Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס.

Abstract

מוטוריים נוירונים (MNs) הם תאים מקוטב מאוד עם axons ארוכים מאוד. הובלה axonal היא מנגנון מכריע עבור בריאות MN, לתרום צמיחה עצבית, פיתוח, והישרדות. אנו מתארים שיטה מפורטת לשימוש בתאי מיקרו-פלואידים (mfcs) למעקב אחר העברת אקונאליות של אורגלים בעלי תווית של מוצרים בעלי מחשב בצורת סיבי MN. שיטה זו היא מהירה, זולה יחסית, ומאפשרת ניטור של רמזים תאיים בחלל ובזמן. אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול עבור: 1) ייצור של polydiמתיל siloxane (PDMS) MFCs; 2) ציפוי של הרחבות בחוט השדרה והתרבות המונתק של MN ב-MFCs; 3) הוספת תוויות לתאי המיטומטר וחומציים בעקבות הדמיון הישיר; 4) ניתוח הובלה באופן ידני וחצי אוטומטי. לבסוף, אנו להפגין הבדל בהובלה של תאים חומציים וחומצי של HB9:: gfp ובעל חוט השדרה לחקור אקסונים כהוכחה של תוקף המערכת. לגמרי, פרוטוקול זה מספק כלי יעיל ללימוד התחבורה סיבי של רכיבי סיבי שונים, כמו גם מדריך פשוט עבור שימוש MFC כדי לעזור לגלות אפשרויות ניסיוני מרחבי.

Introduction

MNs הם תאים מקוטנים מאוד עם axons ארוכים, מגיע עד מטר אחד באורך של בני אדם למבוגרים. תופעה זו יוצרת אתגר קריטי לשמירה על קישוריות ותפקוד של MN. כתוצאה מכך, MNs תלויה בהובלה תקינה של מידע, אורגלים וחומרים לאורך האקסונים מהגוף הסלולארי שלהם אל הסינפסה וחזרה. רכיבים סלולאריים שונים, כגון חלבונים, RNA ואורגלים, מדילג באופן סדיר דרך האקסונים. מיטוכונמיטויום הם אורגלים חשובים אשר מועברים באופן שגרתי ב-MNs. מיטוגרם הם חיוניים לפעילות תקינה ולתפקוד של MNs, האחראי על הוראת ATP, אגירת סידן ותהליכי איתות1,2. התחבורה האקונלית של המיטו, היא תהליך לומד היטב3,4. מעניין, פגמים בתחבורה מיטוכונדריאלי דווחו להיות מעורבים במספר מחלות ניווניות ובמיוחד במחלות MN5. התאים החומציים משמשים כדוגמה נוספת לאורגלים פנימיים הזזים לאורך MN axons. תאי חומציים כוללים ליזוזומים, אנזומים, מכשירי טרנס-גולג'י ושלפוחיות מסוימות. פגמים בתחבורה סיבי של תאים חומציים נמצאו במספר מחלות ניווניות כמו גם7, העיתונים האחרונים להדגיש את חשיבותם במחלות MN8.

כדי לחקור ביעילות את התחבורה סיבי, מיקרופלואידיג צ'יימברס המפרידים בין התאים הסומונטיים והאקאליות משמשים לעתים קרובות9,10. שני היתרונות המשמעותיים של מערכת המיקרופלואידיג, והתקשורת והבידוד של האקסונים, מעבדים אותו באופן אידיאלי ללימוד תהליכים תת-תאיים11. ניתן להשתמש בהפרדה המרחבית בין גופי התאים העצביים לבין האקסונים כדי לתמרן את סביבות החילוץ של התאים העצביים השונים (לדוגמה, אקסונים vs. סומה). , והתנוונות שהכל מהווה תועלת. מפלטפורמה זו Mfcs יכול גם לסייע ללמוד תקשורת תא לתאים על ידי הנוירונים coculturing עם סוגי תאים אחרים, כגון שרירי השלד12,13,14.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אך מדויק עבור ניטור המיטו, התחבורה תא חומצי בתוך נוירונים מוטוריים. אנו מציגים את השימוש בשיטה זו על-ידי השוואת האחוז היחסי של מארגני נסיגה וכיתות מעבר, כמו גם הפצת מהירות התחבורה.

Protocol

טיפול בבעלי חיים בפרוטוקול זה בוצע בפיקוח ובאישור הוועדה לאתיקה בעלי חיים באוניברסיטת תל אביב.

1. הכנה MFC

  1. הליהוק של PDMS בתבניות ראשיות (איור 1)
    1. לרכוש או ליצור תבניות ראשיות (וופלים) בעקבות פרוטוקול מפורט9.
    2. השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר כל סוג של לכלוך מפלטפורמת וופל לפני שתמשיך לשלב הציפוי. המשטח של הופלים צריך להיראות חלק וברור.
    3. מלא מיכל עם 50 מ ל של חנקן נוזלי. להכין מזרק 10 מ ל ו-23 מחט G.
      הערה: יש לבצע את כל ההליכים מצעד זה קדימה במכסה כימי.
    4. בכיפה הכימית, השתמשו במזרק ובמחט לבריכת 2 מ ל של חנקן נוזלי. למרות שזה נראה כמו אוויר נמשך, המזרק הוא מלא חנקן (איור 1א). מניחים את הלוחית המכילה וופל במיכל שניתן לאיטום.
    5. בורג לפתוח בקבוק כלורוטריתיל silane, לנקב את כובע גומי באמצעות מזרק חנקן ממולא, ולהזריק את כל התוכן של המזרק לתוך הבקבוק. מבלי למשוך את המחט, להפוך את הבקבוק הפוך ולצייר בחזרה 2 מ ל של כלורוטרימתיל silane.
      הערה: בגלל לחץ המזרק, כמות קטנה של כלורוטרימתילציאן מותז מתוך המחט. כדי למנוע סכנה, הצבע את המחט לכיוון הקיר הפנימי של המכסה (איור 1ב).
    6. התפשטות כלורוהטרימתיל בצורה אחידה במכולה (משלב 1.1.4), אך לא ישירות על הלוחית המכילה וופל או וופל. סגור את המיכל ואת הדגירה עבור 5 דקות לכל וופל.
      הערה: אם זו הפעם הראשונה שהופל מצופה בכלורוטריתיל, יש להתיר הדגירה של 1 h עבור כל וופל.
    7. אל תקחו את המיכל והמכולה מחוץ למכסה הכימי במשך 30 דקות.
      התראה: כלורוטרימתיתיל סילאנה הוא מאוד נדיף.
    8. שוקלים בסיס PDMS (ראה טבלת חומרים) בתוך שפופרת 50 mL ולהוסיף pdms ריפוי סוכן ביחס של 16:1 בהתאמה (למשל, 47.05 g של בסיס, 2.95 g של ריפוי הסוכן). מערבבים עבור 10 דקות באמצעות מסובבי מהירות נמוכה.
    9. יוצקים PDMS לתוך כל צלחת המכיל וופל לגובה הרצוי (איור 1ג).
      הערה: שימוש בתאי מיקרופלואידיג דקים (עד 3-4 מ"מ) משפר את הדבקות בצלחת התרבות ומונע דליפה.
    10. מניחים את כל הצלחות יחד בתוך desiccator ואקום עבור 2 h (איור 1E). תהליך זה מסיר את האוויר לכוד בתוך ה-PDMS, ובכך מסלק בועות אוויר ויוצרים עובש אחיד וברור.
    11. מניחים את הצלחות בתוך תנור במשך 3 שעות (או לילה) ב 70 ° צ' (איור 1E).
      הערה: הלוחות צריך להיות ברמה כאשר מניחים בתנור.
  2. הליהוק של PDMS בתבניות אפוקסי
    הערה: מכיוון שהכנה של וופל היא יקרה, יש צורך בציוד מיוחד, ועלולה לגרום נזק לסוגי הסיליקון השבריריים, ניתן ליצור עותקים משוכפלים של אפוקסי. העותקים המשוכפלים זולים יותר, עמידים יותר, וניתן להשתמש בהם לייצור המוני של תאי מיקרופלואידיג.
    1. להטיל ולרפא PDMS (כפי שמתואר 1.1.8-1.1.11) לתוך וופל המקורי.
    2. הסר וגזור חלקים עודפים של PDMS להשאיר רק את האלמנטים microflu, ואת האזור הפונקציונלי הנדרש לעיבוד אותם לתאי microfluidic.
    3. עטוף מיד את PDMS עם נייר עבה, דביק כדי למנוע ממנו לצבור אבק.
    4. לבחור את התרבות רקמה כיתה פלסטיק המתאים לשלם PDMS בתוך ולהשאיר מקום לאפוקסי סביבו. המרחק מ-PDMS לצלחת הפלסטיק צריך להיות פחות מ 5 מ"מ.
    5. הכן כמות קטנה של PDMS מעורב ביחס של 10:1 (בסיס: ריפוי סוכן). הנוזל הטרי PDMS ישמש כדי להדביק את PDMS מוצק על החלק התחתון של צלחת פלסטיק.
    6. החל כמות מינימלית של PDMS הנוזלי לתחתית צלחת הפלסטיק ולאחר מכן הסר את הקלטת הדביקה מ-PDMS והדבק אותו לתחתית צלחת הפלסטיק. ודא שהרכיבים המיקרופלואידים פונים כלפי מעלה.
    7. תן ל-PDMS לרפא 30 דקות בתנור של 70 ° c.
    8. הכינו את שרף האפוקסי על ידי ערבוב הבסיס וריפוי הסוכן ביחס של 100:45 בהתאמה במבחנה. שרפים אפוקסי שונים עשויים להיות יחסי ערבוב שונים. אמצעי האחסון הנדרש לצלחת 100 מילימטר רגיל הוא כ-40 mL.
    9. הוסיפו את האפוקסי לתערובת היטב במשך 10 דקות בתוך מסובבי עד שהיא הופכת להיות הומוגנית בעליל (כלומר, אין ממצאים גלויים כמו סיבים בנוזל).
    10. צנטריפוגה את תערובת אפוקסי ב 400 x g עבור 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר נתפס בתוך.
    11. במהלך הצנטריפוגה, הפיצו שכבה דקה של סיליקון שומן סביב הקירות וכל חלקי הפלסטיק החשופים האחרים בצלחת התרבות. זה ימנע את האפוקסי מן פולימריזציה עם פלסטיק הכלים ויאפשר הסרת האפוקסי הנרפא בקלות בסוף הפרוטוקול.
    12. יוצקים את האפוקסי לאט לתוך המנה עד שהוא מכסה לחלוטין את ה-PDMS ועובר מעבר לו על-ידי לפחות 5 מ"מ. מניעת היווצרות בועות בתוך האפוקסי על-ידי שמירה על מרחק של אפס בין הצינורית לצלחת. מניחים את הצלחת במקום מאובטח, כך שהוא לא יועבר עבור 48 h הבא.
    13. לאחר 48 h האפוקסי צריך להירפא לחלוטין. הכנס את הצלחת לתוך תנור מחומם ב 80 ° c עבור 3 h עבור הריפוי הסופי.
    14. הסר את אפוקסי נרפא מן הצלחת ואת העובש PDMS המקורי על ידי מושך בעדינות את קיר הפלסטיק של הצלחת עד שהוא נשבר. הדבר אמור להיות מופרד בקלות מהאפוקסי ומתקלף.
    15. לאחר שחולצו, לנגב את השומן הנותרים את העותק המשוכפל החדש האפוקסי והכניסה אותו הפוך (כלומר, עם האלמנטים microflu, המשוכפלת הפנים למעלה) לתוך צלחת תרבות חדשה. העותק המשוכפל של האפוקסי מוכן כעת ליציקה של PDMS.
    16. השתמש באוויר לחצים או N2 לפוצץ כל שרידים של pdms או לכלוך מתוך עובש אפוקסי ולשטוף אותו 2x עם איזופנול. למלא אותו בפעם השלישית, הדגירה עבור 10 דקות על צלחת שייקר מסלולית. לשטוף את העובש שוב 3x עם איזופנול ולהשליך את הנוזל הנותר. להתייבש עם אוויר או N2 או מקום בתנור 70 ° c עד יבש.
      הערה: בצע את הליכי הבטיחות בעת עבודה עם השמטה של איזופנול.
    17. השאר את צלחות העובש. סגורות עד הליהוק בצע את השלבים 1.1.8.-1.1.11.
  3. ניקוב ופיסול של PDMS לתוך MFC (איור 2)
    1. גזור והסר את תבנית PDMS מהצלחת על-ידי ביצוע הסימנים (+) על הוופלים באמצעות אזמל. אין להשתמש בכח, כאשר התבניות הן שבירות (איור 2א).
    2. בצע את ההוראות שצוירו על הסקיצה כדי להכות ולחתוך את התאים בהתאם ההתקנה ניסיוני (איור 2B-F).
      1. כדי לחקור את התרבות בחוט השדרה (איור 2ג, E), פונץ ' 2 7 מ"מ בארות בצד המרוחק של שהמכשיר הגדול. אתר את הבארות בדרך שהם יחפפו עם קצות הערוץ. בצד האבובי, פונץ ' אחד 7 מ"מ היטב באמצע הערוץ, עם חפיפה מינימלית כך ששטח מספיק יישאר עבור explants. חבוט שני חורים נוספים בשני הקצוות של התעלה האבובת. הפוך את ה-MFC עם האלמנטים המיקרופלואידים הפונים כלפי מעלה, ושימוש במחט של 20 גר', גלף שלוש מערות בהסבר קטן על הבאר המנוקב 7 מ"מ.
      2. עבור תרבות MN המונתק (איור 2D, F), אגרוף ארבע 6 מ"מ בארות בקצות שני הערוצים של MFC קטן.
  4. עיקור הMFC לשימוש בתרבית רקמות
    1. התפשט 50 ס מ להקות דביק לאורך הספסל. לחץ ומשוך בחזרה את התא כדי להתמודד עם הסרט הדביק (העליון והתחתון הפנים) ולהסיר לכלוך גולמי. מניחים את התאים הנקיים בצלחת חדשה של 15 ס מ.
      הערה: אל תלחצו ישירות על האלמנטים המיקרופלואידים כאשר אלה פונים כלפי מעלה.
    2. דגירה התאים בכיתה אנליטית 70% אתנול עבור 10 דקות על שייקר מסלולית.
    3. היפטר מאתנול וייבש את התאים במכסה של תרבות הרקמה או בתנור ב-70 ° c.
  5. הצבת הMFC על צלחת תחתית זכוכית
    1. מניחים את החדר במרכז של תרבות רקמת כיתה 35 mm/50 מ"מ זכוכית מאכל ולהחיל כוח מינורי על הקצוות כדי להפוך את PDMS ו התחתון צלחת לאגד. כדי למנוע שבירת תחתית הזכוכית, תמיד להחיל כוח על גבי משטח מוצק.
    2. דגירה 10 דקות ב 70 ° c. לחצו על התאים כדי לחזק את הדבקות בצלחת.
    3. דגירה תחת אור UV עבור 10 דקות.
  6. ציפוי ותפירה
    1. הוסף 1.5 ng/mL פולי-L-אורתך (אש ף) לשני התאים. ודא כי אש ף פועלת דרך הערוצים על ידי ליטוף מדיית הציפוי כמה פעמים ישירות בכניסה לערוץ.
    2. בחנו את החדר המיקרופלואידיג תחת מיקרוסקופ קל עם הגדלה של 10x כדי לבדוק את הנוכחות של בועות אוויר. אם בועות האוויר חוסמים את המיקרוחריצים, מניחים את ה-MFC ב-desiccator ואקום עבור 2 דקות. מאוחר יותר, להסיר את האוויר העודף שנתפסו בערוצים על ידי ליטוף את מדיית הציפוי דרכם. . מכאן בלילה
    3. החליפו את אש ף באמצעות למינציה (3 μg/mL ב-DDW) לדגירה של לילה באותו אופן.
    4. לפני הציפוי, לשטוף את הלמינציה עם מדיום התרבות העצבית.

2. ציפוי התרבות העצבי

  1. תרבות תא מנוע
    1. באמצעות מספריים ישרים מלקחיים עדינים, מנתח חוט השדרה מתוך E 12.5 ICR-HB9:: העובר העכבר GFP. עבודה בפתרון HBSS 1X עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (איור 3A-C).
    2. שימוש במספריים לחיתוך והסרת קרומי הקרום והקרניים (איור 3ד).
    3. לאסוף את חתיכות חוט השדרה ולהעביר לצינור(#1) עם 1 ML HBSS + 1% P/S.
    4. חותכים את חוטי השדרה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מעוקלים ולחכות פיסות להתיישב.
    5. הוסף 10 μL של טריפסין 2.5% והמקום באמבט מים של 37 ° c במשך 10 דקות. לאחר 5 דקות, לערבב על ידי הקשה על השפופרת. החלקים צריכים ליצור. גוש כמו סליל
    6. העבר את הגוש לתוך צינור חדש(#2) המכיל 800 μl של prewarmed l-15, 100 ΜL של bsa 4%, ו 100 μl של 10 מ"ג/ML DNase. לטחון 2x, ולאחר מכן להמתין 2 דקות כדי לאפשר לחלקים בלתי מנוכה להתיישב. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש(#3).
    7. הוסף 100 μL של BSA 4%, 20 μL של 10 מ"ג/mL DNase, ו 900 μL של מדיום מלאה neurobasal סיס (CNB, ראה טבלת חומרים ושולחן 1). לטחון 8x ולחכות 2 דקות. לאסוף סופרנטאנט כדי צינור #3.
    8. חזור על השלב 2.1.7 ולטחון 10x. . תאסוף את ה#3מצינור הקירור יש להשאיר כמות קטנה של רקמה בתחתית הצינור.
      הערה: אם גוש גדול עדיין נשאר בתחתית הצינור #2, חזור על שלב 2.1.8.
    9. הוסף 1 מ"ל של BSA 4% כרית לתחתית #3הצינור.
    10. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
    11. להשעות מחדש את הגלולה על ידי הקשה בעדינות על השפופרת, ולאחר מכן להוסיף 1 mL של מדיום CNB. פיפטה 6x ולהוסיף 20 μL של 10 מ"ג/mL DNase.
    12. תוספת עם תוספת של 5 מ ל של CNB בינונית והעברה 3 מ ל לצינור חדש(#4).
    13. הוסף 1 מ ל של 10.4% בינונית של צפיפות מעבר הצבע (ראה טבלה 2) לתחתית כל צינורית(#3 ו#4). הפרדת פאזה חדה בין שני הממשקים אמורה להופיע.
    14. צנטריפוגה ב 775 x g עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יש להגדיר את האטה הצנטריפוגה ברמה נמוכה כדי למנוע פירוק של הפרדת הפאזה.
    15. תאים אמורים להיות צפים, המופיעים כשלב מעונן בין המדיה. לאסוף את התאים משני הצינורות לתוך צינור חדש(#5) כבר מכיל prewarmed 1 ML cnb מדיום.
    16. הוסף תוספת של 4-6 mL של מדיום CNB.
    17. הוסף 1 מ ל של BSA 4% כרית לתחתית הצינור.
    18. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב RT. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה בעדינות עם 1 מ ל של cnb בינונית.
    19. . תספור את התאים תשואה של 0.75-1 x 106 MN לחוט השדרה צפוי.
      הערה: חוט השדרה הגחוני מכיל גם תת עצבי אחרים מלבד נוירונים מוטוריים (למשל, interneurons). טוהר MN תלוי בעיקר על הסרת האזורים האלה במהלך הניתוח והיכולת להגיע לאזורים rostral מועשר. כדי להבטיח את הנוירונים התמונה הם MNs, השימוש במתח של עכברים עם סמן מסוג MN אנדוגניים, כגון HB9:: עכברים GFP, מומלץ. כדי להשיג תרבות MN טהורה (אך עם תפוקת התאים ירד), השימוש ב-FACS טיהור15 אפשרי.
    20. תרבות MN המונתק ב-MFC
      1. להתרכז 150,000 MNs לכל חדר על ידי תפרידו ב 400 x g עבור 5 דקות.
      2. מזף את הסופרנטאנט ומחדש בעדינות את התאים במדיום נוירובסיס עשיר (RNB) ב -4 μL לכל MFC. RNB הוא CNB עם תוספת 2% B27 ו 25 ng/mL BDNF.
      3. הסר את המדיום משני התאים, השארת נפח נמוך שווה ערך ל ~ 10 μL בבארות של התא המרוחק. היא מופיעה כטבעת דקה. של בינונית במתחם הבאר
      4. טען לאט את 4 μL של תאים לתוך הערוץ. להוציא 4 μL של הבאר בצד השני של הערוץ, ולטעון אותם לאט בחזרה ישירות לתוך הערוץ כדי להפוך את הזרימה הנוכחית למקסם את צפיפות התא בערוץ.
      5. ודא כי התאים נכנסו לערוץ באמצעות מיקרוסקופ אור 10x ומניחים את התא בחממה עבור 30 דקות ללא הוספת מדיה נוספת.
      6. לאט להוסיף ~ 10-15 μL של RNB לתוך הבית הנמצא והמרוחק ולמקם את התאים בחממה לעוד 15 דקות.
      7. בעקבות דגירה זו, לאט להוסיף ~ 75-80 μL של RNB לתוך כל טוב.
    21. תחזוקת תרבות MN
      1. יום אחד לאחר ציפוי (DIV1), להחליף בינוני עם rnb שיושלם עם 1 μm ציטוסינוס הערנוסייד (Ara-C) כדי לעכב את הצמיחה גליה.
      2. יומיים לאחר היישום Ara-C (DIV3) להחליף בינוני עם מדיום חדש CNB בתוך התא האבובי (ללא Ara-C).
      3. על מנת לשפר את המעבר של אקסונים דרך מיקרוחריצים, להחיל rnb בתוספת 25 ng/ml של התאים גליה נגזר neurotrophic פקטור (gdnf) ו -25 ng/ml של המוח נגזר neurotrophic פקטור (bdnf) רק אל התא המרוחק. שמור על הדרגה של עוצמת הצבע של לפחות 10 μL לכל היותר בין הבארות (נפח גבוה יותר) והבארות האבובית.
      4. . תרענן את המדיום כל יומיים זה יכול לקחת את אקסונים עד 4-6 ימים כדי לחצות distally.
  2. תרבות של חוט השדרה
    1. באמצעות מספריים ישרים מלקחיים עדינים, מנתח חוט השדרה מתוך E 12.5 ICR-HB9:: העובר העכבר GFP. עבודה בפתרון HBSS 1X עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (איור 3A-C).
    2. שימוש במספריים לחיתוך והסרת קרומי הקרום והקרניים (איור 3ד).
    3. חותכים את חוט השדרה לתוך 1 מ"מ עובי רוחבי מקטעים (איור 3E). היפטר מכל המדיום מהתא החלק היותר של ה-MFC.
    4. להרים את חוט השדרה בודד לחקור עם פיפטה בנפח כולל של 4 μL. הכנס את ההסבר קרוב ככל האפשר למערה ולמשוך את כל נוזל מוגזם מן הבית הקרוב ביותר דרך השקעים לרוחב (1 מ"מ אגרופים). האקכורים צריכים להישאב. לתוך התעלה האבובה
    5. לאט להוסיף 150 μL של חוט השדרה לחקור בינונית (SCEX, ראה טבלה של חומרים ושולחן 3) לבאר האבותית.
    6. חוט שדרה לחקור את תחזוקת התרבות
      1. הוסף מדיום SCEX בתא האבובי, ועשיר SCEX בינונית (SCEX עם 50 ng/mL של BDNF ו GDNF) בתא המרוחק. שמור על הדרגה של עוצמת הצבע של לפחות 15 μL לכל היותר בין הבארות (נפח גבוה יותר) ואת הבאר האבובית.
      2. . תרענן את המדיום כל יומיים זה יכול לקחת את אקסונים עד 3-5 ימים כדי לחצות distally.

3.הובלהאקונלית (איור 4א)

  1. הוספת תוויות לתאי המיטובית וחומציים
    1. להכין בינונית SCEX טרי (או CNB עבור הנתק MN) המכיל 100 nM מיטואומעקב האדום בעומק FM ו 100 ננומטר LysoTracker אדום. מודטה עבור 30-60 דקות ב 37 ° c. צבעים אחרים ניתן להשתמש כל עוד fluorophores להם לא חופפים.
    2. שטוף 3x עם מדיום CNB/SCEX חם. . הצלחות מוכנות להדמיה
  2. הדמיה חיה
    1. לרכוש 100 זמן לפקיעה תמונה סדרה של הובלה סיבי במרווחי זמן של 3, עם סך של 5 דקות לכל סרט.
      הערה: מערכת הדמיה המשמשת במחקר זה כללה מיקרוסקופ הפוך מצויד בחיבור הדיסק מסתובב, נשלט באמצעות תוכנה ההגינות הדמיה תא, 60x עדשה שמן, NA = 1.4, ו מצלמת EMCCD. סרטים נרכשו בסביבה מבוקרת ב 37 ° c ו 5% CO2.
      הערה: ניתן לבצע דימות של סרטים ארוכים או קצרים יותר בזמן, בהתאם לניסוי. במקרה הצורך, ניתן להקליט גם סרטי לילה. עם זאת, חיוני לנסות להקטין את זמן החשיפה ואת כוח הלייזר, כמו גם את מספר התמונות הכוללות, כדי להקטין את הרעילות והלבנה במהלך רכישת הסרט.

4. ניתוח תמונה (דמויות 4-5)

  1. ניתוח הפצת ודחיסות של תעבורת חלקיקים באמצעות ניתוח kymograph
    1. פתח את הקובץ בפיג. ערוצים נפרדים הקשה על התמונה | ערימות | כלים | . הוראות הביטול
    2. הגדרת מאפייני תמונה על-ידי הקשה על תמונה | . מאפייניםכאלה
    3. בחרו בכלי קו מקוטע בלחיצה ימנית על סמל הקו. הגדר את רוחב ל 8-10 על-ידי לחיצה כפולה על סמל הקו. הקפד על עקביות באותו רוחב קו בכל הניתוח.
    4. סמן קו מקוטע אחרי נתיב האקסון מהמרוחק עד הבית. לחץ פעמיים כדי לעצור את סימון הקו.
    5. לחץ על t כדי להוסיף אזור שורה חדש של ריבית (roi) למנהל הroi. הוסף זאת לטבלת ניתוח גיליון אלקטרוני.
    6. לחץ על m כדי למדוד את האזור ואת אורך האקסון. הוסף את זה לטבלת הניתוח.
    7. צור kymograph על ידי לחיצה על תוספים | קימובוקס | . שלפו את קומו לחילופין, ניתן להשתמש בתוספים אחרים בייצור kymograph.
    8. ספירה ידנית של הזזה (נסיגה או כיתה) וחלקיקים שאינם נעים והוספתם לטבלה בעמודה הנכונה.
      הערה: החלקיקים מסווגים כדרך מעבר (כלומר, מעבר שמאלה ב-kymograph) או בנסיגה (כלומר, תנועה מימין) אם העקירה שלהם גבוהה מ-10 יקרומטר בכיוון הספציפי. ניתן למדוד את העקירה פשוט על ידי סימון קו אופקי עם סמל הקו ולחיצה על m. חלקיקי מנוע או אלה שאינם עומדים בקריטריוני העקירה מוגדרים כאינם מעבירים (איור 4ב').
  2. מעקב אחר חלקיק בודד: מעקב ידני
    1. הורד את תוסף המעקב הידני עבור תוכנת פיג'י (שפותחה על ידי Fabrice P. Cordelière) מ http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. פתח את הקובץ ב- פיג'י/ImageJ. השתמש באפשרות ' סיבוב ' כדי ליישר את החריצים של MFC באופן אופקי.
    3. כדי לשפר את היחס בין אות לרעש במידת הצורך, לחץ על תהליך | הפחת רקע.
    4. פתח את תוסף המעקב הידני . קבעו את הפרמטרים (לדוגמה, גודל הפיקסל, מרווח זמן וכו ') בהתאם למיקרוסקופ הספציפי המשמש לדימות. עבור התוצאות המוצגות כאן, המיקרוסקופ והעדשה היחס היה 0.239 μm/פיקסל ומרווח המסגרת היה 3 s.
    5. השג את הרצועות X ו-Y קואורדינטות ושמור את התוצאות על-ידי העתקת הטקסט לגיליון אלקטרוני.
    6. ניתוח סרטים מרובי ערוצים על-ידי לחיצה על תמונה | צבע | מזג ערוצים כדי למזג את הערוצים ולאחר מכן עקוב אחר מקומי בלבד.
  3. מעקב אחר חלקיקים בודדים: מעקב חצי אוטומטי (איור 5)
    1. פתח את תוכנת הניתוח. מחקר זה השתמש בגירסת התוכנה Bitplane טוס Imaris אריס 8.4.1.
    2. עבור לעלות למעלה בתפריט העליון.
    3. לחץ על עיבוד תמונה | החלף זמן ו Z | . אנימבין.
    4. לחץ על עריכה | מאפייני תמונה (Ctrl + I) | גאומטריה | שורה בגודל voxel. הגדרת מאפייני תמונה בהתאם לכיוונון המיקרוסקופיה שבשימוש.
      הערה: עבור הנתונים המוצגים כאן, המיקרוסקופ ויחס העדשה היה 0.239 μm/פיקסל.
    5. לחץ על כל Equidistant ושנה את מרווח הזמן. לדוגמה, השתמש ב-3 s כמרווח. לחץ על לחצן האיפוס בתחתית הימנית או לחץ על Ctrl + B.
    6. הוסף שכבת כתמים בחלק העליון שמאלה על-ידי לחיצה על סמל של כתמים צהובים קטנים. בתחתית השמאלית נפתח תפריט חדש לעריכת הנקודות .
    7. לחץ על החץ הכחול הימני עד להתחלת זיהוי הספוט.
      הערה: חשוב לסנן חלק מהנקודות המשתמשות במסנן שבצד השמאלי התחתון של החלון. בדוק את הסרט כמה פעמים כדי לראות שנבחר מספר נקודות מספיק.
    8. ודא או קבע את תצורת הפרמטרים כך שיתאימו לצרכים הניסיוניים. לדוגמה, Max מרחק = 12 יקרומטר (המרחק המקסימלי המותר בין שני כתמים שונים כדי לכלול עדיין אותם באותו רצועה אחת); גודל הרווח המירבי = 1 (מספר המסגרות שמסלול מורשה להחמיץ ועדיין נחשב לרצועה אחת).
    9. לחץ על הגדרות ולאחר מכן מעקב אחר סגנון = כבוי, נקודות = כדור.
    10. בעזרת סרגל הסינון, בחרו מסננים שונים להתאמה. לדוגמה, בנתונים שסופקו כאן, מעקב אחר משך זמן = 9 הסיר את כל הרצועות בפחות מ-3 מסגרות. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, לחץ על החץ הירוק הימני. עריכה נוספת אינה אפשרית לאחר שלב זה.
    11. לחץ על עיפרון קטן עם נקודות כדי לערוך באופן ידני את כל הרצועות.
    12. הצג את הסרט (איור 5ב). אם מתרחשת שגיאה, קיימות מספר אפשרויות אפשריות:
      1. כדי לנתק רצועה, לחץ על אפשרות האובייקט ובחר את שני המקומות שיש לנתק בהם החזקת Ctrl, ובחר באפשרות ' התנתק'.
      2. לחיבור רצועה, לחצו על האפשרות ' אובייקט ', בחרו בשני המקומות הנחוצים לחיבור Ctrl ובחרו ' התחבר'.
      3. כדי למחוק רצועה או נקודה, באמצעות האפשרות המתאימה (מעקב/אובייקט), עבור למסך באמצעות סמל העיפרון הרגילובחר ' מחק'.
      4. כדי להוסיף מקומות באופן ידני, עבור למסך סמל העיפרון הרגיל. בתחתית המסך יש סימן מעקב ידני. ודא שתיבת הסימון התחבר אוטומטית היא V. בסרט עצמו, כדי להוסיף נקודה, החזק את לחצן Shift ולחץ לחיצה שמאלה.
    13. כדי להוסיף נקודה לרצועה קיימת, בחר את הרצועה הרצויה (צהוב) ומסגרת, עבור למסך התצוגה הרגיל של סמל העיפרון והוסף נקודה באופן ידני. עם סיום הסרט כולו, עבור לסמל שנראה כמו גרף אדום (סטטיסטיקה). ניתן לערוך את הפרמטרים שנותחו מאוחר יותר. כדי לערוך, בחלק הימני התחתון של המסך, לחץ על סמל המפתח השוודי. לדוגמה: מיקום X, מיקום Y.
    14. לחץ על הסמל שנראה כמו מספר תקליטונים, יצא את כל הסטטיסטיקות.
      הערה: ניתן לטפל בפלט הגיליון האלקטרוני באופן ישיר או מנותח נוסף באמצעות הקוד9 המשמש לניתוח זה, שישותף לפי דרישה. הפרמטרים הבאים מופקים מהניתוח: מהירות, מעקב אחר הזחה, אורך הפעלה, מהירות (כולל כיווניות), הספירה לעצור, משך עצירה ממוצעת, אלפא, שינויי כיוון ומהירות מיידית. הסבר מפורט על כל פרמטר מתואר בגלאוסקה ואח '9.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המתואר, עכבר עובריים HB9:: GFP בחוט השדרה האקסוצמחים היו מתורבתים ב-MFC (איור 4א). , האקסוצמחים גדלו במשך 7 ימים. כשהאקטונים הצטלבו לתוך התא המרוחק Mitotracker עמוק אדום ו Lysotracker צבעים אדום נוספו לתאי הבית הרחוק ביותר כדי לתייג את המיטוa ו חומצ...

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת כדי לעקוב אחר התחבורה סיבי של תאי המיטויונים ו חומצי ב נוירונים מוטוריים. זה פשוט בפלטפורמת מבחנה מאפשר שליטה מדויקת, ניטור, ומניפולציה של תאים עצביים תת-תאית, המאפשר ניתוח ניסיוני של התפקוד המקומי בתאי עצב. פרוטוקול זה יכול להועיל ללימוד מחלות MN כגון ALS, כדי ל...

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הישראלית (קרן, 561/11) ומועצת המחקר האירופית (ERC, 309377).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD cameraAndor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)Sigma-AldrichC1768stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-250Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mmWorld Precision Instruments WPI504530For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mmWorld Precision Instruments WPI504533For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mmWorld Precision Instruments WPI504534For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v in ddw
ChlorotrimetylsilaneSigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreasSigma-AldrichDN-25stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone greaseSigma-AldrichZ273554-1EAFor epoxy mold preperation
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mmF.S.T1125520
Epoxy HardenerTrias Chem S.R.LIPE 743For epoxy mold preperation
Epoxy ResinTrias Chem S.R.LRP 026UVFor epoxy mold preperation
FIJI softwareImageJ
GDNFAlomone LabsG-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP mice strainJackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-045Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ softwareAndor
Iris scissors, curved, 10 cmAS Medizintechnik11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Neurobasal mediumThermo Fisher21103049
Nikon Eclipse Ti micorscopeNikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) SolutionBiological Industries03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW Corning Corporation#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreasSigma-AldrichT1426stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm bladeF.S.T15000-00
Yokogawa CSU X-1Yokogawa

References

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159explants

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved