Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Riepilogo

Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute dei motoneuroni. In questo protocollo forniamo un metodo dettagliato per tracciare il trasporto assonale di compartimenti acidi e mitocondri negli assoni dei motoneuroni utilizzando camere microfluidiche.

Abstract

I motoneuroni (MN) sono cellule altamente polarizzate con assoni molto lunghi. Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute di MN, contribuendo alla crescita neuronale, allo sviluppo e alla sopravvivenza. Descriviamo un metodo dettagliato per l'uso di camere microfluidiche (MFC) per il monitoraggio del trasporto assonale di organelli etichettati fluorescenti negli assoni MN. Questo metodo è rapido, relativamente poco costoso, e consente il monitoraggio di segnali intracellulari nello spazio e nel tempo. Descriviamo un protocollo passo dopo passo per: 1) Fabbricazione di MFC polidimetilsiloxane (PDMS); 2) placcatura degli esanti del midollo spinale ventrale e coltura dissociata MN nelle MFC; 3) Etichettatura dei mitocondri e dei compartimenti acidi seguita dall'immaginazione confocale viva; 4) Analisi manuale e semiautomatica del trasporto assonale. Infine, dimostriamo una differenza nel trasporto di mitocondri e compartimenti acidi di HB9::GFP del midollo spinale ventrale degli assoni explant come prova della validità del sistema. Complessivamente, questo protocollo fornisce uno strumento efficiente per studiare il trasporto assonale di vari componenti assonali, nonché un manuale semplificato per l'utilizzo di MFC per aiutare a scoprire le possibilità spaziali sperimentali.

Introduzione

Le MN sono cellule altamente polarizzate con lunghi assoni, che raggiungono fino a un metro di lunghezza negli esseri umani adulti. Questo fenomeno crea una sfida critica per il mantenimento della connettività e della funzione MN. Di conseguenza, le MN dipendono da un corretto trasporto di informazioni, organelli e materiali lungo gli assoni dal loro corpo cellulare alla sinapsi e alla schiena. Vari componenti cellulari, come proteine, RNA e organelli, vengono trasportati regolarmente attraverso gli assoni. I mitocondri sono organelli importanti che vengono regolarmente trasportati in MN. I mitocondri sono essenziali per la corretta attività e funzione delle MN, responsabili della fornitura ATP, del buffering del calcio e dei processi di segnalazione^1,2. Il trasporto assonale dei mitocondri è un processo ben studiato^3,4. È interessante notare che, difetti nel trasporto mitocondriale sono stati segnalati per essere coinvolti in diverse malattie neurodegenerative e in particolare nelle malattie MN⁵. I compartimenti acidi servono come un altro esempio per gli organelli intrinseci che si muovono lungo gli assoni MN. I compartimenti acidi includono lisosomi, endosomi, apparati trans-Golgi e alcune vescicle secretory⁶. I difetti nel trasporto assonale di compartimenti acidi sono stati riscontrati in diverse malattie neurodegenerative e⁷, e recenti documenti sottolineano la loro importanza nelle malattie MN⁸.

Per studiare in modo efficiente il trasporto assonale, le camere microfluidiche che separano i compartimenti somatici ed assonali sono spesso utilizzate^9,10. I due vantaggi significativi del sistema microfluidico, e la compartimentazione e l'isolamento degli assoni, lo rendono ideale per lo studio dei processi subcellulari¹¹. La separazione spaziale tra i corpi cellulari neuronali e gli assoni può essere utilizzata per manipolare gli ambienti extracellulari di diversi compartimenti neuronali (ad esempio, assoni contro soma). Biochimica, crescita/degenerazione neuronale e immunofluorescenza attraggono tutti i benefici di questa piattaforma. Le MFC possono anche aiutare a studiare la comunicazione tra cellule coculcolando neuroni con altri tipi di cellule, come i muscoli scheletrici^12,13,14.

Qui, descriviamo un protocollo semplice ma preciso per il monitoraggio dei mitocondri e del trasporto dei compartimenti acidi nei motoneuroni. Mostriamo inoltre l'uso di questo metodo confrontando la percentuale relativa di organelli mobili retrogradi e anterogradili, nonché la distribuzione della velocità di trasporto.

Protocollo

La cura e il trattamento degli animali in questo protocollo sono stati eseguiti sotto la supervisione e l'approvazione del Comitato universitario di Tel Aviv per l'etica animale.

1. Preparazione MFC

1. Fusione PDMS negli stampi primari (Figura 1)
   1. Acquistare o creare stampi primari (wafer) seguendo un protocollo dettagliato⁹.
   2. Utilizzare l'aria pressurizzata per rimuovere qualsiasi tipo di sporco dalla piattaforma wafer prima di procedere alla fase di rivestimento. La superficie dei wafer dovrebbe apparire liscia e chiara.
   3. Riempire un contenitore con 50 mL di azoto liquido. Preparare una siringa da 10 mL e un ago da 23 G.
      NOTA: tutte le procedure di questo passo in avanti devono essere eseguite in una cappa chimica.
   4. Nel cofano chimico, utilizzare la siringa e l'ago per mettere in comune 2 mL di azoto liquido. Anche se può sembrare che l'aria sia stata disegnata, la siringa è piena di azoto (Figura 1A). Collocare la piastra contenente wafer in un contenitore sigillabile.
   5. Allestire una bottiglia di clorotrimethylsilane, forare il tappo di gomma usando la siringa piena di azoto e iniettare l'intero contenuto della siringa nella bottiglia. Senza tirare fuori l'ago, capovolgere la bottiglia e tirare indietro 2 mL di clorotrimethylsilane.
      NOTA: A causa della pressione delle siringhe, una piccola quantità di clorotrimethylsilante viene spruzzata fuori dall'ago. Per evitare un pericolo, puntare l'ago verso la parete interna del cofano (Figura 1B).
   6. Stendere la cloroofetilalasia uniformemente nel contenitore (dal punto 1.1.4), ma non direttamente sul wafer o sulla piastra contenente wafer. Chiudere il contenitore e incubare per 5 min per wafer.
      NOTA: Se questa è la prima volta che il wafer è rivestito con clorotrimethylsilane, deve essere consentita un'incubazione di 1 h per ogni wafer.
   7. Non prendere i wafer e il contenitore dal cappuccio chimico per 30 min.
      AVVISO: la clorotrimethylsila è altamente volatile.
   8. Pesare la base PDMS (vedere Tabella dei materiali) in un tubo da 50 mL e aggiungere l'agente di polimerità PDMS con un rapporto rispettivamente di 16:1 (ad esempio, 47,05 g di base e 2,95 g di agente di polimerità). Mescolare per 10 min utilizzando un rotatore a bassa velocità.
   9. Versare PDMS in ogni piastra contenente wafer all'altezza desiderata (Figura 1C).
      NOTA: l'utilizzo di camere microfluidiche sottili (fino a 3-4 mm) migliora l'aderenza al piatto di coltura e previene le perdite.
   10. Mettere tutte le piastre insieme all'interno di un desiccatore a vuoto per 2 h (Figura 1E). Questo processo rimuove l'aria intrappolata all'interno del PDMS, eliminando così le bolle d'aria e formando uno stampo chiaro e uniforme.
   11. Collocare le piastre all'interno di un forno per 3 h (o durante la notte) a 70 gradi centigradi(Figura 1E).
       NOTA: Le piastre devono essere livellate quando vengono posizionate nel forno.
2. PdMS colata in stampi epossidici
   NOTA: Poiché la preparazione del wafer è costosa, richiede attrezzature speciali e può danneggiare i wafer fragili, è possibile generare repliche epossidiche di wafer. Le repliche sono più economiche, più durevoli e possono essere utilizzate per la produzione di massa di camere microfluidiche.
   1. Lanciare e curare il PDMS (come descritto in 1.1.8-1.1.11) nel wafer originale.
   2. Rimuovere e tagliare le parti in eccesso del PDMS lasciando solo gli elementi microfluidici e l'area funzionale necessaria per elaborarli in camere microfluidiche.
   3. Avvolgere immediatamente il PDMS con nastro adesivo e denso per evitare che si accumuli polvere.
   4. Scegli un piatto di plastica di grado di coltura dei tessuti che si adatta all'intero PDMS all'interno e lasciare spazio per epossidica intorno ad esso. La distanza dal PDMS al piatto di plastica deve essere inferiore a 5 mm.
   5. Preparare una piccola quantità di PDMS mista in un rapporto di 10:1 (base:agente di polimerità). Il PDMS liquido fresco verrà utilizzato per incollare il PDMS solido sul fondo della piastra di plastica.
   6. Applicare una quantità minima del PDMS liquido sul fondo centrale della piastra di plastica e quindi rimuovere il nastro adesivo dal PDMS e aderire al fondo del piatto di plastica. Assicurarsi che gli elementi microfluidici siano rivolti verso l'alto.
   7. Lasciare che il PDMS guarisca per 30 min in un forno a 70 gradi centigradi.
   8. Preparare la resina epossidica mescolando la base e l'agente di polimerità in un rapporto di 100:45 rispettivamente in una provetta. Resine epossidiche diverse possono avere rapporti di miscelazione diversi. Il volume richiesto per una piastra normale da 100 mm è di circa 40 mL.
   9. Lasciate che la resina epossidica si mescoli bene per 10 min in un rotatore fino a quando la miscela diventa visibilmente omogenea (cioè, non ci sono manufatti in fibra visibile nel liquido).
   10. Centrifugare la miscela epossidica a 400 x g per 5 min per rimuovere le bolle d'aria catturate all'interno.
   11. Durante la centrifuga, diffondere un sottile strato di grasso di silicone intorno alle pareti e tutte le altre parti di plastica a vista del piatto di coltura. Ciò impedirà alla resina epossidica di polimerizzare con la plastica piatto e consentirà la rimozione della resina epossidica curata facilmente alla fine del protocollo.
   12. Versare lentamente la resina epossidica nel piatto fino a coprire completamente il PDMS e va oltre di almeno 5 mm. Prevenire la formazione di eventuali bolle all'interno della resina epossidica mantenendo la distanza zero tra il tubo e la piastra. Posizionare la piastra in un luogo sicuro in modo che non venga spostata per le successive 48 h.
   13. Dopo 48 h la resina epossidica deve essere completamente curata. Inserire la piastra in forno preriscaldato a 80 gradi centigradi per 3 h per la stagionatura finale.
   14. Rimuovere la resina epossidica curata dalla piastra e lo stampo PDMS originale agitando delicatamente la parete di plastica della piastra fino a quando non si rompe. Dovrebbe quindi separarsi facilmente dalla resina epossidica e staccarsi.
   15. Una volta estratto, pulire il grasso rimanente dalla nuova replica epossidica e inserirlo a testa in giù (cioè con gli elementi microfluidici replicati rivolti verso l'alto) in un nuovo piatto di coltura. La replica epossidica è ora pronta per il cast PDMS.
   16. Utilizzare aria pressurizzata o N₂ per soffiare eventuali resti di PDMS o sporciziare lo stampo epossidica e risciacquare 2x con isopropanolo. Riempire una terza volta e incubare per 10 min su una piastra shaker orbitale. Sciacquare nuovamente lo stampo 3x con isopropanolo e scartare il liquido rimanente. Soffiare a secco con aria o N₂ o mettere in forno a 70 gradi centigradi fino a secco.
       NOTA: Seguire le procedure di sicurezza quando si lavora con e si elimina l'isopropanolo.
   17. Tenere i piatti di stampo chiusi fino alla colata. Seguire i passaggi 1.1.8.-1.1.11.
3. Punching e scultura del PDMS in un MFC (Figura 2)
   1. Tagliare e rimuovere lo stampo PDMS dalla piastra seguendo i segni (-) sui wafer utilizzando un bisturi. Non usare la forza, poiché gli stampi sono fragili (Figura 2A).
   2. Seguire le istruzioni disegnate sullo schizzo per punzonare e tagliare le camere a seconda della configurazione sperimentale (Figura 2B-F).
      1. Per lacolturadell'espianto del midollo spinale ( Figura 2C,E), perforare due pozze da 7 mm nel lato distale di un MFC di grandi dimensioni. Individuare i pozze in modo che si sovrappongano ai bordi del canale. Sul lato prossimale, perforare un pozzo di 7 mm al centro del canale, con una sovrapposizione minima in modo che venga lasciato spazio sufficiente per gli espianti. Punch due fori aggiuntivi di 1 mm nei due bordi del canale prossimale. Girare il MFC con gli elementi microfluidici rivolti verso l'alto, e utilizzando un ago da 20 G, intagliare tre piccole grotte espiante sul pozzo perforato 7 mm.
      2. Per le impostazioni cultura MN dissociate (Figura 2D,F), perforare quattro pozze da 6 mm ai bordi dei due canali di un piccolo MFC.
4. Sterilizzazione di MFC per l'utilizzo della coltura tissutale
   1. Stendere cinturini adesivi lunghi 50 cm sul banco. Premere e tirare indietro la camera per affrontare il nastro adesivo (sia facce superiori che inferiori) e rimuovere lo sporco grezzo. Collocare le camere pulite in una nuova piastra di 15 cm.
      NOTA: Non premere direttamente sugli elementi microfluidici quando questi sono rivolti verso l'alto.
   2. Incubare le camere in grado analitico 70% etanolo per 10 min su uno shaker orbitale.
   3. Smaltire l'etanolo e asciugare le camere in una cappa di coltura tissutale o in un forno a 70 gradi centigradi.
5. Posizionamento del MFC su un piatto di fondo di vetro
   1. Posizionare la camera al centro di una parabola inferiore in vetro di tipo 35 mm/50 mm e applicare una forza minore sui bordi per rendere il PDMS e il piatto inferiore legare. Per evitare di rompere il fondo di vetro, applicare sempre la forza su una superficie solida.
   2. Incubare 10 min in 70 gradi centigradi. Premere le camere per rafforzare l'aderenza alla piastra.
   3. Incubare sotto la luce UV per 10 min.
6. Rivestimento e coltura
   1. Aggiungere 1,5 ng/mL poly-L-ornithine (PLO) a entrambi i compartimenti. Assicurarsi che l'OLP stia correndo attraverso i canali pipettando il supporto di rivestimento un paio di volte direttamente all'ingresso del canale.
   2. Esaminare la camera microfluidica al microscopio luminoso con ingrandimento 10x per verificare la presenza di bolle d'aria. Se le bolle d'aria bloccano i microgroove, inserire mfc in un desiccatore vuoto per 2 min. Più tardi, rimuovere l'aria in eccesso che è stato catturato nei canali da pipeting il supporto di rivestimento attraverso di loro. Incubare durante la notte.
   3. Sostituire l'PLO con laminina (3 g/mL in DDW) per l'incubazione notturna nello stesso modo.
   4. Prima della placcatura, lavare la laminina con il mezzo di coltura neuronale.

2. Placcatura della coltura neuronale

1. Cultura dei motoneuroni dissociati
   1. Utilizzando forbici dritte e pinze sottili, sezionare un midollo spinale da un embrione di topo E12.5 ICR-HB9::GFP. Lavorare in una soluzione HBSS 1X con 1% penicillina-streptomycin (P/S) (Figura 3A-C).
   2. Utilizzando le forbici microdissezione, rimuovere le meningi e le corna dorsali (Figura 3D).
   3. Raccogliere i pezzi del midollo spinale e trasferirli nel tubo(#1) con 1 mL HBSS - 1% P/S.
   4. Tagliare i midollo spinale a piccoli pezzi utilizzando forbici curve e attendere che i pezzi si stabilizzino.
   5. Aggiungete 10 gradi di propina del 2,5% e mettete in un bagno d'acqua a 37 gradi per 10 min. Dopo 5 min, mescolare toccando il tubo. I pezzi dovrebbero formare un grumo elicoidale.
   6. Trasferire il grumo in un nuovo tubo (#2) contenente 800 luna di L-15 preriscaldato, 100 -L di BSA 4% e 100 L di 10 mg/mL DNase. Macinare 2x, quindi attendere 2 min per lasciare riposare i pezzi non dissociati. Trasferire il super-anabile in un nuovo tubo (#3).
   7. Aggiungete 100 L di BSA 4%, 20 l un l di 10 mg/mL DNase e 900 -L di mezzo neurobasale completo (CNB, vedere Tabella dei materiali e tabella 1). Macinare 8x e attendere 2 min. Raccogliere supernatali a tubo #3.
   8. Ripetere il passaggio 2.1.7 e macinare 10x. Raccogliere supernatali a tubo #3. Una piccola quantità di tessuto deve essere lasciata nella parte inferiore del tubo.
      NOTA: se un grosso grumo di grandi dimensioni rimane ancora nella parte inferiore del tubo #2, ripetere il passaggio 2.1.8.
   9. Aggiungere 1 mL di cuscino BSA 4% sul fondo del tubo #3.
   10. Centrifuga a 400 x g per 5 min. Scartare il supernatante.
   11. Risospendere il pellet cellulare toccando delicatamente il tubo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo CNB. Pipetta 6x e aggiungere 20 - L di 10 mg/mL DNase.
   12. Supplemento con un ulteriore 5 mL di CNB medio e trasferire 3 mL in un nuovo tubo (#4).
   13. Aggiungete 1 mL di 10,4% di pendenza media (vedere Tabella 2) alla parte inferiore di ogni tubo (#3 e #4). Dovrebbe apparire una netta separazione di fase tra le due interfacce.
   14. Centrifuga a 775 x g per 20 min a temperatura ambiente (RT). La decelerazione della centrifuga deve essere impostata su un livello basso per evitare la rottura della separazione di fase.
   15. Le celle dovrebbero essere galleggianti, apparendo come un'interfase nuvolosa tra i media. Raccogliere le cellule da entrambi i tubi in un nuovo tubo (#5) già contenente mezzo CNB preriscaldato da 1 mL.
   16. Aggiungere altri 4-6 mL di media CNB.
   17. Aggiungere 1 mL di cuscino BSA 4% sul fondo del tubo.
   18. Centrifuga a 400 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet con 1 mL di mezzo CNB.
   19. Conta le celle. Si prevede una resa di 0,75-1 x 10⁶ MN per midollo spinale.
       NOTA: il midollo spinale ventrale contiene anche altri sottotipi neuronali oltre ai motoneuroni (ad esempio, interneuroni). La purezza di MN dipende principalmente dalla rimozione delle aree dorsali durante la dissezione e dalla capacità di raggiungere aree rostrali arricchite di MN. Per garantire che i neuroni immagine siano MN, si raccomanda l'uso di un ceppo di topi con un marcatore MN endogeno, come i topi HB9::GFP. Per ottenere una cultura MN pura (ma con una diminuzione della resa cellulare), è possibile utilizzare la purificazione FACS^15.
   20. Placcaggio delle impostazioni cultura MN dissociate in MFC
       1. Concentrare 150.000 MN per camera centrifugando a 400 x g per 5 min.
       2. Aspirare il supernatore e respendere delicatamente le cellule in ricco mezzo neurobasal (RNB) a 4 .L per MFC. RNB è CNB integrato con ulteriore 2% B27 e 25 ng/mL BDNF.
       3. Rimuovere il supporto da entrambi i scomparti, lasciando un volume basso equivalente a 10 dollari l nei pozze del compartimento distale. Appare come un sottile anello di mezzo nel perimetro del pozzo.
       4. Caricare lentamente 4 celle nel canale. Estrarre 4 L del pozzo nell'altro lato del canale e caricarli lentamente direttamente nel canale per invertire il flusso di corrente e massimizzare la densità delle celle nel canale.
       5. Verificare che le cellule siano entrate nel canale utilizzando un microscopio luminoso 10x e posizionate la camera nell'incubatrice per 30 min senza aggiungere altri supporti.
       6. Aggiungete lentamente 10-15 dollari di RNB nei pozzetti prossimali e distale e mettete le camere nell'incubatrice per altri 15 min.
       7. A seguito di questa incubazione, aggiungere lentamente 75-80 dollari l'l ofrn in ogni pozzo.
   21. Manutenzione della coltura MN dissociata
       1. Un giorno dopo la placcatura (DIV1), sostituire il medio con RNB integrato con 1 x M cytosine arabinoside (Ara-C) per inibire la crescita gliale.
       2. Due giorni dopo l'applicazione Ara-C (DIV3) sostituire il supporto con il nuovo supporto CNB nel vano prossimale (senza Ara-C).
       3. Al fine di migliorare l'attraversamento degli assoni attraverso i microgroove, applicare l'RNB integrato con 25 ng/mL di fattore neurotrofico derivato da cellule gliali (GDNF) e 25 ng/mL del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) solo al compartimento distale. Mantenere un gradiente di volume di almeno 10 l per pozzo tra i pozzetti assonali (volume superiore) e i pozzi prossimali.
       4. Rinfrescare il supporto ogni 2 giorni. Si può prendere gli assoni fino a 4-6 giorni per attraversare distay.
2. Coltura di espianto del midollo spinale
   1. Utilizzando forbici dritte e pinze sottili, sezionare un midollo spinale da un embrione di topo E12.5 ICR-HB9::GFP. Lavorare in una soluzione HBSS 1X con 1% penicillina-streptomycin (P/S) (Figura 3A-C).
   2. Utilizzando le forbici microdissezione, rimuovere le meningi e le corna dorsali (Figura 3D).
   3. Tagliare il midollo spinale in sezioni trasversali spesse 1 mm (Figura 3E). Eliminare tutto il supporto dal raggruppamento prossimale del MFC.
   4. Raccogliere un singolo espianto del midollo spinale con una pipetta in un volume totale di 4 gradi centigradi. Iniettare l'espianto il più vicino possibile alla grotta e estrarre qualsiasi liquido eccessivo dal pozzo prossimale attraverso le prese laterali (1 mm punzonature). Gli espianti devono essere aspirati nel canale prossimale.
   5. Aggiungere lentamente 150 l di mezzo espianto del midollo spinale (SCEX, vedere Tabella dei materiali e Tabella 3)al pozzo prossimale.
   6. Manutenzione della coltura dell'espianto del midollo spinale
      1. Aggiungere il supporto SCEX nel vano prossimale e il nuovo mezzo SCEX (SCEX con 50 ng/mL di BDNF e GDNF) nel vano dissintoso. Mantenere un gradiente di volume di almeno 15 l per pozzo tra i pozzetti distale (volume più alto) e il pozzo prossimale.
      2. Rinfrescare il supporto ogni 2 giorni. Si può prendere gli assoni fino a 3-5 giorni per attraversare distay.

3. Trasporto axale (Figura 4A)

1. Etichettatura dei mitocondri e scomparti acidi
   1. Preparare nuovo SCEX medio (o CNB per dissociato MN) contenente 100 nM Mitotracker Deep Red FM e 100 nM LysoTracker Rosso. Incubare per 30-60 min a 37 gradi centigradi. Altri colori possono essere utilizzati fino a quando i loro fluorofori non si sovrappongono.
   2. Lavare 3x con mezzo caldo CNB/SCEX. Le piastre sono pronte per l'imaging.
2. Imaging dal vivo
   1. Acquisisci 100 serie di immagini time-lapse di trasporto assonale a intervalli di 3 s, per un totale di 5 min per film.
      NOTA: Il sistema di imaging utilizzato in questo studio includeva un microscopio invertito dotato di disco rotante confocale, controllato tramite software di imaging delle cellule di proprietà, lente ad olio 60x, NA - 1,4 e una fotocamera EMCCD. I filmati sono stati acquistati in un ambiente controllato a 37 gradi centigradi e al 5% di CO₂.
      NOTA: è possibile creare immagini di filmati time-lapse più lunghi o più brevi, a seconda dell'esperimento. Anche i filmati notturni possono essere registrati se necessario. Tuttavia, è fondamentale cercare di ridurre il tempo di esposizione e la potenza del laser, nonché il numero di immagini totali, per ridurre la fototossicità e lo sbiancamento durante l'acquisizione del film.

4. Analisi dell'immagine (figura 4-5)

1. Analisi della distribuzione e della densità del trasporto di particelle mediante l'analisi del kymografo
   1. Aprire il file in FIJI. Canali separati che premono Immagine Proprietà Stacks . Proprietà Tools (Strumenti) Deinterleave.
   2. Impostare le proprietà dell'immagine premendo Immagine Proprietà.
   3. Scegliere lo strumento Linea segmentata facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della linea. Impostare Larghezza su 8-10 facendo doppio clic sull'icona linea. Essere coerenti con la stessa larghezza della linea durante l'intera analisi.
   4. Contrassegnare una linea segmentata seguendo il percorso degli assi da distale a procetale. Fare doppio clic per interrompere la marcatura della linea.
   5. Fare clic su t per aggiungere una nuova area di interesse della riga (ROI) a Gestione ROI. Aggiungere questo valore a una tabella di analisi del foglio di calcolo.
   6. Fare clic su m per misurare l'area e la lunghezza dell'assone. Aggiungerlo alla tabella di analisi.
   7. Generare un kymograph facendo clic su Plugin Proprietà KymoToolBox . Disegna Kymo. In alternativa, possono essere utilizzati altri plugin di generazione kymograph disponibili.
   8. Contare manualmente lo spostamento (retrogrado o anterogrado) e le particelle non in movimento e aggiungerle alla tabella nella colonna corretta.
      NOTA: Le particelle sono classificate come anterogrado in movimento (cioè, spostandosi a sinistra nel kymografo) o retrogrado (cioè, spostandosi a destra) se il loro spostamento è superiore a 10 m nella direzione specifica. È possibile misurare lo spostamento semplicemente segnando una linea orizzontale con l'icona Linea e premendo m. Le particelle immobile o quelle che non soddisfano i criteri di spostamento sono definite come non trasferenti (Figura 4B).
2. Tracciamento di particelle singole: tracciamento manuale
   1. Scarica il plugin di tracciamento manuale per il software FIJI (sviluppato da Fabrice P. Cordelière) da http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
   2. Aprire il file in FIJI/ImageJ. Utilizzare l'opzione Ruota per allineare orizzontalmente le scanalature MFC.
   3. Per migliorare il rapporto segnale-rumore, se necessario, fare clic su Elabora Sottrai sfondo.
   4. Aprire il plug-in Di monitoraggio manuale. Impostare i parametri (ad esempio, dimensione in pixel, intervallo di tempo, ecc.) in base al microscopio specifico utilizzato per l'imaging. Per i risultati mostrati qui, il microscopio e l'obiettivo il rapporto era di 0,239 m/pixel e l'intervallo di fotogrammi era di 3 s.
   5. Ottenere le tracce X e Y coordinate e salvare i risultati copiando il testo nel foglio di calcolo.
   6. Analizzare i filmati a più canali facendo clic su Immagine Proprietà Color (Colore) Unisci canali per unire i canali e quindi tenere traccia solo dei puncta colocalizzati.
3. Tracciamento di particelle singole: tracciamento semiautomatico (Figura 5)
   1. Aprire il software di analisi. Questo studio ha utilizzato Bitplane Imaris software versione 8.4.1.
   2. Passa a Supera nel menu in alto.
   3. Fare clic su Elaborazione immagine . Il tempo di scambio e il valore di Ok.
   4. Fare clic su Modifica . Proprietà dell'immagine (CTRL-I) Proprietà Geometry . Voxel Size Row. Impostare le proprietà dell'immagine in base all'impostazione della microscopia utilizzata.
      NOTA: Per i dati visualizzati qui, il rapporto al microscopio e all'obiettivo era di 0,239 m/pixel.
   5. Fare clic su Tutti equidistanti e modificare l'intervallo di tempo. Ad esempio, utilizzare 3 s come intervallo. Fare clic sul pulsante Reimposta in basso a destra o fare clic su Ctrl .
   6. Aggiungere un livello di macchie in alto a sinistra facendo clic su un'icona di piccole macchie gialle. In basso a sinistra viene aperto un nuovo menu per la modifica delle macchie.
   7. Premere la freccia blu destra fino all'inizio del rilevamento spot.
      NOTA: È importante filtrare alcuni dei punti utilizzando il filtro in basso a sinistra della finestra. Controllare il filmato un paio di volte per vedere che è selezionato un numero sufficiente di punti.
   8. Verificare o configurare i parametri in base alle esigenze sperimentali. Ad esempio, Distanza massima è di 12 m (la distanza massima consentita tra due punti distinti per includerli ancora nella stessa traccia singola); Dimensione massima gap: 1 (il numero di fotogrammi che una traccia può perdere e ancora considerato una traccia).
   9. Fare clic su Impostazioni , quindi su Stile traccia , Disattivato, Punti e Sfera.
   10. Utilizzando la barra dei filtri, scegliere diversi filtri per la regolazione. Ad esempio, nei dati forniti qui, Durata traccia - 9 ha rimosso tutte le tracce con meno di 3 fotogrammi. Una volta impostati tutti i parametri, fare clic sulla freccia verde destra. Ulteriori modifiche non sono possibili dopo questo passaggio.
   11. Fare clic sulla matita piccola con punti per modificare manualmente tutte le tracce.
   12. Visualizzare il filmato (Figura 5B). Se si verifica un errore, sono disponibili diverse opzioni possibili:If an error occurs, there are several possible options:
       1. Per disconnettere una traccia, fare clic sull'opzione Oggetto e scegliere i due punti da scollegare tenendo premuto Ctrle scegliere Disconnetti.
       2. Per collegare una traccia, fare clic sull'opzione Oggetto, scegliere i due punti che devono essere collegati tenendo premuto Ctrl e scegliere Connetti.
       3. Per eliminare una traccia o un punto, con l'opzione corretta (Traccia/Oggetto), passare allo schermo con l'icona Matita regolaree scegliere Elimina.
       4. Per aggiungere macchie manualmente, passare alla schermata icona Matita regolare. Nella parte inferiore dello schermo c'è un contrassegno di monitoraggio manuale. Assicurarsi che la casella di controllo Connessione automatica sia V. Sul filmato stesso, per aggiungere un punto, tenere premuto il pulsante Maiusc e fare clic con il pulsante sinistro del mouse.
   13. Per aggiungere un punto a una traccia esistente, scegliete la traccia desiderata (gialla) e la cornice, passate alla schermata dell'icona a matita regolare e aggiungete un punto manualmente. Al termine dell'intero filmato, passare all'icona che ha l'aspetto di un grafico rosso (Statistiche). È possibile modificare i parametri analizzati in un secondo momento. Per modificare, nella parte inferiore sinistra dello schermo, premere l'icona a chiave svedese. Ad esempio: Posizione X, Posizione Y.
   14. Premere sull'icona che assomiglia a diversi dischi floppy, Esporta tutte le statistiche.
       NOTA: l'output del foglio di calcolo può essere gestito direttamente o ulteriormente analizzato utilizzando il codice pubblicato⁹ utilizzato per questa analisi, che sarà condiviso su richiesta. I seguenti parametri vengono estratti dall'analisi: Velocità, Spostamento traccia, Lunghezza corsa, Velocità (inclusa la direzionalità), Numero di stop, Durata media arresto, Alfa, Cambiamenti direzionali e Velocità istantanea. Una spiegazione dettagliata di ogni parametro è descritta in Gluska et^al.

Risultati

Seguendo il protocollo descritto, gli espiantati embrionali HB9::GFP del midollo spinale sono stati coltivati in MFC (Figura 4A). Gli espiantati sono stati coltivati per 7 giorni, quando gli assoni sono stati completamente attraversati nel vano distale. Mitotracker Deep Red e Lysotracker Coloranti rossi sono stati aggiunti ai compartimenti distale e prossimali al fine di etichettare i mitocondri e scomparti acidi (Figura ...

Discussione

In questo protocollo, descriviamo un sistema per monitorare il trasporto assonale di mitocondri e compartimenti acidi nei motoneuroni. Questa piattaforma in vitro semplificata consente un controllo preciso, il monitoraggio e la manipolazione dei compartimenti neuronali subcellulari, consentendo l'analisi sperimentale delle funzioni locali dei motoneuroni. Questo protocollo può essere utile per studiare malattie MN come la SLA, per concentrarsi sulla comprensione del meccanismo sottostante di disfunzione del trasporto as...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm Fluodish – glass bottom dish	World Precision Instruments WPI	FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish	World Precision Instruments WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera	Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)	Sigma-Aldrich	C1768	stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)	Thermo Fisher	17504044
BDNF	Alomone Labs	B-250	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm	World Precision Instruments WPI	504530	For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm	World Precision Instruments WPI	504533	For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm	World Precision Instruments WPI	504534	For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1	Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
CNTF	Alomone Labs	C-240	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN-25	stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	For epoxy mold preperation
DPBS 10X	Thermo Fisher	#14200-067	dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
Epoxy Hardener	Trias Chem S.R.L	IPE 743	For epoxy mold preperation
Epoxy Resin	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	For epoxy mold preperation
FIJI software	ImageJ
GDNF	Alomone Labs	G-240	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X	Thermo Fisher	#35050-038
HB9:GFP mice strain	Jackson Laboratories	005029
HBSS 10X	Thermo Fisher	#14185-045	Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software	Andor
Iris scissors, curved, 10 cm	AS Medizintechnik	11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm	AS Medizintechnik	11-440-09
Laminin	Sigma-Aldrich	#L-2020
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Fisher	11415064
LysoTracker Red	Thermo Fisher	L7528
Mitotracker Deep-Red FM	Thermo Fisher	M22426
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope	Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution	Biological Industries	03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	#P8638	Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW Corning Corporation	#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	T1426	stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade	F.S.T	15000-00
Yokogawa CSU X-1	Yokogawa