration = 9 بإزالة جميع المسارات بأقل من 3 إطارات. عند تعيين كافة المعلمات، انقر فوق السهم الأخضر الأيمن. مزيد من التحرير غير ممكن بعد هذه الخطوة.
    11. انقر فوق قلم رصاص صغير مع النقاط تحرير يدويا جميع المسارات.
    12. عرض الفيلم(الشكل 5B). في حالة حدوث خطأ، هناك العديد من الخيارات الممكنة:
      1. لقطع اتصال المسار، انقر فوق خيار الكائن واختيار النقطتين اللتين تحتاجان إلى قطع الاتصال مع Ctrl، واختر قطع الاتصال.
      2. لتوصيل مسار، انقر فوق خيار الكائن، واختر النقطتين اللتين تحتاجان إلى توصيل Ctrl واختر الاتصال.
      3. لحذف مسار أو بقعة، مع الخيار الصحيح(المسار / الكائن)،والتبديل إلى الشاشة مع رمز قلم رصاص العادية،واختيار حذف.
      4. لإضافة البقع يدويًا، قم بالتبديل إلى شاشة أيقونة القلم الرصاص العادية. في الجزء السفلي من الشاشة هناك علامة تتبع يدوي. تأكد من أن خانة الاختيار للاتصال التلقائي هي V. على الفيلم نفسه، من أجل إضافة بقعة، اضغط على زر التحول وانقر على اليسار.
    13. لإضافة بقعة إلى مسار موجود، اختر المسار المطلوب (الأصفر) والإطار، والتبديل إلى شاشة أيقونة القلم الرصاص العادية وإضافة بقعة يدوياً. عند الانتهاء من الفيلم بأكمله، قم بالتبديل إلى الرمز الذي يشبه الرسم البياني الأحمر (الإحصائيات). من الممكن تحرير المعلمات التي تم تحليلها لاحقًا. للتحرير، في أسفل يسار الشاشة، اضغط على أيقونة المفتاح السويدية. على سبيل المثال: الموضع X، الموضع Y.
    14. اضغط على الرمز الذي يشبه عدة أقراص مرنة، قم بتصدير جميع الإحصائيات.
      ملاحظة: يمكن معالجة إخراج جدول البيانات إما مباشرة أو مزيد من التحليل باستخدام التعليمات البرمجية المنشورة9 المستخدمة لهذا التحليل، والتي سيتم مشاركتها عند الطلب. يتم استخراج المعلمات التالية من التحليل: السرعة، إزاحة المسار، طول التشغيل، السرعة (بما في ذلك الاتجاه)، عدد الإيقاف، متوسط مدة الإيقاف، ألفا، تغييرات الاتجاه، والسرعة الفورية. ويرد وصف مفصل لكل معلمة في غلوسكا وآخرون9.

النتائج

بعد البروتوكول الموصوف ، تم استزراع النباتات الجنينية HB9:: GFP في MFC(الشكل 4A). ويزرع Explants لمدة 7 أيام، عندما عبرت محاور عصبية تماما في المقصورة القاصية. تمت إضافة الأصباغ الحمراء الحمراء الميثواكر والليسوراكر إلى المقصورات القاصية والقريبة من أجل ت?...

Discussion

في هذا البروتوكول، ونحن نصف نظام لتتبع النقل المحوري للالميتوكوندريا والمقصورات الحمضية في الخلايا العصبية الحركية. يسمح هذا النظام المُبسّط في المختبر بالتحكم الدقيق، والمراقبة، والتلاعب بمقصورات الخلايا العصبية تحت الخلية، مما يتيح إجراء تحليل تجريبي للوظائف المحلية للخلايا العصبي...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF، 561/11) ومجلس البحوث الأوروبي (ERC، 309377).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD cameraAndor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)Sigma-AldrichC1768stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-250Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mmWorld Precision Instruments WPI504530For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mmWorld Precision Instruments WPI504533For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mmWorld Precision Instruments WPI504534For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v in ddw
ChlorotrimetylsilaneSigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreasSigma-AldrichDN-25stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone greaseSigma-AldrichZ273554-1EAFor epoxy mold preperation
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mmF.S.T1125520
Epoxy HardenerTrias Chem S.R.LIPE 743For epoxy mold preperation
Epoxy ResinTrias Chem S.R.LRP 026UVFor epoxy mold preperation
FIJI softwareImageJ
GDNFAlomone LabsG-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP mice strainJackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-045Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ softwareAndor
Iris scissors, curved, 10 cmAS Medizintechnik11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Neurobasal mediumThermo Fisher21103049
Nikon Eclipse Ti micorscopeNikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) SolutionBiological Industries03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW Corning Corporation#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreasSigma-AldrichT1426stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm bladeF.S.T15000-00
Yokogawa CSU X-1Yokogawa

References

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved