JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الفلورسينس مدى الحياة وشاشات التصوير، والقياس الكمي ويميز الميول التجميع من البروتينات في المعيشة، والشيخوخة، وشدد نماذج مرض C. elegans.

Abstract

ترتبط الفيبريات الأميلويد مع عدد من الأمراض العصبية مثل هنتنغتون, باركنسون, أو مرض الزهايمر. هذه الفيبريات اميلويد يمكن عزل البروتينات الذاتية ميتاستابل وكذلك مكونات شبكة البروتوستاس (PN) وبالتالي تفاقم البروتين misfolding في الخلية. هناك عدد محدود من الأدوات المتاحة لتقييم عملية تجميع البروتينات الأميلويد داخل الحيوان. نحن نقدم بروتوكولا للميكروسكوبية مدى الحياة الفلورية (FLIM) التي تسمح رصد وكذلك التحديد الكمي للفيبريلية اميلويد في خلايا محددة، مثل الخلايا العصبية، بطريقة غير الغازية ومع تطور الشيخوخة وعند اضطراب PN. FLIM مستقلة عن مستويات التعبير من الفلوروفور وتمكن من تحليل عملية التجميع دون أي مزيد من تلطيخ أو التبييض. يتم إخماد الفلورفور عندما تكون في محيط قريب من الهياكل الأميلويد، مما يؤدي إلى انخفاض عمر الفلورسينس. يرتبط الترويم بشكل مباشر بتجميع بروتين الأميلويد. FLIM هو تقنية متعددة الاستخدامات التي يمكن تطبيقها لمقارنة عملية الفيبريلة من البروتينات الأميلويد مختلفة، والمحفزات البيئية، أو الخلفيات الوراثية في الجسم الحي بطريقة غير الغازية.

Introduction

يحدث تجميع البروتين في كل من الشيخوخة والمرض. من الصعب اتباع المسارات التي تؤدي إلى تكوين وترسب الأميلويدات الكبيرة أو التضمينات غير المتبلور وحركية لها هي بالمثل صعبة للكشف. البروتينات يمكن أن تسيء بسبب الطفرات الجوهرية داخل تسلسل الترميز الخاصة بهم، كما هو الحال في الأمراض الوراثية. البروتينات أيضا يخطئ لأن شبكة البروتوستاس (PN) التي تبقيها قابلة للذوبان ومطوية بشكل صحيح هو ضعف، كما يحدث أثناء الشيخوخة. تتضمن PN المرافقالجزيئية وآلات التحلل وهي مسؤولة عن النشأة الحيوية وللطي والاتجار وتدهور البروتينات1.

C. ظهرت elegans كنموذج لدراسة الشيخوخة والمرض بسبب عمرها القصير، والطبيعة التسببية، وسهولة التلاعب الجيني. وقد تم إنشاء العديد من سلالات C. elegans المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات المسببة للأمراض البشرية في الأنسجة الضعيفة. الأهم من ذلك، العديد من السلالات التي تحتوي على البروتينات المعرضة للتجميع تلخيص السمة المميزة للاضطرابات اميلويد، وتشكيل إدراجات كبيرة. بفضل الجسم C. elegans 'شفافة، يمكن تصور هذه المجاميع في الجسم2الحي، غير الغازية وغير هدام2 . توليد أي بروتين من الفائدة (POI) في الانصهار مع الفلوروفور يسمح للتحقيق في مواقعها، والاتجار، وشبكة التفاعل، ومصير عام.

نحن نقدم بروتوكولا لرصد تجميع البروتينات المسببة للأمراض في المعيشة والشيخوخة C. elegans عن طريق الفلورسينس التصوير مدى الحياة المجهر (FLIM). FLIM هو تقنية قوية تقوم على عمر الفلوروفور ، بدلا من أطياف الانبعاثات. يتم تعريف العمر (تاو، و) على أنه متوسط الوقت المطلوب من قبل فوتون للاضمحلال من حالته اتحمس مرة أخرى إلى حالته الأرضية. يتم حساب عمر جزيء معين باستخدام تقنية المجال الزمني لعد الفوتون الواحد المرتبط بالوقت (TCSPC). في TCSPC-FLIM ، يتم الحصول على وظيفة تسوس الفلورسنت عن طريق إثارة الفلوروفور مع نبضات ليزر قصيرة عالية التردد وقياس أوقات وصول الفوتون المنبعثة إلى كاشف فيما يتعلق بالنبضات. عند مسح عينة، يتم إنشاء صفيف بيانات ثلاثي الأبعاد لكل بكسل: يتضمن الصفيف معلومات حول توزيع الفوتونات في إحداثياتها المكانية x y ومنحنى الاضمحلال الزمني. وبالتالي تصبح عينة معينة خريطة لأعمار الكشف عن المعلومات عن بنية البروتين، ملزمة، والبيئة3،4. كل بروتين الفلورسنت تمتلك حياة جوهرية ومحددة بدقة، وعادة من بضع نانو ثانية (ns)، تعتمد على خصائصه physiochemical. الأهم من ذلك ، فإن عمر الفلوروفور مستقل عن تركيزه ، وكثافة الفلورسنت ، ومنهجية التصوير. ومع ذلك ، داخل النظام البيولوجي ، يمكن أن تتأثر بالعوامل البيئية مثل درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وتركيزات الأيون ، وتشبع الأكسجين ، وشركاء التفاعل. العمر حساس أيضا ً للتغيرات الهيكلية الداخلية والتوجه. دمج الفلوروفور إلى POI يؤدي إلى تغيير في حياته وبالتالي معلومات عن سلوك البروتين المنصهر. عندما يتم إحاطة الفلوروفور أو تغليفها في بيئة مقيدة بإحكام ، مثل أوراق بيتا المضادة للمتوازية لبنية اميلويد ، فإنها تفقد الطاقة بشكل غير إشعاعي ، وهي عملية تعرف باسم إخماد5. يروي من الفلوروفور النتائج في تقصير حياتها واضحة. عندما تكون قابلة للذوبان، فإن عمر البروتين سيبقى أقرب إلى قيمته الأصلية الأعلى. في المقابل، عندما يبدأ البروتين في التجميع، فإن عمره سينتقل حتماإلى قيمة أقل6،7. لذلك ، يصبح من الممكن مراقبة الميل التجميعي لأي بروتين تشكيل اميلويد في أعمار مختلفة في C. elegansالحية.

هنا نصف بروتوكول لتحليل تجميع بروتين الانصهار تتألف من مختلف البوليغلوتامين (CAG، Q) تمتد (Q40، Q44، وQ85). نحن نوضح كيف يمكن تطبيق هذه التقنية بالتساوي على الفلورفور، مثل بروتين الفلورسنت السماوي (CFP)، والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) وبروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي (mRFP)؛ وفي جميع أنسجة C. elegans، بما في ذلك الخلايا العصبية والعضلات والأمعاء. وعلاوة على ذلك، في سياق البروتوستاس، FLIM هو أداة مفيدة جدا لمراقبة التغيرات عند استنفاد المرافقالجزيئية. هدم واحدة من المرافقالجزيئية الرئيسية، والبروتين صدمة الحرارة 1(hsp-1)،عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي تنتج misfolding المبكر من البروتينات. ثم يتم قياس الزيادة في الحمل التجميعي نتيجة للشيخوخة أو المرض أو المرافقين الناقصين كانخفاض في عمر الفلورسينس.

Protocol

1. تزامن C. elegans

  1. مزامنة C. elegans إما عن طريق معالجة محلول هيبوكلوريت القلوية أو عن طريق وضع البيض بسيطة لمدة 4 ساعة في 20 درجة مئوية8.
  2. تنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على المتوسطة نمو النيماتودا (NGM) لوحات المصنفة مع OP50 E. القولونية وفقا للإجراءات القياسية9. عمر الديدان الخيطية حتى مرحلة النمو المطلوبة أو اليوم.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم صورة الشباب في اليوم 4 ويتم صورة الديدان الخيطية القديمة في اليوم 8 من الحياة.

2. RNAi بوساطة ضربة قاضية من آلات المرافق عن طريق التغذية

ملاحظة: تنفيذ ضربة قاضية من البروتين صدمة الحرارة 1(hsp-1)المرافق عن طريق تغذية متجه RNAi المقابلة إلى الديدان الخيطية10. تم الحصول على hsp-1 RNAi plasmid من مكتبة Ahringer (معرف استنساخ: F26D10.3).

  1. تنمو HT115 (DE3) E. القولونية التعبير عن hsp-1 RNAi plasmid لمدة 6 ساعة إلى بين عشية وضحاها في لوريا برداني (LB) المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين.
  2. إعداد لوحات جديدة NGM الأجار تحتوي على isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) والأمبير (25 ميكروغرام / مل) والبذور مع hsp-1 بكتيريا RNAI. ترك لوحات لتجف والحث في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 أيام.
  3. ضع البيض المتزامن على طبق سرنا واتركه ليفقس، أو ضع الديدان الخيطية المبشرة واسمح بوضع البيض لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية قبل إزالته. تنمو الديدان الخيطية حتى العمر المطلوب أو المرحلة.
    ملاحظة: قد يقدم الجيل الثاني من الديدان الخيطية نمط اقوى من الضربة القاضية. بروتوكول siRNA والشروط الموصوفة هنا عامة ومكيفة مع hsp1. تدخل الحمض النووي الريبي عبر siRNA من استنساخ محددة / الجينات يحتاج إلى إنشاء وتحسين من قبل المستخدم النهائي. من المهم أن نلاحظ أن ليس كل siRNA لديها نفس الكفاءة، ولذلك فمن المستحسن لاختبار فعالية الضربة القاضية عن طريق القياس الكمي إما عن طريق رد فعل سلسلة البوليميراز النسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) أو لطخة الغربية.

3. إعداد الشرائح المجهرية

  1. في يوم التصوير، ابدأ بإعداد شرائح التصوير. تذوب agarose في DdH2O بتركيز 3٪ (ث / v) والسماح لتبرد قليلا.
  2. قطع غيض من 1 مل تلميح ماصة واتخاذ ما يقرب من 200 ميكرولتر من agarose الذائبة. Pipette agarose على شريحة زجاجية نظيفة ووضع على الفور ثانية واحدة على القمة ، وتجنب تشكيل أي فقاعات. يترك ليجف وإزالة بلطف الشريحة الزجاجية العلوية. والنتيجة هي شريحة زجاجية مع سطح أغاروز حتى حيث سيتم وضع الديدان الخيطية.
    ملاحظة: سيتم استخدام كل شريحة للصورة بين 5-10 نيماتودا. يمكن إعداد الشرائح وتخزينها لبضع ساعات في صندوق مهاز لمنع الاغاروز من الجفاف.

4. تصاعد الديدان الخيطية على شرائح المجهر

ملاحظة: FLIM يتطلب الديدان الخيطية ليتم شلحركتها. قم بإجراء هذه الخطوة بمجرد أن يكون إعداد التصوير (على سبيل المثال، المجاهر والليزر وأجهزة الكشف) جاهزًا للاستخدام.

  1. باستخدام اختيار سلك البلاتين، ضع الديدان الخيطية من العمر المطلوب على لوحة جديدة غير مبذر والسماح لهم الزحف لإزالة البكتيريا OP50 الزائدة من أجسادهم.
  2. إعداد مركب مخدر (أزيد الصوديوم أو ليفاميسيلي) لشل النيماتودا. الحفاظ على 500 mM NN3 الأسهم في الظلام في 4 درجة مئوية وتمييع في ddH2O الطازجة إلى تركيز نهائي من 250 mM. إذا كان استخدام levamisole، تمييع مخزون 20 mM إلى 2 mM حل العمل في ddH2O.
    تنبيه: أزيد الصوديوم (NaN3)شديد السمية. استخدام القفازات والنظارات الواقية والعمل تحت غطاء محرك السيارة التهوية.
  3. العمل تحت ستيريوميكرور، وضع قطرة 10 ميكرولتر من مركب مخدر على وسادة agarose ونقل بلطف 5-10 الديدان الخيطية في ذلك. استخدم طرف رمش لفصل الديدان الخيطية. الاحتفاظ بها قريبة من بعضها البعض ولكن لا تلمس للسماح لترجمة أسهل من الديدان الخيطية أثناء الحصول على الصورة.
  4. تراكب بعناية الديدان الخيطية مع غطاء. اتخاذ القياسات في غضون 1 ساعة بعد تركيبها.
    ملاحظة: كل التخدير سوف تقتل في نهاية المطاف C. elegans. يجب أن تكون الديدان الخيطية غير متحركة تمامًا أثناء التصوير، لأنه يتم تسجيل خريطة العمر من كل بكسل. أي حركة من المعلمات س، y يمنع قراءة العمر في نفس بكسل متحمس.

5- الحصول على بيانات FLIM

ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم الحصول على عمر الفلوروفور عبر أسلوب TCSPC المجال الزمني. FLIM يتطلب نبض الضوء التي يتم إنشاؤها بواسطة الليزر بمعدل تكرار مجموعة وثابتة. يختلف معدل التكرار وفقًا لنوع الليزر ويجب أن يكون معروفًا من قبل المستخدم. يتم تحقيق قياسات مدى الحياة عن طريق أجهزة الكشف والمعدات الإلكترونية المثبتة جنبا إلى جنب مع المجهر التقليدي. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء القياسات على ثلاثة مجاهر مختلفة للمسح الضوئي بالليزر مع أجهزة الكشف والبرامج المقدمة من قبل شركتين مختلفتين(جدول المواد)للحصول على حياة mRFP و CFP و YFP ، على التوالي. تأكد من وجود المرشحات الصحيحة للانبعاثات / الإثارة وتقليل أي خلفية أو إضاءة خلفية قبل البدء. قبل البدء في أي تجربة، قم بإنشاء الاستقرار الضوئي للفلوعور المختار. إذا كان الفلوروفور يبيض في غضون فترة قصيرة داخل أنسجة النيماتودا، فإنه ليس مناسبا لقياسات FLIM في C. elegans.

  1. افتح برنامج الاستحواذ FLIM. برنامج FLIM يسمح أيضا السيطرة على المجهر البؤري. حدد موقع علامة التبويب/الزر للسماح بتمكين مخرجات الكاشف واضغط على تمكين المخرجات.
  2. الحصول على وظيفة استجابة الصك (IRF)، الذي يصف دقة توقيت الإعداد مفيدة.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة ويفضل قبل تركيب الديدان الخيطية.
    1. إذا كان متوفراً، قم بإزالة فلاتر الإثارة/الانبعاثات.
    2. ضع غطاء فارغ فوق الهدف وابحث عن سطحه. سجل إشارة التشتت التي تم الحصول عليها من قسيمة الغطاء لمدة لا تقل عن 30 s.
      ملاحظة: لأعمار عدة نانو ثانية، يمكن لبرنامج الاستحواذ تلقائياً تقدير التحول IRF. يوصى دائمًا بالحصول على IRF.
  3. ضع الشريحة مع C. elegans المركبة على المسرح. باستخدام عدسة التكبير 10x في وضع الإرسال وتوطين موضع الديدان الخيطية على الشريحة.
  4. قم بإزالة الشريحة، وقم بتبديل الهدف إلى عدسة تكبير 63 x، وقم بتطبيق وسيط الغمر المطلوب (على سبيل المثال، الزيت). استبدال الشريحة على المسرح وتوطين الديدان الخيطية.
  5. تحديد موقع مدير الثقب على برنامج الاستحواذ وفتحه إلى الحد الأقصى. ابدأ بمسح العينة، وحدد منطقة ذات أهمية (على سبيل المثال، الرأس، الجزء العلوي من الجسم)، وركز على مستوى الإسقاط الأقصى.
  6. مراقبة معدل نبض الليزر والقيم الثلاث الأخرى الموجودة على واجهة البرنامج: الكسر الثابت التمييزي (CFD) ، الوقت إلى السعة (TAC) ، والمحول التماثلي إلى الرقمي (ADC).
    ملاحظة: يجب أن يكون ليزر بوابة الحد الأقصى من 1 × 108 عدد الفوتون واحد. يمثل هذا الرقم الحد الأقصى لعدد الفوتون التي يوفرها الليزر. توفر CFD معلومات عن استلام نبض الفوتون الواحد في إشارة إلى نبض الليزر بواسطة الكاشف. يجب أن تكون هذه القيمة تقريبا1 × 105. وTAC يميز بين الوقت الذي تم الكشف عن فوتون واحد ونبض الليزر المقبل. وأخيراً، يقوم ADC بتحويل جهد TAC إلى إشارة ذاكرة قابلة للذاكرة11. يجب أن يكون لدى CFD و TAC و ADC قيم مماثلة لضمان عدم فقدان الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور. يضمن التقييم الصحيح لهذه المعلمات أنه يتم جمع عدد كافٍ من الفوتون لإنشاء خريطة دقيقة مدى الحياة.
  7. على واجهة برنامج FLIM، معاينة عدد الفوتونات التي تم اكتشافها: يجب أن تكون قيمة ADC بين 1 × 104 و 1 × 105. إذا لزم الأمر، قم بتحويل التركيز على مستوى مختلف أو زيادة قوة الليزر لجمع المزيد من الفوتونات.
    ملاحظة: بشكل عام، يجب ألا يتجاوز عدد الفوتون المسجلة في الثانية 1% من معدل تكرار الليزر.
  8. في شريط القوائم، حدد علامة التبويب لتعيين معلمات الاستحواذ. حدد مزامنة الفحص للسماح باكتشاف فوتون واحد.
  9. تعيين الاستحواذ إلى مقدار محدد من الوقت أو عدد ثابت من الفوتون. على سبيل المثال، الحصول على منحنى تسوس مدى الحياة لمدة 2 دقيقة أو حتى يصل بكسل واحد عدد الفوتون من 2000 حدث واحد. اضغط على البدء لبدء الاستحواذ.
    ملاحظة: سوف تتطلب الفلوروفوريات المختلفة إثارة مختلفة وأشعة الليزر الانبعاثات والمرشحات. وفقا لسطوع العينة، يمكن أيضا أن يتم تعديل قوة الليزر، والتي لن تتداخل مع العمر. تستخدم هذه البروتوكولات إعدادات الإثارة/الانبعاثات التالية: YFP ex500/em520-50 نانومتر، mRFP ex561/em580-620 نانومتر. تم استخدام ليزر فوتون ين نبضي لقياسات CFP باستخدام ex800/em440 نانومتر. وسيلزم تحديد مقدار الوقت وعدد الفوتونات اللازمة للحصول على خريطة FLIM تجريبيا لكل إعداد وكل غرض تجريبي.

6. تحليل بيانات FLIM باستخدام برنامج FLIMfit

ملاحظة: إجراء تحليل البيانات باستخدام أداة برنامج FLIMfit التي تم تطويرها في إمبريال كوليدج لندن12 (انظر الشكل 1).

  1. فتح البرنامج واستيراد ملفات بيانات FLIM عبر ملف | تحميل بيانات FLIM. تحميل جميع العينات من شرط واحد، حتى لو تم الحصول عليها في جلسات مختلفة ومن تكرار البيولوجية المختلفة.
  2. إذا لزم الأمر، قم بتجزئة النيماتودة الواحدة من أي صورة FLIM عبر التقسيم | مدير التقسيم. اسحب أداة الاقتصاص حول المنطقة ذات الاهتمام حتى يتم تمييزها. بمجرد الانتهاء، اضغط موافق.
    ملاحظة: يجب إجراء تجزئة لكافة الصور.
  3. حدد منطقة صغيرة تظهر فيها الصورة المستندة إلى الكثافة لـ C. elegans (الشكل 1، الأسهم 1). سيظهر منحنى الاضمحلال في تلك المنطقة في نافذة الاضمحلال الكبيرة على الجانب الأيمن من الواجهة(الشكل 1، السهم 2).
    ملاحظة: يمكن عرض الاضمحلال خطياً أو لوغاريثيميسياً.
  4. تعيين المعلمات الصحيحة لاستقراء العمر عبر خوارزمية البرنامج كما هو موضح في الخطوات 6.5-6.8.
  5. في علامة التبويب البيانات (الشكل 1، السهم 3):
    1. تعيين قيمة دنيا متكاملة عشوائية لاستبعاد أي وحدات بكسل باهتة جداً لإنتاج تناسب جيد. اعتمادا على عينة C. elegans هذه القيمة تختلف من 40-300. إدخال قيم مختلفة حتى يتم تحقيق معاينة مرضية.
    2. حدد الحد الأدنى للوقت ورقم الحد الأقصى للوقت للحد من إشارة FLIM إلى هذه القيم. سيتم استبعاد كافة الأحداث التي تظهر قبل وبعد هذه العتبة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لتحليل mRFP، تم استبعاد الأحداث قبل 800 ps وبعد 4,000 ps. تعتمد هذه القيم على عمر الفلوروفور وتحتاج إلى تحديدها من قبل المستخدم النهائي.
    3. لا تقم بتغيير التهم /الفوتون المحددة مسبقًا من 1.
    4. إدخال معدل التكرار، في MHz ، من الليزر المستخدمأثناء الاستحواذ.
      ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الحالي، تم استخدام أشعة الليزر المختلفة مع معدلات تكرار مختلفة. اثنين من الليزر الفوتون المستخدمة للحصول على أعمار CFP تمتلك معدل تكرار 80 ميغاهرتز، لYFP الليزر يكرر في 40 ميغاهرتز، وبالنسبة لmRFP القيمة هي 78.01 ميغاهرتز. تم إدخال هذه القيم في FLIMfit وفقًا للعينة التي تم تحليلها.
    5. إدخال قيمة Gate Max لاستبعاد كافة وحدات البكسل المشبعة.
      ملاحظة: بالنسبة للقياسات مدى الحياة في C. elegans، يتم تعيين هذه القيمة إلى أي عدد كبير (على سبيل المثال ، 1 × 108).
  6. في علامة التبويب مدى الحياة، حدد تركيبًا عموميًا لاستخدامه (على سبيل المثال، تركيب بكسل). انظر الشكل 1، السهم 4.
    ملاحظة: سوف ينتج تركيب بكسل الحكمة تسوس تركيبها على كل بكسل على حدة. سوف ينتج تركيب الصورة الحكيمة تركيبًا عالميًا لكل صورة على حدة ويعرض قيمة عمر واحدة لكل صورة. وسوف ينتج تركيب عالمي الحكمة تركيب واحد عبر مجموعة البيانات بأكملها. يتم توفير قيمة عمر واحد لكافة الصور.
  7. لا تقم بتغيير أي معلمة أخرى باستثناء لا. اختيار إكسب إذا كان من المعروف أن تسوس الفلورسينس المختار هو متعدد الأسي ويعرض أكثر من عمر واحد.
    ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم استخدام هذه الدالة لحساب أعمار فلوروفور CFP الأسي.
  8. تحميل IRF عبر قائمة IRF: IRF | تحميل IRF. لتقدير التحول IRF، حدد IRF | تقدير IRF التحول. ستظهر مجموعة من القيم تلقائيًا في علامة التبويب IRF. بمجرد تأسيس هذا، لا تقم بتغيير أية معلمات أخرى من علامة التبويب هذه.
  9. بمجرد تعيين جميع المعلمات، اضغط على مجموعة بيانات Fit (الشكل 1، السهم 5). سوف تنتج الخوارزمية تناسب منحنى الاضمحلال وإنشاء قيمة مدى الحياة لكل صورة.
    ملاحظة: يجب أن تتداخل الملاءمة الناتجة، المميزة في خط أزرق، مع كافة الأحداث. يتم الحصول على تناسب جيد عندما يتم محاذاة كافة الأحداث على طول تناسب.
  10. انقر فوق علامة التبويب المعلمات (الشكل 1، السهم 6) ، الموجود ضمن القوائم اليمنى العليا من واجهة البرنامج ، وحدد إحصائية: w_mean (المتوسط المرجح) وتحقق من أن قيمة chi2 أقرب ما يمكن إلى 1.
    ملاحظة: يضمن chi2 القريب من واحد دقة تناسب. وبالتالي يتم الكشف عن قيمة عمر الصورة المحددة كما tau_1.
  11. تصدير أي معلومات ذات أهمية: ملف | تصدير كثافة الصور / تناسب جدول النتيجة / صور / الرسوم البيانية. حفظ إعدادات البيانات المستخدمة لحساب العمر: ملف | حفظ إعدادات البيانات.
    ملاحظة: سيتم حفظ المعلمات المستخدمة للتحليل المستقبلي للعينات المحددة.

7. التمثيلات الرسومية لبيانات FLIM

ملاحظة: يمكن تمثيل الأعمار التي تم جمعها من عينات مختلفة بصرياً بطرق مختلفة. حدد للدلالة على قيم العمر إما بالنانو ثانية أو بيكوثانية.

  1. إظهار نوعية تناسب ودقة منحنى عن طريق تصدير منحنى الاضمحلال مباشرة من FLIMfit.
  2. تمثيل توزيع الفوتوانات عن طريق رسم تردد عدد الفوتون مقابل قيمة العمر في الرسم البياني.
  3. وأخيراً، للمقارنة الإحصائية، إذا قارنت عينتين أو أكثر، ضع قيم العمر بالإضافة إلى الانحراف المعياري للمتوسط في رسم بياني شريطي مبعثر. إجراء أي تحليل إحصائي مطلوب.

النتائج

يوضح البروتوكول كيفية مراقبة تكوين الأنواع المجمعة بدقة في C. elegansالحية ، سواء أثناء شيخوختها الطبيعية أو عند تعرضها للإجهاد. اخترنا أربع سلالات مختلفة من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن بروتينات البولي غلوتامين إما 40Q، 44Q، أو يكرر 85Q. يتم تصنيع هذه البروتي?...

Discussion

ويصف البروتوكول المعروض هنا تقنية تعتمد على المجهر لتحديد الأنواع المجمعة في نظام نموذج C. elegans. FLIM يمكن أن تميز بدقة وجود كل من الأنواع المجمعة والقابلة للذوبان تنصهر على الفلوروفور عن طريق قياس تسوس العمر الفلوري. عندما يبدأ بروتين الانصهار لتجميع متوسط العمر المسجل سوف يتحول من أعل...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

سلالة العضلات Q40-mRFP التي تقدمها CGC، والتي يتم تمويلها من قبل مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). الخلايا العصبية-Q40-CFP كان هدية لطيفة من مختبر موريموتو. نحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK، زمالة دكتوراه NeuroCure من قبل مجموعة NeuroCure للتميز إلى MLP)، EMBO (زمالة قصيرة الأجل إلى MLP) وشركة علماء الأحياء (منح السفر إلى CG و MLP) للتمويل. كما نعترف بمرفق التصوير المجهري الخفيف المتقدم في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي، برلين، لتوفير الإعداد لتصوير بنيات YFP.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC ImageBecker & Hickl GmbHFLIM Aquisition software
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPKind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPKind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPKind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGMounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5Leica Camera AGConfocal Microscope
Levamisole HydrochlorideAppliChem GmbHA4341Anesthetic
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Aquisition software
Sodium AzideCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Anesthetic
Sodium ChlorideCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM component
Standard-ObjektträgerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Glass slides
Universal AgaroseBio & Sell GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGConfocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGConfocal Microscope

References

  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
  3. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  4. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  5. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  6. Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
  7. Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
  8. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
  9. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  10. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
  11. Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
  12. Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
  13. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  14. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  15. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
  16. Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
  17. Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
  18. Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
  19. Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
  20. Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 C elegans siRNA FLIM TCSPC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved