蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

要約

蛍光寿命イメージングは、生きている、老化、およびストレスを受けたC.エレガンス病モデルにおけるタンパク質の凝集傾向を監視し、定量化し、区別する。

要約

アミロイド線維は、ハンチントン、パーキンソン病、またはアルツハイマー病などの神経変性疾患の数に関連付けられている。これらのアミロイド線維は、内因性の転移性タンパク質ならびにプロテオスタシスネットワーク(PN)の成分を隔離し、細胞内のタンパク質のミスフォールディングを悪化させることができる。動物内のアミロイドタンパク質の凝集過程を評価するために利用可能なツールの数は限られています。我々は、非侵襲的な方法で、老化の進行と摂動時に、ニューロンなどの特定の細胞におけるアミロイド線維化のモニタリングおよび定量化を可能にする蛍光寿命顕微鏡(FLIM)のプロトコルを提示するPN.FLIMは、フルオロフォアの発現レベルとは無関係であり、さらなる染色や漂白を行うことなく凝集プロセスの分析を可能にします。蛍光体はアミロイド構造の近傍にあるときに消光し、蛍光寿命の減少をもたらす。この焼入れはアミロイドタンパク質の凝集と直接相関する。FLIMは、異なるアミロイドタンパク質、環境刺激、または生体内の遺伝的背景のフィブリリゼーションプロセスを非侵襲的な方法で比較するために適用できる汎用性の高い技術です。

概要

タンパク質凝集は、老化と病気の両方で起こります。大きいアミロイドまたは非晶質の含物の形成および沈着につながる経路は従いにくく、それらのキネティックは同様に解明に挑戦する。タンパク質は、遺伝性疾患の場合のように、コード配列内の本質的な突然変異のために誤って折り畳まれる可能性があります。タンパク質は、老化の間に起こるように、それらを可溶性に保ち、適切に折り畳まれたプロテオスタシスネットワーク(PN)が損なわれるので、誤って折り畳まれる。PNは、分子シャペロンと分解機械を含み、タンパク質の生物発生、折りたたみ、人身売買、および分解を担当しています^。

C.エレガンスは、その短い寿命、等元性の性質、および遺伝子操作の容易さのために老化と病気を研究するためのモデルとして登場しました。脆弱な組織でヒト疾患を引き起こすタンパク質を発現するいくつかのC.エレガン株トランスジェニック株が作成されました。重要なことに、凝集しやすいタンパク質を含む株の多くは、アミロイド障害の特徴を再現し、大きな含入物の形成を行う。C.エレガンスの透明なボディのおかげで、これらの凝集体は生体内で、非侵襲的かつ非破壊的に²で視覚化することができる。フルオロフォアとの融合で目的のタンパク質(POI)を生成することで、その位置、人身売買、相互作用ネットワーク、および一般的な運命を調査することができます。

我々は、蛍光生涯イメージング顕微鏡(FLIM)を介して、生きているおよび老化したC.エレガンsにおける疾患を引き起こすタンパク質の凝集を監視するプロトコルを提示する。FLIMは、発光スペクトルではなく、蛍光素の寿命に基づく強力な技術です。寿命(τ,τ)は、励起状態から地盤状態に戻るためにフォトンが必要とする平均時間として定義されます。特定の分子の寿命は、時間相関単一光子カウント(TCSPC)の時間領域技術で計算されます。TCSPC-FLIMでは、蛍光減衰機能は、短い高周波レーザーパルスで蛍光関数を励起し、発光子がパルスに関して検出器に到着する時間を測定することによって得られます。サンプルをスキャンする場合、各ピクセルに 3 次元データ配列が作成され、X、Y空間座標におけるフォトンの分布と時間減衰曲線に関する情報が配列に含まれます。したがって、特定のサンプルは、タンパク質の構造、結合、および環境^33、44に関する情報を明らかにする寿命のマップになります。各蛍光タンパク質は、その生理化学的特性に依存する、通常は数ナノ秒(ns)の固有かつ正確に定義された寿命を有する。重要なことに、蛍光体の寿命は、その濃度、蛍光強度、およびイメージング方法論とは無関係である。しかし、生物学的システム内では、pH、温度、イオン濃度、酸素飽和度、および相互作用パートナーなどの環境要因の影響を受ける可能性があります。有効期間は、内部構造の変化や方向にも敏感です。蛍光体をPOIに融合させることで、その寿命が変化し、融合タンパク質の挙動に関する情報が得られます。フルオロフォアがアミロイド構造の抗並列βシートのような密結合環境に包囲または封入されると、非放射的にエネルギーを失い、クエンチ⁵と呼ばれるプロセスである。フルオロフォアの焼入れは、その明らかな寿命の短縮をもたらす。可溶性の場合、タンパク質の寿命は元の、より高い値に近いままになります。対照的に、タンパク質が凝集し始めると、その寿命は必然的に低い値^66、7にシフト^します。したがって、生きているC.エレガンスにおいて異なる年齢で任意のアミロイド形成タンパク質の凝集傾向を監視することが可能になる。

ここでは、異なるポリグルタミン(CAG、Q)ストレッチ(Q40、Q44、およびQ85)を含む融合タンパク質の凝集を分析するプロトコルについて説明します。我々は、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)および単量体赤色蛍光タンパク質(mRFP)などの異なる蛍光性に対してこの技術を均等に適用する方法を示しています。そして、ニューロン、筋肉、および腸を含むC.エレガンスのすべての組織で。さらに、プロテオスタシスの文脈では、FLIMは、分子シャペロンの枯渇時の変化を観察するのに非常に有用なツールです。RNA干渉を介して重要な分子シャペロンの1つであるヒートショックタンパク質1(hsp-1)をノックダウンすると、タンパク質の早期ミスフォールディングが発生します。老化、疾患、またはシャペロン欠損の結果としての凝集負荷の増加は、次いで、蛍光寿命の減少として測定される。

プロトコル

1. C.エレガンスの同期

1. C.エレガンスをアルカリ次亜塩素酸溶液処理を介して、または20°C8で4時間の単純な産⁸卵を介して同期する。
2. 標準的な手順⁹に従ってOP50大腸菌を播種した線虫成長培地(NGM)プレート上で20°Cで線虫を成長させ、維持する。目的の発達段階または日まで線虫を老化する。
   注:このプロトコルでは、若い成人は4日目に画像化され、古い線虫は人生の8日目に画像化されます。

2. 給餌によるシャペロン機械のRNAi媒介ノックダウン

注:熱ショックタンパク質1(hsp-1)シャペロンのノックダウンを行い、対応するRNAiベクターを線虫¹⁰に供給する。hsp-1 RNAiプラスミドは、アリンガーライブラリから得られた(クローンID:F26D10.3)。

1. 50 μg/mL アンピシリンを含むルリア ベルタニ (LB) 培地でhsp-1 RNAi プラスミドを発現する HT115 (DE3)大腸菌を 6 時間から一晩成長させます。
2. イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG;1 mM)とアンピシリン(25 μg/mL)を含む新鮮なNGM寒天プレートを準備し、hsp-1 RNAi細菌で種をまきます。プレートを乾燥させ、室温で1〜3日間誘導します。
3. 同期した卵をsiRNAプレートに置き、孵化させたり、グラビッド線虫を置き、取り除く前に20°Cで4時間卵を産むことを許可します。目的の年齢または段階まで線虫を成長させる。
   注:線虫の第二世代は、ノックダウンのより強い表現型を提示するかもしれません。ここで説明するsiRNAプロトコルと条件は一般的であり、hsp1に適合しています。特定のクローン/遺伝子のsiRNAを介したRNA干渉は、エンドユーザーによって確立および最適化される必要があります。すべてのsiRNAが同じ効率を持っているわけではないので、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)またはウェスタンブロットによる定量化によるノックダウンの有効性をテストすることが推奨されることに注意することが重要です。

3. 顕微鏡スライドの作成

1. イメージングの日に、イメージングスライドを準備します。3%(w/v)の濃度で_ddH2Oでアガロースを溶かし、わずかに冷まします。
2. 1 mL ピペットチップの先端を切り、約200 μLの溶かしたアガロースを取ります。きれいなガラススライドにアガロースをピペットし、すぐに任意の気泡の形成を避け、上に第二のものを置きます。乾かして、上のガラスのスライドをそっと取り除きます。結果は線虫が配置される均一のアガロース表面を有するガラススライドである。
   注: 各スライドは、5~10 線虫の間で画像を作成するために使用されます。スライドは、アガロースが乾燥するのを防ぐために、加湿箱に数時間準備して保存することができます。

4. 顕微鏡スライドへの線虫の取り付け

注: FLIM は線虫を固定化する必要があります。イメージング設定(例えば、顕微鏡、レーザー、検出器)を使用する準備ができたら、このステップを実行します。

1. プラチナワイヤーピックを使用して、希望の年齢の線虫を新鮮なシードなしプレートに置き、余分なOP50細菌を体内から取り除くためにクロールさせます。
2. 麻酔化合物(アジドナトリウムまたはレバミゾール)を準備し、線虫を固定化します。500 mM NaN₃ストックを 4 °C の暗闇の中に保管し、新鮮な ddH₂O で希釈して、最終濃度 250 mM にします。レバミゾールを使用する場合は、20 mMストックを2 mMの作業₂溶液に希釈します。
   注意: アジドナトリウム(NaN₃₎は非常に有毒です。手袋と保護眼鏡を使用し、換気フードの下で作業します。
3. 実体顕微鏡で働き、10μLの麻酔化合物をアガロースパッドに置き、5~10線虫を穏やかに移します。まつげの先端を使用して線虫を分離します。それらを近くに保ちますが、画像取得中に線虫のローカライズを容易にするために触れないようにしてください。
4. 慎重にカバースリップで線虫をオーバーレイします。取り付け後1時間以内に測定を行います。
   注:両方の麻酔薬は最終的にC.エレガンスを殺すでしょう.有効期間のマップは各ピクセルから記録されるため、線虫はイメージング中に完全に不動でなければなりません。x,yパラメータの動きは、同じ励起ピクセルでの寿命の読み取りを防ぎます。

5. FLIMデータの取得

注: このプロトコルでは、フルオロフォアの寿命は時間領域 TCSPC 法を介して取得されます。FLIMは、設定された一定の繰り返し速度でレーザーによって生成される光のパルスを必要とします。繰り返し速度はレーザーの種類によって異なり、ユーザーが知る必要があります。寿命測定は、従来の顕微鏡と一緒に設置された検出器と電子機器によって達成されます。このプロトコルでは、mRFP、CFP、およびYFPの寿命を取得するために、2つの異なる企業(材料表)が提供する検出器とソフトウェアを備えた3つの異なるレーザースキャン共焦点顕微鏡で測定を行います。発光/励起の正しいフィルタが適切に配置されていることを確認し、開始する前にバックグラウンドまたはモニタバックライトを最小限に抑えてください。実験を開始する前に、選択した蛍光素の写真安定性を確立します。フルオロフォアが線虫組織内で短時間で漂白する場合、C.エレガンスにおけるFLIM測定には適さない。

1. FLIM 取得ソフトウェアを開きます。FLIMソフトウェアはまた共焦点顕微鏡の制御を可能にする。タブ/ボタンを探して、検出器の出力を有効にし、[出力を有効にする]を押します。
2. インストゥルメンタルセットアップのタイミング精度を記述する装置応答機能(IRF)を取得します。
   注: この手順は、線虫を取り付ける前に実行することが望ましいです。
   1. 使用可能な場合は、励起/放出フィルタを取り外します。
   2. 目的の上に空のカバースリップを配置し、その表面を見つけます。カバースリップから得られた散乱信号を最低30sで記録します。
      注: 数ナノ秒の寿命のために、取得ソフトウェアは自動的にIRFシフトを推定することができます。IRF の取得は常に推奨されます。
3. ステージ上に取り付けられたC.エレガンスとスライドを置きます。透過モードで10倍の拡大レンズを使用し、スライド上の線虫の位置を局地化します。
4. スライドを取り外し、目的を63倍の拡大レンズに切り替え、必要な浸漬媒体(例えば油)を塗布する。ステージ上のスライドを交換し、線虫をローカライズします。
5. 取得ソフトウェアのピンホール マネージャを見つけ、それを [最大] に開きます。サンプルのスキャンを開始し、目的の領域(頭、上半身など)を選択し、最大投影面に焦点を当てます。
6. ソフトウェアのインターフェイスに存在するレーザーパルスレートと他の 3 つの値を監視します:定率識別器(CFD)、時間から振幅(TAC)、アナログデジタル変換器(ADC)。
   注:レーザーは1 x 10⁸光数の最大ゲートを持っている必要があります。この数値は、レーザーによって供給されるフォトンの最大数を表します。CFDは、検出器によるレーザーパルスを参照して、単一光子パルスの受信に関する情報を提供します。この値は、およそ 1 x 10^{5 にする}必要があります。TAC は、1 つの光子が検出された時刻と次のレーザーパルスを識別します。最後に、ADCはTAC電圧を記憶可能なメモリ信号¹¹に変換する。CFD、TAC、および ADC は、蛍光素によって放出される光子が失われないように、すべて同様の値を持つ必要があります。これらのパラメータを正しく評価すると、正確なライフタイム マップを作成するのに十分なフォトンが収集されます。
7. FLIM ソフトウェアのインターフェイスで、検出されたフォトンの数をプレビューします: ADC 値は 1 x 10⁴と 1 x 10^{5 の}間にする必要があります。必要に応じて、別の平面に焦点を合わせるか、レーザーパワーを増やして、より多くの光子を収集します。
   注: 一般に、1 秒あたりのフォトンの記録数は、レーザーの繰り返し率の 1% を超えないようにしてください。
8. メニューバーで、取得パラメータを設定するタブを選択します。スキャン同期を選択して、単一のフォトン検出を許可します。
9. 取得を固定時間またはフォトン数に設定します。たとえば、2 分間のライフタイム 減衰曲線を取得するか、単一のピクセルがフォトン数 2,000 個の単一イベントに達するまでの間に取得します。[開始]を押して取得を開始します。
   注:異なる蛍光色素は異なる励起および放出レーザーおよびフィルターを必要とする。サンプルの明るさに応じて、レーザーパワーも調整することができ、寿命を妨げない。これらのプロトコルは、次の励起/放出設定を使用します: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm.ex800/em440 nmを用いたCFP測定にはパルス式の2つの光子レーザーを用いた。FLIM マップの取得に必要な時間とフォトン数は、各設定と実験目的に対して経験的に確立する必要があります。

6. FLIMfit ソフトウェアを用いた FLIM データの解析

メモ:インペリアル・カレッジ・ロンドン¹²で開発されたFLIMfitソフトウェアツールを使用してデータ分析を実行します(図1を参照)。

1. ソフトウェアを開き、ファイルを介してFLIMデータファイルをインポート|FLIM データの読み込み異なるセッションで、異なる生物学的反復から得られた場合でも、1つの条件からすべてのサンプルをロードします。
2. 必要に応じて、セグメント化を介して任意の FLIM 画像から単一の線虫をセグメント化する |セグメンテーション マネージャトリミング ツールを目的の領域の周囲にドラッグして、ハイライト表示します。完了したら、[OK] を押します。
   注: すべての画像に対してセグメンテーションを行う必要があります。
3. C. エレガンスの強度ベースのイメージが表示される小さな領域を選択します (図 1、矢印 1)。その領域の減衰曲線は、インタフェースの右側にある大きな減衰ウィンドウに表示されます (図 1、矢印 2)。
   注: 減衰は、直線的または対数的に表示できます。
4. 手順 6.5 ~ 6.8 で説明されているように、ソフトウェアのアルゴリズムを介して有効期間を推定するための正しいパラメータを設定します。
5. [データ] タブ (図 1、矢印 3) で次の値を選択します。
   1. 任意の[統合された最小値] を設定して、薄暗すぎて適切なピクセルを除外します。C.エレガンスサンプルに応じて、この値は40〜300から変化します。満足できるプレビューが得られるまで、異なる値を入力します。
   2. FLIM 信号をこれらの値に制限するには、時間最小と時間の最大値を選択します。このしきい値の前後に表示されるすべてのイベントは除外されます。
      注: たとえば、mRFP の分析では、800 ps より前のイベントと 4,000 ps 以降のイベントは除外されました。これらの値は、フルオロフォアの寿命に依存し、エンドユーザーによって決定される必要があります。
   3. 1 のプリセットのカウント/フォトンは変更しないでください。
   4. 取得時に使用するレーザーの繰り返しレートをMHz単位で入力します。
      注:現在のプロトコルでは、異なるレーザーがさまざまな繰り返しレートで利用されていました。CFPの寿命の獲得に使用される2つの光子レーザーは80MHzの繰り返し率を有し、YFPの場合は40MHzでレーザーが繰り返され、mRFPの場合は78.01MHzの値である。これらの値は、分析したサンプルに従ってFLIMfitに入力された。
   5. [Gate Max]値を入力すると、すべての飽和ピクセルが除外されます。
      注: C. elegansの寿命測定では、この値は任意の大きな数値 (たとえば、1 x 10⁸⁾に設定されます。
6. [有効期間] タブで、使用するグローバル フィットを選択します (ピクセル単位のフィットフィットなど)。図 1、矢印 4 を参照してください。
   注:ピクセル方向のフィットは、個々のピクセルに適合する減衰を生成します。イメージに対する継手は、個々の画像のグローバルフィッティングを生成し、画像ごとに 1 つのライフタイム値を表示します。グローバルに適合すると、データセット全体に 1 つのフィッティングが生成されます。すべてのイメージに対して、1 つの有効期間値が提供されます。
7. No 以外のパラメーターは変更しないでください。選択された蛍光減衰が多関数的であり、単一の寿命を超える場合は、Exp選択を行う。
   注:本プロトコルでは、この関数は、二重指数CFPフルオロフォアの寿命を計算するために利用されました。
8. IRF メニューから IRF をアップロードする: IRF |IRF を読み込みます。IRF シフトを推定するには、IRF |見積り IRF シフト.値のセットは、IRFタブに自動的に表示されます。これが確立されたら、このタブの他のパラメータは変更しないでください。
9. すべてのパラメーターを設定したら、[データセットの調整]をクリックします (図 1、矢印 5)。アルゴリズムは、減衰曲線に適合し、各画像の寿命値を確立します。
   注: 青い線でハイライト表示されたフィット感は、すべてのイベントと重なっている必要があります。すべてのイベントが適合に沿って揃えられると、適切な適合が得られます。
10. ソフトウェアのインターフェースの右上のメニュー内にある[パラメータ]タブ(図1、矢印6)をクリックし、[統計:w_mean(加重平均)]を選択し、chi2値が可能な限り1に近いかどうかを確認します。
    注意: 1に近いchi2は、フィットの精度を保証します。選択した画像の有効期間の値は、tau_1として表示されます。
11. 目的の情報をエクスポートする:ファイル |強度イメージ/フィット結果表/画像/ヒストグラムをエクスポートします。有効期間の計算に使用するデータ設定を保存します。データ設定の保存
    注: 使用されるパラメータは、選択したサンプルの後で分析するために保存されます。

7. FLIM データのグラフィカル表現

注: さまざまなサンプルから収集された有効期間は、さまざまな方法で視覚的に表現できます。有効期間の値をナノ秒またはピコ秒で表します。

1. FLIMfit から直接減衰曲線を書き出して、適合の品質と曲線の精度を表示します。
2. フォトン数の頻度とヒストグラムの有効期間値をプロットして、フォトンの分布を表します。
3. 最後に、統計的比較のために、2つ以上のサンプルを比較する場合、散布図棒グラフに寿命値と平均の標準偏差を加えた値を配置します。任意の必要な統計分析を実行します。

結果

このプロトコルは、自然な老化時とストレスを受けたときの両方で、生きているC.エレガンスにおける凝集種の形成を正確に監視する方法を示しています。ポリグルタミンタンパク質を発現するトランスジェニック線虫の4種類の株を40Q、44Q、または85Q反復で選択しました。これらのタンパク質は、異なる組織で合成され、異なるフルオロフォアに融合した。...

ディスカッション

ここで提示されるプロトコルは、C.エレガンスモデルシステムの凝集された種を同定するための顕微鏡ベースの技術を記述する。FLIMは、蛍光寿命の減衰の測定を通じて、凝集した可溶性種の両方が蛍光に融合した存在を正確に特徴付けることができます。融合タンパク質が記録された平均寿命を凝集し始めると、より高い値から低い値¹⁶にシフトします。凝集の傾向?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope