Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Aksonal taşıma motor nöron sağlığı için çok önemli bir mekanizmadır. Bu protokolde mikroakışkan odacıklar kullanılarak motor nöron aksonlarında asidik bölmelerin ve mitokondrinin aksonal naklinin izlenmesi için ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz.

Özet

Motor nöronlar (MNs) çok uzun aksonlar ile yüksek polarize hücrelerdir. Aksonal ulaşım MN sağlığı için önemli bir mekanizmadır, nöronal büyüme katkıda, gelişme, ve sağkalım. MN aksonları floresan etiketli organellerin aksonal naklini izlemek için mikroakışkan odaların (MFCs) kullanımı için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem hızlı, nispeten ucuz, ve uzay ve zaman hücre içi ipuçları izlenmesi için izin verir. Biz için adım protokolü bir adım açıklar: 1) Polidimethylsiloxane imalatı (PDMS) MFCs; 2) MCD'lerde ventral omurilik eksplandisi ve MN ayrıştırılmış kültürün kaplaması; 3) Mitokondri ve asidik bölmelerin etiketlenmesi ve ardından canlı konfokal hayal; 4) Manuel ve yarı otomatik aksonal taşıma analizi. Son olarak, sistem geçerliliğinin bir kanıtı olarak MITOKONDRİ ve HB9 asidik bölmelerinin taşınmasında bir fark gösteriyoruz::GFP ventral omurilik ekstrkül aksonları. Bu protokol, çeşitli aksonal bileşenlerin aksonal taşımasını incelemek için etkili bir araç ve mekansal deneysel olasılıkları keşfetmeye yardımcı olmak için MFC kullanımı için basitleştirilmiş bir kılavuz sağlar.

Giriş

MN'ler uzun aksonlarla yüksek oranda polarize hücrelerdir ve yetişkin insanlarda bir metreye kadar uzundur. Bu fenomen, MN bağlantısının ve işlevinin sürdürülmesi için kritik bir sorun yaratır. Sonuç olarak, MN'ler aksonlar boyunca bilgi, organel ve malzemelerin hücre gövdesinden sinapsa ve sırta doğru şekilde taşınmasına bağlıdır. Proteinler, RNA ve organeller gibi çeşitli hücresel bileşenler aksonlar aracılığıyla düzenli olarak mekiklenir. Mitokondri rutin MNs taşınır önemli organeller vardır. Mitokondri UYGUN aktivite ve MNs fonksiyonu için gerekli olan, ATP sağlanması sorumlu, kalsiyum tamponlama, ve sinyalizasyon süreçleri1,2. Mitokondri aksonal taşıma iyi çalışılmış bir süreçtir3,4. İlginçtir, mitokondriyal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarve özellikle MN hastalıklarında dahil olduğubildirilmiştir 5. Asidik bölmeler MN akson boyunca hareket içsel organeller için başka bir örnek olarak hizmet vermektedir. Asidik bölmeler arasında izozomlar, endozomlar, trans-Golgi cihazları ve bazı salgı vezikülleri6bulunmaktadır. Asidik kompartmanların aksonal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda da bulundu7, ve son kağıtları MN hastalıklarında önemini vurgulamak8.

Aksonal taşımayı verimli bir şekilde incelemek için somatik ve aksonal bölmeleri birbirinden ayıran mikroakışkan bölmeler 9,10sıklıklakullanılmaktadır. Mikroakışkan sistemin iki önemli avantajı ve aksonları bölme ve izolasyon, hücre altı süreçlerin çalışması için ideal hale11. Nöronal hücre organları ve aksonları arasındaki mekansal ayrım, farklı nöronal bölmelerin hücre dışı ortamlarını (örn. aksonların soma'ya karşı) manipüle etmek için kullanılabilir. Biyokimyasal, nöronal büyüme/ dejenerasyon ve immünofloresan tsays tüm bu platformdan yarar. MFCs da diğer hücre tipleri ile nöronların koculturing hücre-hücre iletişimi çalışmalarında yardımcı olabilir, iskelet kasları gibi12,13,14.

Burada, motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartman naklinin izlenmesi için basit ama kesin bir protokol uyguluyoruz. Ayrıca retrograd ve anterograd hareketli organellerin göreceli yüzdesini ve taşıma hızının dağılımını karşılaştırarak bu yöntemin kullanımını da gösteriyoruz.

Protokol

Bu protokolde hayvanların bakımı ve tedavisi Tel Aviv Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi'nin gözetimi ve onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. MFC hazırlığı

  1. Primer kalıplarda PDMS döküm (Şekil 1)
    1. Ayrıntılı bir protokol9'utakiben birincil kalıpları (gofretler) satın alın veya oluşturun.
    2. Kaplama adımına geçmeden önce gofret platformundan her türlü kiri temizlemek için basınçlı hava kullanın. Gofretlerin yüzeyi pürüzsüz ve berrak görünmelidir.
    3. Bir kabı 50 mL sıvı nitrojenle doldurun. 10 mL şırınga ve 23 G iğne hazırlayın.
      NOT: Bu adımdaki tüm işlemler kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.
    4. Kimyasal başlık, sıvı azot 2 mL havuz için şırınga ve iğne kullanın. Hava çekilmiş gibi görünse de, şırınga azot la doldurulur (Şekil 1A). Gofret içeren plakayı sızdırmaz bir kapta yerleştirin.
    5. Bir klorotrimethylsilane şişesini vidalayın, azot dolu şırıngayı kullanarak kauçuk kapağı delin ve şırınganın tüm içeriğini şişeye enjekte edin. İğneyi çekmeden şişeyi ters çevirin ve 2 mL klorotrimethylsilane çekin.
      NOT: Şırınga basıncı nedeniyle iğneden az miktarda klorotrimethylsilane püskürtülür. Bir tehlikeyi önlemek için, iğneyi kaputun iç duvarına doğru çevirin (Şekil 1B).
    6. Spread klorotrimethylsilane düzgün konteyner (adım 1.1.4), ama doğrudan gofret veya gofret içeren plaka üzerinde. Kabı kapatın ve gofret başına 5 dk kuluçkaya yatın.
      NOT: Gofret ilk kez klorotrimethylsilane ile kaplanmışsa, her gofret için 1 saat kuluçkaya izin verilmelidir.
    7. 30 dakika boyunca kimyasal başlık dışarı gofret ve konteyner almayın.
      DİkKAT: Klorotrimethylsilane son derece uçucudur.
    8. PDMS tabanını (Bkz. Malzeme Tablosu)50 mL'lik bir tüpte tartın ve sırasıyla 16:1 oranında PDMS kür leme maddesi ekleyin (örn. 47,05 g taban ve 2,95 g kürleme maddesi). Düşük hızlı bir rotatör kullanarak 10 dakika karıştırın.
    9. İstenilen yüksekliğe kadar her gofret içeren plakaya PDMS dökün(Şekil 1C).
      NOT: İnce mikroakışkan bölmelerin (3-4 mm'ye kadar) kullanılması kültür kabına yapışmayı artırır ve sızıntıyı önler.
    10. Tüm plakaları 2 saat boyunca bir vakum kurutucusu içine yerleştirin (Şekil 1E). Bu işlem PDMS içinde sıkışıp hava kaldırır, böylece hava kabarcıkları ortadan kaldırarak ve net, düzgün bir kalıp oluşturan.
    11. Plakaları 70 °C'de(Şekil 1E)3 saat (veya bir gece) fırının içine yerleştirin.
      NOT: Fırına yerleştirildiğinde tabaklar düz olmalıdır.
  2. EPOKSI kalıplarda PDMS döküm
    NOT: Gofret hazırlama pahalı olduğundan, özel ekipman gerektirir ve kırılgan gofret zarar verebilir, gofret epoksi kopyaları oluşturmak mümkündür. Kopyaları daha ucuz, daha dayanıklı, ve mikroakışkan odaların seri üretimi için kullanılabilir.
    1. Orijinal gofrete PDMS 'yi (1.1.8-1.11'de açıklandığı gibi) dökme ve tedavi.
    2. PDMS'nin fazla parçalarını çıkarın ve kesin olarak sadece mikroakışkan elemanlar ve bunları mikroakışkan bölmelere işlemek için gereken işlevsel alanı bırakarak.
    3. Toz birikmesini önlemek için PDMS'yi hemen kalın ve yapışkan bantla sarın.
    4. Tüm PDMS içinde uygun ve çevresinde epoksi için oda bırakmak bir doku kültürü sınıf plastik çanak seçin. PDMS'den plastik tabağa olan uzaklık 5 mm'den az olmalıdır.
    5. 10:1 (baz:kür leme aracısı) oranında karışık pdms küçük bir miktar hazırlayın. Taze sıvı PDMS plastik plakanın altına katı PDMS yapıştırmak için kullanılacaktır.
    6. Sıvı PDMS'nin en az miktarını plastik plakanın orta altına uygulayın ve ardından yapışkan bandı PDMS'den çıkarın ve plastik çanak dibine yapıştırın. Mikroakışkan elemanların yukarı yassı olduğundan emin olun.
    7. PDMS 70 °C fırında 30 dakika kür sağlar.
    8. Bir test tüpünde sırasıyla 100:45 oranında baz ve kür ajan karıştırarak epoksi reçine hazırlayın. Farklı epoksi reçinelerin farklı karıştırma oranları olabilir. Normal 100 mm plaka için gerekli hacim yaklaşık 40 mL'dir.
    9. Karışım gözle görülür homojen hale gelene kadar epoksi 10 dakika boyunca bir rotator da iyice karıştırın (yani, sıvı hiçbir görünür lif benzeri eserler vardır).
    10. Epoksi karışımı 400 x g'de 5 dk'da santrifüj edin ve içinde yakalanan hava kabarcıklarını temizleyin.
    11. Santrifüj sırasında, duvarlar ve kültür çanak diğer tüm maruz plastik parçaları etrafında silikon gres ince bir tabaka yayıldı. Bu, epoksinin çanak plastikle polimerleşmesini önler ve protokolün sonunda kürlenmiş epoksinin kolayca çıkarılmasını sağlar.
    12. Epoksi'yi pdms'yi tamamen kaplayana kadar yavaşça tabağa dökün ve en az 5 mm. Tüp ile plaka arasında sıfır mesafe tutarak epoksi içinde kabarcıkoluşumunu önleyin. Sonraki 48 saat boyunca hareket etmeyecek şekilde plakayı güvenli bir yere yerleştirin.
    13. 48 saat sonra epoksi tamamen tedavi edilmelidir. Plakayı 80 °C'de önceden ısıtılmış fırına, son küriçin 3 saat eve yerleştirin.
    14. Tabaktan kürlenmiş epoksiyi ve orijinal PDMS kalıbını, tabağın plastik duvarını kırılana kadar hafifçe çekerek çıkarın. Daha sonra kolayca epoksi ayrı ve soyma gerekir.
    15. Bir kez ayıklanır, yeni epoksi çoğaltma kapalı kalan gres silin ve baş aşağı (yani, çoğaltılmış mikroakışkan elemanları yukarı bakan) yeni bir kültür çanak içine inset. Epoksi çoğaltma şimdi PDMS döküm için hazırdır.
    16. Epoksi kalıp tan ipini pdms veya kirden arındırmak için basınçlı hava veya N2 kullanın ve izopropanol ile 2x durulayın. Üçüncü kez doldurun ve bir orbital shaker plaka üzerinde 10 dakika kuluçka. Kalıbı tekrar 3x izopropanol ile durula ve kalan sıvıyı atın. Hava veya N2 ile kuru üfle veya kuruyana kadar 70 °C'lik bir fırına koyun.
      NOT: İzopropanol ile çalışırken ve atılırken güvenlik prosedürlerini uygulayın.
    17. Döküm kadar kalıp plakaları kapalı tutun. 1.1.8.-1.1.11 adımlarını izleyin.
  3. PDMS'yi bir MFC'ye delme ve şekillendirme (Şekil 2)
    1. Neşterler üzerindeki (+) işaretleri izleyerek PDMS kalıbını kesip plakadan çıkarın. Kalıplar kırılgan olduğu için kuvvet kullanmayın (Şekil 2A).
    2. Deneme düzenine bağlı olarak odaları delmek ve kesmek için krokiüzerinde çizilen talimatları izleyin(Şekil 2B-F).
      1. Omurilik eksplant kültürü için(Şekil 2C,E),büyük bir MFC distal tarafında iki 7 mm kuyu yumruk. Kuyuları kanal kenarlarıyla çakışacak şekilde bulun. Proksimal tarafta, kanalın ortasında bir 7 mm iyi yumruk, en az çakışma ile böylece ekseksiçin yeterli alan bırakılacaktır. Proksimal kanalın iki kenarına iki ek 1 mm delik delin. MFC'yi mikroakışkan elemanlar yukarı bakacak şekilde çevirin ve 20 G'lik bir iğne kullanarak, delikli 7 mm kuyuya üç küçük ekstrbitki mağarası kazıyın.
      2. Ayrıştırılmış MN kültürü(Şekil 2D,F),küçük bir MFC'nin iki kanalının kenarlarına dört 6 mm kuyu yumrukla.
  4. Doku kültürü kullanımı için MFC sterilizasyonu
    1. Bankta 50 cm uzunluğunda yapışkan bantlar yayın. Yapışkan bantla (hem üst hem de alt yüzler) yüzleşmek ve ham kiri temizlemek için odayı bastırın ve geri çekin. Temiz odaları yeni bir 15 cm plakaya yerleştirin.
      NOT: Mikroakışkan elemanlara yukarı doğru doğru bastırmayın.
    2. Bir orbital shaker üzerinde 10 dakika için analitik sınıf% 70 etanol odalarını kuluçka.
    3. Etanol atın ve bir doku kültür başlık veya 70 °C'de bir fırında odaları kuru.
  5. MFC'yi cam bir alt çanağa yerleştirme
    1. Bir doku kültürü sınıf 35 mm/50 mm cam alt çanak ortasında oda yerleştirin ve PDMS ve çanak alt bağlamak yapmak için kenarlarına küçük kuvvet uygulayın. Cam ın dibini kırmamak için, her zaman katı bir yüzeyin üzerine kuvvet uygulayın.
    2. 70 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın. Plakaya bağlılığı güçlendirmek için odaları basın.
    3. 10 dakika UV ışığı altında kuluçka.
  6. Kaplama ve kültür
    1. Her iki bölmeye de 1,5 ng/mL poli-L-ornitin (PLO) ekleyin. FKÖ'nün kaplama ortamını doğrudan kanal girişine birkaç kez borulandırarak kanallar arasında koştuğundan emin olun.
    2. Hava kabarcıklarının varlığını kontrol etmek için 10x büyütme ile bir ışık mikroskobu altında mikroakışkan oda inceleyin. Hava kabarcıkları mikroolukları engelliyorsa, MFC'yi 2 dakika boyunca bir vakum kurutucuya yerleştirin. Daha sonra, kaplama ortamını boruile tutarak kanallarda yakalanan fazla havayı çıkarın. Bir gecede kuluçkaya yat.
    3. Aynı şekilde gece kuluçka için FKÖ'yü laminin (DDW'de 3 μg/mL) değiştirin.
    4. Kaplamadan önce laminini nöronal kültür ortamıyla yıkayın.

2. Nöronal kültür kaplama

  1. Ayrıştırılmış motor nöron kültürü
    1. Düz makas ve ince forceps kullanarak, bir E12.5 ICR-HB9 bir omurilik kesip::GFP fare embriyosu. %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile 1X HBSS çözeltisinde çalışın (Şekil 3A-C).
    2. Mikrodiseksiyon makası kullanarak menenjleri ve sırt boynuzlarını çıkarın (Şekil 3D).
    3. Omurilik parçalarını toplayın ve 1 mL HBSS + %1 P/S ile tüpe(#1)aktarın.
    4. Kavisli makas kullanarak küçük parçalara omurilik kesin ve parçaları yerleşmek için bekleyin.
    5. 10 μL tripsin %2,5 ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'lik su banyosuna yerleştirin. 5 dk sonra, tüp dokunarak karıştırın. Parçalar sarmalı gibi bir küme oluşturmalı.
    6. Kümeyi 800 μL önceden ısıtılmış L-15, 100 μL BSA %4 ve 100 μL 10 mg/mL DNase içeren yeni bir tüpe(#2)aktarın. Grind 2x, sonra undissociated parçaları yerleşmek için 2 dakika bekleyin. Supernatant'ı yeni bir tüpe(#3)aktarın.
    7. 100 μL BSA %4, 20 μL 10 mg/mL DNase ve 900 μL tam nörobazal ortam ekleyin (CNB, bkz. Malzeme Tablosu ve Tablo 1). Grind 8x ve bekleyin 2 dk. Toplamak #3tüp supernatant .
    8. Tekrar adım 2.1.7 ve 10x eziyet. Tüp #3supernatant toplamak. Tüpün alt kısmında az miktarda doku bırakılmalıdır.
      NOT: Tüp #2 altında büyük bir küme hala duruyorsa,2.1.8 adımını tekrarlayın.
    9. Tüp #3altına 1 mL BSA %4 yastık ekleyin.
    10. 5 dk. 400 x g centrifuge supernatant atın.
    11. Hücre peletini yavaşça tüpe dokunarak yeniden askıya alın, ardından 1 mL CNB orta ekleyin. Pipet 6x ve 10 mg /mL DNase 20 μL ekleyin.
    12. Ek 5 mL CNB orta ve transfer 3 mL yeni bir tüp(#4).
    13. Her tüpün altına 1 mL %10,4 yoğunlukgradyan ortam ekleyin (bkz. Tablo 2) her tüpün altına(#3 ve #4). İki arabirim arasında keskin bir faz ayrımı görünmelidir.
    14. Oda sıcaklığında 20 dakika (RT) için 775 x g santrifüj. Faz ayrımının bozulmasını önlemek için santrifüj yavaşlaması düşük bir seviyeye ayarlanmalıdır.
    15. Hücreler, medya arasında bulutlu bir interfaz olarak görünen, yüzen olmalıdır. Her iki tüpteki hücreleri önceden ısıtılmış 1 mL CNB ortamı içeren yeni bir tüp(#5)içine toplayın.
    16. Ek bir 4-6 mL CNB orta ekleyin.
    17. Tüpün altına 1 mL BSA %4 yastık ekleyin.
    18. RT'de 5 dk için 400 x g'da santrifüj.
    19. Hücreleri say. Omurilik başına 0.75-1 x 106 MN verim beklenmektedir.
      NOT: Ventral omurilik de motor nöronların yanı sıra diğer nöronal alt tipleri içerir (örneğin, internöronlar). MN saflığı çoğunlukla diseksiyon sırasında dorsal alanların kaldırılmasıve MN zenginleştirilmiş rostral alanlara ulaşmak için yeteneğine bağlıdır. Görüntüdeki nöronların MN olduğundan emin olmak için, HB9::GFP fareler gibi endojen Bir MN belirteci ile fare zorlanması önerilir. Saf MN kültürü elde etmek için (ancak hücre verimi azalmış) FACS arınma15 kullanımı mümkündür.
    20. MFC'de MN kültürünü niçin ayrıştırdı
      1. 5 dk için 400 x g'da santrifüj ederek oda başına 150.000 MN konsantre olun.
      2. Süpernatant aspire ve yavaşça zengin nörobazal ortamda hücreleri resuspend (RNB) mfc başına 4 μL. RNB Ek% 2 B27 ve 25 ng/ mL BDNF ile desteklenmektedir CNB olduğunu.
      3. Orta yı her iki bölmeden de çıkarın ve distal bölmenin kuyularında ~10 μL'ye eşdeğer düşük hacim bırakarak. Kuyu çevresinde ince bir orta halka olarak görünür.
      4. Kanala 4 μL'lik hücreleri yavaşça yükleyin. Kanalın diğer tarafındaki kuyunun 4 μL'sini çıkarın ve akım akışını tersine çevirmek ve kanaldaki hücre yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için yavaşça doğrudan kanala yükleyin.
      5. Hücrelerin kanala 10x ışık mikroskobu kullanarak girdiğini doğrulayın ve odayı daha fazla ortam eklemeden 30 dakika boyunca kuvöze yerleştirin.
      6. Yavaşça proksimal ve distal kuyulara ~10-15 μL RNB ekleyin ve 15 dakika daha kuvözdeki odaları yerleştirin.
      7. Bu kuluçkadan sonra, her kuyuya ~75-80 μL RNB ekleyin.
    21. Ayrıştırılmış MN kültür bakımı
      1. Kaplamadan bir gün sonra (DIV1), glial büyümeyi inhibe etmek için 1 μM sitozin arabinoside (Ara-C) ile takviye li RNB ile orta değiştirin.
      2. Ara-C uygulamasından (DIV3) iki gün sonra, proksimal bölmedeki (Ara-C olmadan) orta yı taze CNB ortamı ile değiştirin.
      3. Aksonların mikrooluklar üzerinden geçişini artırmak için, glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) 25 ng/mL ve beyin kaynaklı nörotrofik faktörün (BDNF) 25 ng/mL'si ile desteklenen RNB'yi sadece distal bölmeye uygulayın. Aksonal distal kuyular (yüksek hacim) ve proksimal kuyular arasında kuyu başına en az 10 μL hacim degradesi koruyun.
      4. Ortamı 2 günde bir yenileyin. Aksonların 4-6 gün kadar dislolarak geçmesi gerekebilir.
  2. Omurilik eksplant kültürü
    1. Düz makas ve ince forceps kullanarak, bir E12.5 ICR-HB9 bir omurilik kesip::GFP fare embriyosu. %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile 1X HBSS çözeltisinde çalışın (Şekil 3A-C).
    2. Mikrodiseksiyon makası kullanarak menenjleri ve sırt boynuzlarını çıkarın (Şekil 3D).
    3. Omuriliği 1 mm kalınlığında enine kesitler halinde kesin(Şekil 3E). MFC'nin proksimal bölmesinden tüm ortamları atın.
    4. Toplam hacmi 4 μL olan bir pipetle tek bir omurilik ekstronu alın. Eksplantı mağaraya mümkün olduğunca yakın enjekte edin ve lateral çıkışlar (1 mm yumruklar) aracılığıyla proksimal kuyudan aşırı sıvı çekin. Eksperiproksimal kanaliçine emilmelidir.
    5. Proksimal kuyuya yavaşça 150 μL omurilik ekstrbitki ortamı (SCEX, bkz. Malzeme Tablosu ve Tablo 3)ekleyin.
    6. Omurilik eksplant kültür bakımı
      1. Proksimal bölmeye SCEX ortamı, distal bölmeye ise zengin SCEX ortamı (50 ng/mL BDNF ve GDNF içeren SCEX) ekleyin. Distal kuyular (yüksek hacim) ve proksimal kuyu arasında kuyu başına en az 15 μL hacim degradesi koruyun.
      2. Ortamı 2 günde bir yenileyin. Aksonların 3-5 gün kadar dislolarak geçmesi zaman alabilir.

3. Aksonal taşıma (Şekil 4A)

  1. Mitokondri ve asidik bölmelerin etiketlemi
    1. 100 nM Mitotracker Deep Red FM ve 100 nM LysoTracker Red içeren taze SCEX ortamını (veya ayrıştırılmış MN için CNB) hazırlayın. 37 °C'de 30-60 dk kuluçka. Diğer renkler, floroforları örtüşmedüğü sürece kullanılabilir.
    2. Sıcak CNB/SCEX orta ile 3x yıkayın. Plakalar görüntüleme için hazır.
  2. Canlı görüntüleme
    1. Film başına toplam 5 dakika olmak üzere 3 s aralıklarla 100 hızlandırılmış görüntü serisi aksonal taşıma elde edin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan görüntüleme sistemi, dönen disk konfokal ile donatılmış, uygun hücre görüntüleme yazılımı, 60x yağ lensi, NA = 1.4 ve bir EMCCD kamera ile kontrol edilen ters bir mikroskop içeriyordu. Filmler 37 °C ve %5 CO2'dekontrollü bir ortamda edinildi.
      NOT: Deneye bağlı olarak daha uzun veya daha kısa zaman atlamalı filmler görüntülenebilir. Hatta bir gecede filmler gerekirse kaydedilebilir. Ancak, denemek ve pozlama süresi ve lazer gücü azaltmak için önemlidir, yanı sıra toplam görüntü sayısını, film edinimi sırasında fototoksisite ve ağartma azaltmak için.

4. Görüntü analizi (Şekil 4-5)

  1. Kymograph analizi ile parçacık taşıma dağılımı ve yoğunluğunun analizi
    1. DOSYAYI FIJI'de açın. Görüntü'ye basan ayrı kanallar | Yığınlar | Araçlar | Deinterbırak.
    2. Görüntü | Özellikleri.
    3. Çizgi Simgesine sağ tıklayarak Parçalı Çizgi Aracı'nıseçin. Segmented Line Tool Satır Simgesiniçift tıklatarak Genişliği 8-10'a ayarlayın. Tüm çözümleme boyunca aynı çizgi genişliğiyle tutarlı olun.
    4. Distalden proksimala akson yolunu izleyen parçalı bir çizgi işaretleyin. Satır işaretini durdurmak için çift tıklatın.
    5. YG Yöneticisi'neyeni bir ilgi alanı (YG) eklemek için t'yi tıklatın. Bunu elektronik tablo çözümleme tablosuna ekleyin.
    6. Aksonun alanını ve uzunluğunu ölçmek için m'yi tıklatın. Bunu çözümleme tablosuna ekleyin.
    7. Eklentileri tıklayarak bir kymograph oluşturun | KymoToolBox | Kymo çizin. Alternatif olarak, diğer kymograph nesil eklentileri kullanılabilir.
    8. Hareketli (retrograd veya anterograd) ve hareket etmeyen parçacıkları el ile sayın ve bunları doğru sütundaki tabloya ekleyin.
      NOT: Parçacıklar, yer değiştirmeleri belirli yönde 10 μm'den yüksekse, hareket eden anterograd (yani, kymograph'ta sola hareket eden) veya retrograd (yani sağa doğru hareket etme) olarak sınıflandırılır. Çizgi Simgesi ile yatay bir çizgi işaretleyerek ve mtuşuna basarak yer değiştirmeyi ölçmek mümkündür. Hareketsiz parçacıklar veya yer değiştirme kriterlerini karşılamayanparçacıklar hareket etmeyen ler olarak tanımlanır (Şekil 4B).
  2. Tek parçacık izleme: Manuel izleme
    1. FIJI yazılımı (Fabrice P. Cordelière tarafından geliştirilen) için manuel izleme eklentisini http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html'dan indirin
    2. DOSYAYI FIJI/ImageJ'deaçın. MFC olukları yatay olarak hizalamak için Döndürme seçeneğini kullanın.
    3. Gerekirse sinyal-gürültü oranını artırmak için İşlem | Arka Planı çıkarın.
    4. Manuel İzleme eklentisini açın. Parametreleri (örn. piksel boyutu, zaman aralığı, vb.) görüntüleme için kullanılan özel mikroskoba göre ayarlayın. Burada gösterilen sonuçlar için mikroskop ve lens oranı 0.239 m/piksel, kare aralığı ise 3 s idi.
    5. X ve Y koordinatlarını alın ve metni elektronik tabloya kopyalayarak sonuçları kaydedin.
    6. Resim'e tıklayarak çok kanallı filmleri analiz edin | Renk | Kanalları birleştirmek ve ardından yalnızca birlikte yerelleştirilmiş puncta'yı izlemek için Kanalları birleştirin.
  3. Tek parçacık izleme: Yarı otomatik izleme (Şekil 5)
    1. Analiz yazılımını açın. Bu çalışmada Bitplane Imaris yazılım sürümü 8.4.1 kullanılmıştır.
    2. Üst menüde Aşmak'a geçin.
    3. Resim İşleme | Takas Zamanı ve Z | Tamam.
    4. Edit'e tıklayın | Görüntü Özellikleri (Ctrl+I) | Geometri | Voxel Boyut Satır. Kullanılan mikroskopi kurulumuna göre Görüntü Özelliklerini Ayarlayın.
      NOT: Burada görüntülenen veriler için mikroskop ve lens oranı 0.239 m/piksel idi.
    5. Tüm Eşit uzaklıkta'nı tıklatın ve Zaman Aralığınıdeğiştirin. Örneğin, aralık olarak 3 s kullanın. Sağ alttaki Sıfırla düğmesini tıklatın veya Ctrl+B'yitıklatın.
    6. Küçük Sarı Noktalar Simgesi'nitıklatarak sol üstteki Noktalar katmanı ekleyin. Sol altta Noktalar düzenleme için yeni bir Menü açılır.
    7. Nokta algılama başlayana kadar Sağ Mavi Ok'a basın.
      NOT: Pencerenin sol alt kısmındaki filtreyi kullanarak bazı noktaları filtrelemek önemlidir. Yeterli sayıda noktanın seçildiğini görmek için filmi birkaç kez kontrol edin.
    8. Parametreleri deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde doğrulayın veya yapılandırın. Örneğin, Max Mesafe = 12 μm (İki ayrı nokta arasındaki maksimum izin verilen mesafe, onları aynı tek parçaya dahil etmek için); Max Gap Boyutu = 1 (Bir parçanın gözden kaçırmasına izin verilen ve yine de tek parça olarak kabul edilen kare sayısı).
    9. Ayarlar'ı tıklatın ve ardından Stili Takip Et = Kapalı, Puanlar = Küre.
    10. Filtre Çubuğu'nukullanarak, ayarlama için farklı filtreler seçin. Örneğin, burada sağlanan verilerde, İzleme Süresi = 9 3'ten az kareiçeren tüm parçaları kaldırmış. Tüm parametreler ayarlandığında, Sağ Yeşil Ok'utıklatın. Bu adımdan sonra daha fazla düzenleme mümkün değildir.
    11. Tüm parçaları el ile birlikte yeniden yapmak için Noktalı Küçük Kalem'i tıklatın.
    12. Filmi görüntüleyin (Şekil 5B). Bir hata oluşursa, birkaç olası seçenek vardır:
      1. Bir parçanın bağlantısını kesmek için Nesne seçeneğini tıklatın ve Ctrl'yibasılı tutarak bağlantısı kesilmesi gereken iki noktayı seçin ve Bağlantıyı Kesme'yiseçin.
      2. Bir parçayı bağlamak için Nesne seçeneğini tıklatın, Ctrl tutarak bağlanması gereken iki nokta seçin ve Bağlan'ıseçin.
      3. Bir parçayı veya noktayı silmek için, doğru seçenekle(Parça/Nesne), Normal Kalem Simgesiile ekrana geçin ve Sil'iseçin.
      4. Noktaları el ile eklemek için Normal Kalem Simgesi Ekranınageçin. Ekranın alt kısmında bir Manuel İzleme İşaretivardır. Otomatik Bağlan Onay Kutusunun Volduğundan emin olun. Filmin kendisinde, bir nokta eklemek için Shift düğmesini ve Left-Clicktuşuna basılı tutun.
    13. Varolan bir parçaya nokta eklemek için istediğiniz parça (sarı) ve çerçeveyi seçin, Normal Kalem Simgesi Ekranına geçin ve el ile bir nokta ekleyin. Filmin tamamı bittiğinde, Kırmızı Grafik (İstatistik) gibi görünen Simge'yegeçin. Analiz edilen parametreleri daha sonra diseetmek mümkündür. Bunu yapmak için ekranın sol alt kısmında İsveç Tuş Simgesinebasın. Örneğin: Pozisyon X, Pozisyon Y.
    14. Birkaç Disket Gibi Görünen Simgeye Basın, Tüm İstatistikleri Dışa Aktar.
      NOT: Elektronik tablo çıktısı, talep üzerine paylaşılacak olan bu analiz için kullanılan yayınlanmış kod9 kullanılarak doğrudan veya daha fazla analiz edilebilir. Analizden aşağıdaki parametreler çıkarılır: Hız, Parça Deplasmanı, Çalışma Uzunluğu, Hız (Yönlülük dahil), Durak Sayısı, Ortalama Durdurma Süresi, Alfa, Yön Değişiklikleri ve Anlık Hız. Her parametrenin ayrıntılı bir açıklaması Gluska ve ark.9'daaçıklanmıştır.

Sonuçlar

Açıklanan protokolütaki şekliyle fare embriyonik HB9::GFP omurilik ekslekları MFC'de kültürlenmiştir (Şekil 4A). Eksteseler 7 gün boyunca büyüdü, aksonlar tamamen distal bölmeye geçti. Mitotracker Deep Red ve Lysotracker Red boyaları distal ve proksimal bölmelere mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için eklenmiştir(Şekil 4C). Distal oluklarda akson lar görüntülendi ...

Tartışmalar

Bu protokolde motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartmanların aksonal naklini takip edecek bir sistem tanımlıyoruz. Bu basitleştirilmiş in vitro platform hassas kontrol sağlar, izleme, ve subsellüler nöronal bölmelerin manipülasyon, motor nöron yerel fonksiyonların deneysel analizi sağlayan. Bu protokol, als gibi MN hastalıklarının incelenmesinde yararlı olabilir, hastalıkta aksonal taşıma disfonksiyonunun altında yatan mekanizmayı anlamaya odaklanmak için10,

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 561/11) ve Avrupa Araştırma Konseyi 'nin (ERC, 309377) bağışları ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
35mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD cameraAndor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)Sigma-AldrichC1768stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-250Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mmWorld Precision Instruments WPI504530For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mmWorld Precision Instruments WPI504533For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mmWorld Precision Instruments WPI504534For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v in ddw
ChlorotrimetylsilaneSigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreasSigma-AldrichDN-25stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone greaseSigma-AldrichZ273554-1EAFor epoxy mold preperation
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mmF.S.T1125520
Epoxy HardenerTrias Chem S.R.LIPE 743For epoxy mold preperation
Epoxy ResinTrias Chem S.R.LRP 026UVFor epoxy mold preperation
FIJI softwareImageJ
GDNFAlomone LabsG-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP mice strainJackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-045Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ softwareAndor
Iris scissors, curved, 10 cmAS Medizintechnik11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Neurobasal mediumThermo Fisher21103049
Nikon Eclipse Ti micorscopeNikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) SolutionBiological Industries03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW Corning Corporation#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreasSigma-AldrichT1426stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm bladeF.S.T15000-00
Yokogawa CSU X-1Yokogawa

Referanslar

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 159mikroak kan odalarmotor n ronlaromurilik ekstremiteleriaksonal ta mamitokondriasidik b lmeler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır